Name: El aislamiento de hepatocitos humanos por una colagenasa perfusión Procedimiento de dos pasos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Aprende el aislamiento de hepatocitos humanos mediante perfusión con colagenasa en dos pasos. Este método produce células viables para estudios de regeneración hepática, farmacocinética y toxicología.

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Este trabajo ha sido posible gracias a la Fundación de tejidos y células humanas de Investigación, lo que hace que los tejidos humanos disponibles para la investigación. Se recibió apoyo financiero para este trabajo por parte del Ministerio Federal de Educación e Investigación (nombre subvención: Virtual Network hígado, el número de concesión: 0.315.759) y Hepacult GmbH. También damos las gracias a los asistentes técnicos del Banco de tejidos Großhadern hospital para la recogida de las muestras de hígado y los asistentes técnicos del Fondo para el Core aislamiento de células para llevar a cabo la perfusión del hígado y el aislamiento de hepatocitos. En particular, nos gustaría dar las gracias a Natalja Löwen para demostrar este procedimiento en el video. Por último, nos gustaría dar las gracias a Natalja Löwen y Edeltraud Hanesch para la creación de las ilustraciones de la figura 1 y las figuras en el resumen esquemático del video.

1. Preparación de la perfusión y el aislamiento Soluciones <ol><li> Preparar las soluciones necesarias para la perfusión de la pieza hígado y el aislamiento de hepatocitos de acuerdo a la Tabla 1. Las soluciones pueden ser almacenadas a 4 ° C hasta su uso. </li><li> Filtro estéril todas las soluciones utilizando un filtro de 0,22 micras. </li><li> Todas las soluciones que entran en contacto con el hígado deben ser estériles. </li></ol> 2. Preparación de equipos y soluciones para infusión <ol><li> Equipamiento para la perfusión de la pieza de hígado debe establecerse como se muestra en la Figura 1. </li><li> El baño de agua se establece a una temperatura apropiada, que es diferente en cada particular, experimental, de tal manera que las soluciones están a la temperatura de 37 ° C cuando llegan a la pieza de hígado. En este caso, el baño de agua se fijó en 41 ° C para calentar las soluciones 1, 2 y 3 y el condensador de vidrio con camisa. Solución 4 debe calentarse hasta37 ° C en un baño de agua separada para su uso para reducir la pérdida de actividad de la colagenasa. </li><li> Poco antes de la perfusión del hígado, encienda el regulador del tanque de gas que contiene 95% O 2/5% CO 2 a gas del aparato de oxigenación (Figura 1E). </li></ol> 3. Perfusión del Hígado <ol><li> Un trozo de hígado con tanto cápsula intacta de Glisson posible e idealmente con superficie sólo 1 de corte se debe obtener de un patólogo para perfusión. </li><li> Coloque esta pieza de hígado en el embudo Büchner que contiene un disco de filtro perforada (Figura 1B). </li><li> El sistema de perfusión debe ser cebado con la solución 1. </li><li> Con un caudal bajo, cánulas de irrigación curvo con punta de oliva se debe insertar en los vasos sanguíneos más grandes en la superficie de corte de la pieza de hígado. Cuando la sangre limpia las del hígado, el tejido se vuelve más claro en áreas con buena perfusión. El número de cánulas utilizado para diversos tamañosde hígados se muestra en la Figura 2A. El tamaño relativa elegida debe resultar en un ajuste cómodo que sostendrá la cánula en su lugar. Los vasos sanguíneos más pequeños se deben dejar abiertos para el tampón de perfusión para drenar fuera de la pieza de hígado. </li><li> Aumentar la tasa de flujo en la bomba peristáltica a entre 110 a 460 ml / min dependiendo del tamaño del hígado (Figura 2B). Esto se traduce en una tasa media de flujo de 44 ± 16 ml / min por cánula (Figura 2C). La velocidad elegida depende de la pieza de hígado y debe resultar en un plumping ligero de la pieza de hígado. En algunos casos, puede ser necesario para sujetar cerró algunos de los vasos abiertos con pinzas vasculares micro para lograr el ligero voluminizador mencionado anteriormente. Una buena perfusión se puede observar cuando el pedazo de hígado es un color más claro en todo. </li><li> Mantenga la pieza de hígado húmedo durante la perfusión cubriéndola con una gasa empapada en solución salina. </li><li> Perfundir con 1 l de solución 1 para eliminar cualquier remaining sangre en la pieza de hígado. </li><li> Cambiar el fluido de perfusión a la Solución 2 y perfundir durante 10 min. </li><li> Cambie el líquido de perfusión a la Solución 3 y perfundir con 0,5 L. </li><li> Cambiar el fluido de perfusión a la Solución 4, que contiene 0,1-0,15% de la colagenasa (Tabla 2). </li><li> Para este paso, la perfusión debe llevarse a cabo de una manera de recirculación para 9-12 min o hasta que el hígado está lo suficientemente digerido; el tejido hepático debería aparecer a separarse ligeramente debajo de la cápsula de Glisson y sentir ablandado cuando se sondearon con el lado romo de un bisturí. </li></ol> 4. Aislamiento de los hepatocitos <ol><li> Apague la bomba peristáltica y extraiga las cánulas de la pieza de hígado. </li><li> Colocar la pieza de hígado en un plato de cristalización que contiene 100-200 ml de solución 5. </li><li> Retire la cápsula de Glisson con cuidado y suavidad sacudir las células. Si hay regiones que no están bien perfundidos, un bisturí se puede utilizar para cortar a travésestas regiones para liberar las células que contiene. Añadir más Solución 5 según sea necesario durante el proceso. </li><li> Añadir más solución de 5 hasta que se alcanza un volumen final de 500 ml. </li><li> Filtrar la suspensión celular dos veces; primero a través de una malla de 210 micras de nylon seguido de una malla de nylon 70 micras. A continuación, se vierte la suspensión celular en tubos de 200 ml de centrífuga. </li><li> Centrifugar la suspensión celular a 72 g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular suavemente suavemente en 200 ml de solución 5. </li><li> Repita el paso número lavado 4.6 tres veces. En el paso de centrifugación final, volver a suspender las células en una solución de almacenamiento en frío (ver la lista de materiales). Las células deben ser aproximadamente de 2-5 million hepatocitos por mililitro para la evaluación del rendimiento y la viabilidad mediante un ensayo de azul tripán exclusión basada en hemocitómetro. </li><li> Para llevar a cabo un ensayo de exclusión con azul de tripano, añadir 0,1 ml de células diluidas adecuadamente (≈ 2-5 million / ml) a un tubo de microcentrífuga que contiene 0,5 ml de azul de tripano solutien (0,4% de azul de tripano disolvió en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) y 0,4 ml de PBS. Después de mezclar la suspensión de células a fondo, cargar un hemocitómetro con la suspensión y examinar bajo un microscopio a un aumento de 100X. Al examen microscópico, las células muertas se tiñen azul, mientras que las células vivas aparecen sin teñir. Contar el número de células vivas y totales en cada una de las 1 mm 2 cuadrículas marcadas en el hemocitómetro. Viabilidad (%), el rendimiento de las células vivas (millones de hepatocitos por la solución de almacenamiento en frío ml (CSS) o millones de hepatocitos por g de hígado) puede calcularse utilizando las fórmulas siguientes. </li></ol><img alt="Ecuación 1" fo:src="/files/ftp_upload/50615/50615eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50615/50615eq1.jpg" /> Nota: En este caso, el factor de dilución de azul de tripano es 10 y el factor de hemocitómetro es 10.000.

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<li>Spotnitz, W. D., Burks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemostats%2C+sealants%2C+and+adhesives+III%3A+a+new+update+as+well+as+cost+and+regulatory+considerations+for+components+of+the+surgical+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox.</a> Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).</li>
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</ol>

La optimización de este protocolo fue parcialmente financiado por una subvención del Hepacult GmbH. Dr. Wolfgang Thasler es uno de los fundadores de Hepacult GmbH y sigue siendo uno de los miembros de la junta directiva de esta empresa. El empleo de Maresa Demmel es parcialmente por Hepacult. Maria Hauner es empleado por Hepacult GmbH. Hepacult es un spin-off de la firma biotecnológica de la Universidad, que ofrece los hepatocitos humanos con el consentimiento y el libre acceso con fines de investigación.

Este protocolo da como resultado el aislamiento de hepatocitos humanos con una alta viabilidad y pureza. Con el fin de alcanzar estos resultados, es importante comenzar con una pieza adecuada de hígado. El trozo de hígado debe tener la cápsula de Glisson intacta en todas las superficies excepto por 1 superficie de corte. Otro factor importante es el lote particular de colagenasa utilizado, como diferentes lotes pueden dar lugar a marcadas diferencias en viabilidades de los hepatocitos después de la digestión 11.</s...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/50615/isolation-human-hepatocytes-two-step-collagenase-perfusion">Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure </a>
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EGTA&#160;</td>
			<td>0.1mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EGTA&#160;</td>
			<td>1mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>0.5&#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>5mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure.
The Final Concentration of EGTA in Solution 2 and the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate in solutions 3 and 4 have been updated in Table 1.

Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Una suspensión de células de hígado puede prepararse a partir del hígado por métodos mecánicos o enzimáticos. Los métodos mecánicos utilizados para preparar las células del hígado enteros incluyen obligar al hígado a través de una gasa 2, agitando un trozo de hígado con perlas de vidrio en un agitador de Kahn 3, utilizando homogeneizadores de vidrio con morteros sueltas 4,5 etc Con los años, los métodos mecánicos han caído en favor debido a los daños a las membranas celulares y la pérdida de función de los hepatocitos aislados 6,7. En consecuencia, el uso de un método enzimático es actualmente el principal método para el aislamiento de hepatocitos. Aislamiento de hepatocitos utilizando un método enzimático mejoró notablemente cuando Berry y Friend 8 perfundidos colagenasa y hialuronidasa a través del hígado a través de la vena porta en ratas. Este proceso utiliza la perfusión de la vasculatura para permitir que las enzimas entran en estrecho contacto con la mayoría de las células, conduciendo aun aumento de 6 veces en el rendimiento de hepatocitos 8. Además, este método produjo células que conservan su integridad estructural, prácticamente sin transformación del retículo endoplásmico en vesículas aisladas y ningún daño mitocondrial 8. Este método se modificó por Seglen 1, que fue pionero en un procedimiento de perfusión en dos etapas para el aislamiento de células del hígado. En este procedimiento, el hígado de la rata se perfunde con un tampón de Ca2 + libre seguido de la perfusión con un tampón de colagenasa que contiene Ca 2 + 1. La eliminación de Ca 2 + en la primera etapa ayuda a romper los desmosomas, mientras que se requiere la adición de Ca 2 + en el segundo paso para la actividad de la colagenasa óptimo 1,9. Dado que el trabajo publicado descrito anteriormente se ha realizado en ratas, este artículo tiene como objetivo demostrar un procedimiento modificado que se puede utilizar para el aislamiento de hepatocitos con alta viabilidad de zumbidoun hígados. El uso de hepatocitos humanos sigue siendo importante para la investigación traslacional y para la validación de los experimentos con modelos animales. Los pedazos de hígado humano utilizados en este estudio fueron obtenidas con el consentimiento de la gobernanza a través de la Fundación Tejido Humano y la investigación con células, una fundación sin fines de lucro controladas por el Estado 10. Después de un patólogo elimina lo que se requiere para el diagnóstico, pedazos de hígado se recogieron a partir del tejido restante. El tejido seccionado por el patólogo era morfológicamente tejido sano obtenido a partir de los márgenes de resección después de la resección hepática.

<table><tbody><tr><td>Trampa de burbujas</td><td>Ga&szlig; ner Glastechnik</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Condensador con camisa de vidrio</td><td>Ga&szlig; ner Glastechnik</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>41 &deg; C Baño de agua</td><td>Julabo</td><td>35723-H24/EG</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>37 y s&deg; C Baño de agua</td><td>GFL</td><td>1083</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cilindro de gas comprimido (95 % O2/5 % CO2)</td><td>Linde</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo permeable al gas</td><td>Neolab</td><td>2-4440</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Ismatec</td><td>IP65</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pluma de bisturí</td><td></td><td>320010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Omnilab</td><td>5171014</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Matraces cónicos 1 L</td><td>Schott Duran</td><td>2121654</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Matraces cónicos 5 L</td><td>Schott Duran</td><td>2121673</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vasos de precipitados</td><td>Schott Duran</td><td>2110654</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 200 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352075</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Plato de cristalización</td><td>Omnilab</td><td>5144063</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cánulas de irrigación curvas con puntas esféricas</td><td>Ernst Kratz GmbH</td><td>1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinzas microvasculares</td><td>Ernst Kratz GmbH</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>B&uuml; embudo chner</td><td>Carl Roth</td><td>HT38.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Malla de nylon 210 &mu; m</td><td>Neolab</td><td>4-1413</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Malla de nylon 70 &mu; m</td><td>Neolab</td><td>4-1419</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0,22 y mu; m filtros estériles</td><td>Peske</td><td>99505</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Botellas de 500 ml Schott</td><td>Duran</td><td>2180144</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Botellas de 1 L</td><td>Schott Duran</td><td>2180154</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Peske</td><td>06-0001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120,086</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cubitera</td><td>Neolab</td><td>1508454</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetas estériles Pasteur</td><td>Marca</td><td>747715</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Llenadora de pipetas motorizada (Pipette boy acu)</td><td>Integra</td><td>155017</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Flujo laminar</td><td>Kendro</td><td>Hera safe-KS9</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Aspirador (bomba de succión quirúrgica de bajo flujo)</td><td>Atmos</td><td>C361</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Quemador de gas</td><td>de laboratorio Integra</td><td>Fire Boy eco</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bata de laboratorio desechable</td><td>Paperlynen GmbH</td><td>MD0202414</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mascarilla quirúrgica con visera</td><td>Kimberly-Clark</td><td>48247</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>capucha quirúrgica</td><td>Barrier</td><td>42072</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Guantes de látex</td><td>Semper Care</td><td>CE0321</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Colagenasa (Número de lote NB 4G)</td><td>Serva</td><td>17465</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Merck</td><td>2382</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Roth</td><td>9265.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Roth</td><td>9105.3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Serva</td><td>26868</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Albúmina</td><td>Biomol</td><td>01400-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Serva</td><td>22700</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de sodio</td><td>Serva</td><td>30180</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.4% Solución de azul de tripán</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución de almacenamiento en frío</td><td>Hepacult GmbH</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

el aislamiento de hepatocitos humanos por una colagenasa perfusión procedimiento de dos pasos

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

El hígado, un órgano con una capacidad de regeneración excepcional, lleva a cabo una amplia gama de funciones, tales como la desintoxicación, el metabolismo y la homeostasis. Como tal, los hepatocitos son un modelo importante para una gran variedad de preguntas de investigación. En particular, el uso de hepatocitos humanos es especialmente importante en los campos de la farmacocinética, la toxicología, la regeneración del hígado y la investigación de translación. Por lo tanto, este método presenta una versión modificada de un procedimiento de perfusión con colagenasa de dos etapas para aislar los hepatocitos como se ha descrito por Seglen 1. Anteriormente, los hepatocitos han sido aislados por métodos mecánicos. Sin embargo, los métodos enzimáticos han demostrado ser superior como hepatocitos conservan su integridad y función estructural después del aislamiento. Este método que aquí se presenta se adapta el método previamente diseñado para hígados de rata a pedazos de hígado humano y los resultados en un gran rendimiento de hepatocitos con una viabilidad de 77 ± 10%. La principaldiferencia en este procedimiento es el proceso de cannulization de los vasos sanguíneos. Además, el método descrito aquí también se puede aplicar a los hígados de otras especies con tamaños de hígado o de los vasos sanguíneos comparables.

Configuración de perfusión El equipo necesario para la perfusión hepática debe establecerse de acuerdo con la figura 1. Viabilidad y Rentabilidad de hepatocitos aislados de humanos La viabilidad media de hepatocitos humanos aislados fue de 77 ± 10% y el rendimiento promedio de los hepatocitos fue de 13 ± 11 millones hepatocitos / g de hígado, con los valores expresados ​​como medias ± desviación estándar. El número de aisla...

Se describe un procedimiento de perfusión con colagenasa de dos etapas modificado para el aislamiento de hepatocitos humanos. Este método también se puede aplicar a otros hígados de mamíferos. Los hepatocitos aislados están disponibles con un alto rendimiento y la viabilidad, por lo que un modelo adecuado para la investigación científica en áreas como la regeneración hepática, farmacocinética y toxicología.

El aislamiento de hepatocitos humanos por una colagenasa perfusión Procedimiento de dos pasos

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar hepatocitos humanos mediante un procedimiento de perfusión con colagenasa en dos pasos. Esto se logra primero canulando los vasos sanguíneos en un fragmento de hígado con una cánula de irrigación. A continuación, se lleva a cabo la perfusión y digestión del fragmento de hígado utilizando colagenasa.El tercer paso consiste en la eliminación de la cápsula brillante, que libera las células hepáticas disociadas. El paso final es una centrifugación a baja velocidad que aísla los hepatocitos. En última instancia, los hepatocitos pueden identificarse mediante microscopía de contraste de fase o mediante tinción de albúmina usando inmuno citoquímica, determinándose la viabilidad y el rendimiento de los hepatocitos mediante un ensayo de exclusión con azul de triam. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de canulación y digestión son difíciles de aprender. Esto se debe a que la canulación requiere cierta destreza y a que puede ser complicado identificar la finalización de la digestión. Para las personas nuevas en esta técnica, la técnica será demostrada por Natalie Lun, una técnica de mi laboratorio.En esta demostración, utilizaremos un fragmento de hígado de cordero en lugar de uno humano. Prepare el equipo para la perfusión del fragmento de hígado como se indica a continuación: ajuste el baño de agua a una temperatura adecuada para que las soluciones alcancen los 37 grados Celsius al llegar al fragmento de hígado. Una temperatura de 41 grados Celsius es adecuada para las soluciones uno, dos y tres; sin embargo, para la solución cuatro, que utiliza un condensador de vidrio con camisa, la temperatura debe ser de 37 grados Celsius para reducir la pérdida de actividad de la colagenasa. Poco antes de la perfusión, encienda el regulador de gas para el aparato de oxigenación. Desde un patólogo, obtenga un fragmento de hígado que idealmente tenga una cápsula de Glisson mayormente o completamente intacta y una sola superficie de corte.Este trozo de hígado sobre el embudo de Buchner que contiene un disco de filtro perforado; el sistema de perfusión debe ahora cebado con la solución uno utilizando una cánula de irrigación curva con inserto de bajo flujo y puntas de oliva insertadas en los vasos sanguíneos más grandes de la superficie cortada del trozo de hígado. A medida que la sangre es expulsada del hígado, el tejido se aclara en las áreas con buena perfusión. La cantidad de cánulas utilizadas varía según el tamaño del hígado.En general, se deben utilizar entre cuatro y ocho cánulas para hígados cuyo peso varíe desde menos de 20 gramos hasta más de 80 gramos. Seleccione la calibre de la cánula para que tenga un ajuste firme y seguro. Deje abiertos los vasos sanguíneos más pequeños para permitir que el tampón drene desde el tejido.Ahora, aumente el caudal de la bomba peristáltica a entre 110 y 460 mililitros por minuto. Una perfusión adecuada se observa cuando la pieza de hígado presenta un color más claro durante todo el rango de caudal utilizado. Esto depende del tamaño del hígado, utilizando tasas de perfusión más altas para hígados más grandes.En general, una velocidad media de perfusión de 44 mililitros por minuto por cánula es ideal para una variedad de pesos hepáticos diferentes. El caudal elegido debe provocar un ligero aumento de volumen del fragmento de hígado. Mantenga el fragmento de hígado húmedo durante la perfusión cubriéndolo con un trozo de gasa empapada en solución salina.Después de perfundir el tejido con un litro de solución, para eliminar cualquier sangre residual en el fragmento de hígado, cambie el líquido de perfusión a la solución dos y realice la perfusión durante 10 minutos. A continuación, cambie el líquido de perfusión a la solución tres y perfunda con medio litro.Ahora cambie el fluido de perfusión a la solución cuatro, que contiene colagenasa. Realice esta perfusión de manera recirculante durante nueve a doce minutos o hasta que el hígado esté suficientemente digerido. El tejido hepático debe parecer que se desintegra ligeramente bajo la cápsula brillante.El hígado también debe sentirse blando al ser explorado con el lado romo de un escalpelo. Es importante digerir el trozo de hígado durante el tiempo adecuado, ya que una digestión excesiva puede provocar una viabilidad baja de los hepatocitos y una digestión insuficiente puede provocar un rendimiento bajo de hepatocitos. Comience apagando la bomba peristáltica y retirando la cánula del trozo de hígado.Luego, coloque el tejido en un vaso de cristalización que contenga entre 100 y 200 mililitros de la solución cinco. Retire cuidadosamente la cápsula glistening y agite suavemente para liberar las células. Si hay regiones que no están bien perfundidas, se puede utilizar un escalpelo para cortar a través de estas regiones y liberar las células contenidas en su interior.Agregue más solución cinco según sea necesario durante el proceso y, finalmente, lleve el volumen de la solución cinco a 500 mililitros. Ahora filtre la suspensión celular dos veces. Primero, filtre las células a través de una malla de nailon de 210 micrones hacia un matraz cónico de un litro.Luego filtre las células a través de una malla de nailon de 70 micrones hacia un matraz cónico de un litro. Vierta dos volúmenes iguales de la suspensión celular en tubos de centrífuga de 200 mililitros. A continuación, centrifugue la suspensión celular filtrada a 72 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.Aspire el sobrenadante y resuspenda suavemente el pellet celular en aproximadamente 200 mililitros de la solución cinco. Repita la centrifugación y la resuspensión tres veces; tras la centrifugación final, resuspenda las células en solución de almacenamiento frío para obtener una concentración final de dos a cinco millones de hepatocitos por mililitro. Se puede utilizar un ensayo con azul de tripano para medir con precisión el recuento celular utilizando un hemocitómetro.Se muestran aquí hepatocitos teñidos con azul de tripan provenientes de 648 aislamientos. La viabilidad promedio de los hepatocitos humanos aislados fue de 77 ± 10 %. El rendimiento promedio de hepatocitos fue de 13 ± 11 millones de hepatocitos por gramo de hígado mediante inmunofluorescencia. Los hepatocitos aislados que presentaron tinción positiva para albúmina en color verde tuvieron una pureza de 94 ± 1 % para determinar la pureza de los hepatocitos.La tinción por inmunofluorescencia se realizó cuatro veces con cinco réplicas por ensayo. La microscopía de contraste de fase muestra las características morfológicas de los hepatocitos, como su gran tamaño celular y su forma poligonal. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar hepatocitos humanos utilizando un procedimiento de perfusión con colagenasa en dos pasos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El estudio del hígado de las células endoteliales sinusoidales (segundos) se debe realizar con las células primarias procedentes de los animales que no existen líneas celulares. Este método se basa en la digestión del hígado y centrifugación diferencial para la purificación de la SEC para el cultivo posterior y experimentar.

La endocitosis en vivo de hígado seguido por la purificación de las células hepáticas de la perfusión del hígado

Una técnica para aislar fibroblastos portales de hígado de rata se ha descrito. Los hígados se perfundieron y...

El aislamiento de fibroblastos portales rata por<em&gt; In situ</em&gt; Hígado de perfusión

Se describe una técnica para aislar hepatocitos humanos y células hepáticas no parenquimatosas del mismo donante. Los diferentes tipos de células hepáticas constituyen la base para los modelos funcionales de hígado y la ingeniería de tejidos. Este nuevo método tiene como objetivo aislar células hepáticas en un alto rendimiento y viabilidad.

Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas

El objetivo de este protocolo es obtener alta viabilidad y alto rendimiento de hepatocitos y células endoteliales sinusoidales del hígado. Esto se logra por perfundiendo el hígado con una solución de colagenasa tipo IV a través de la vena porta, seguida de centrifugación diferencial para obtener hepatocitos y células endoteliales sinusoidales.

Purificación de hepatocitos y células endoteliales sinusoidales del hígado de ratón de perfusión

Este es un protocolo para aislar las vesículas extracelulares del tejido (EV) del hígado. El protocolo describe un proceso de dos pasos que implica perfusión de colagenasa seguido de ultracentrifugación diferencial para aislar los vehículos eléctricos de tejido hepático.

Aislamiento de las vesículas extracelulares de tejido del hígado

Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento de hepatocitos de ratón de hígados de ratón adultos utilizando una técnica de perfusión de colagenasa modificada. También se describe el cultivo a largo plazo de hepatocitos en un ajuste de sándwich de colágeno 3D, así como la inmunoetiquetado de los componentes citoesqueléticos para estudiar la formación canalicular biliar y su respuesta al tratamiento.

Aislamiento y cultivo de sándwich de colágeno 3D de hepatocitos primarios de ratón para estudiar el papel del citoesqueleto en la formación canalicular de bilis en Vitro

Este protocolo detalla el uso de un catéter intravenoso especial, tubos desechables estériles estandarizados, control de temperatura complementado con monitoreo en tiempo real y un sistema de alarma para el procedimiento de perfusión de colagenasa de dos pasos para mejorar la consistencia en la viabilidad, el rendimiento y la funcionalidad de los hepatocitos primarios aislados de ratas.

Aislamiento de hepatocitos primarios de rata con control de perfusión multiparamétrico

La β oxidación de ácidos grasos es una vía metabólica esencial responsable de generar energía en muchos tipos de células diferentes, incluidos los hepatocitos. Aquí, describimos un método para medir la β oxidación de ácidos grasos en hepatocitos primarios recién aislados utilizando ácido palmítico marcado con 14C.

Medición de la β-oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos de ratón recién aislados

Aquí describimos y demostramos un protocolo para el aislamiento primario de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas (LSEC) del ratón. El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa hepática, la purificación de células no parentales por centrifugación de baja velocidad y la selección de perlas magnéticas CD146. También fenotipo y caracterizamos estos LSEC aislados mediante citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido.

Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

Los hepatocitos cargados de lípidos son inherentes a la regeneración hepática, pero generalmente se pierden con la centrifugación por gradiente de densidad. Aquí, presentamos un protocolo de aislamiento celular optimizado que retiene hepatocitos esteatósicos, produciendo poblaciones representativas de hepatocitos regeneradores después de la hepatectomía parcial en ratones.

Aislamiento de hepatocitos regeneradores después de hepatectomía parcial en ratones

Este protocolo presenta una técnica optimizada de perfusión hepática de colagenasa en dos pasos en un modelo de rata y muestra el uso de hepatocitos aislados para el cultivo in vitro a largo plazo de organoides 3D.

Perfusión hepática de rata y aislamiento primario de hepatocitos: un antiguo procedimiento crucial para el cultivo de organoides 3D de última generación

Aprende el aislamiento de hepatocitos humanos mediante perfusión con colagenasa en dos pasos. Este método produce células viables para estudios de regeneración hepática, farmacocinética y toxicología.

El aislamiento de hepatocitos humanos por una colagenasa perfusión Procedimiento de dos pasos

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