El aislamiento de hepatocitos humanos por una colagenasa perfusión Procedimiento de dos pasos

El objetivo general de este procedimiento es aislar hepatocitos humanos mediante un procedimiento de perfusión con colagenasa en dos pasos. Esto se logra primero canulando los vasos sanguíneos en un fragmento de hígado con una cánula de irrigación. A continuación, se lleva a cabo la perfusión y digestión del fragmento de hígado utilizando colagenasa.

El tercer paso consiste en la eliminación de la cápsula brillante, que libera las células hepáticas disociadas. El paso final es una centrifugación a baja velocidad que aísla los hepatocitos. En última instancia, los hepatocitos pueden identificarse mediante microscopía de contraste de fase o mediante tinción de albúmina usando inmuno citoquímica, determinándose la viabilidad y el rendimiento de los hepatocitos mediante un ensayo de exclusión con azul de triam.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de canulación y digestión son difíciles de aprender. Esto se debe a que la canulación requiere cierta destreza y a que puede ser complicado identificar la finalización de la digestión. Para las personas nuevas en esta técnica, la técnica será demostrada por Natalie Lun, una técnica de mi laboratorio.

En esta demostración, utilizaremos un fragmento de hígado de cordero en lugar de uno humano. Prepare el equipo para la perfusión del fragmento de hígado como se indica a continuación: ajuste el baño de agua a una temperatura adecuada para que las soluciones alcancen los 37 grados Celsius al llegar al fragmento de hígado. Una temperatura de 41 grados Celsius es adecuada para las soluciones uno, dos y tres; sin embargo, para la solución cuatro, que utiliza un condensador de vidrio con camisa, la temperatura debe ser de 37 grados Celsius para reducir la pérdida de actividad de la colagenasa. Poco antes de la perfusión, encienda el regulador de gas para el aparato de oxigenación. Desde un patólogo, obtenga un fragmento de hígado que idealmente tenga una cápsula de Glisson mayormente o completamente intacta y una sola superficie de corte.

Este trozo de hígado sobre el embudo de Buchner que contiene un disco de filtro perforado; el sistema de perfusión debe ahora cebado con la solución uno utilizando una cánula de irrigación curva con inserto de bajo flujo y puntas de oliva insertadas en los vasos sanguíneos más grandes de la superficie cortada del trozo de hígado. A medida que la sangre es expulsada del hígado, el tejido se aclara en las áreas con buena perfusión. La cantidad de cánulas utilizadas varía según el tamaño del hígado.

En general, se deben utilizar entre cuatro y ocho cánulas para hígados cuyo peso varíe desde menos de 20 gramos hasta más de 80 gramos. Seleccione la calibre de la cánula para que tenga un ajuste firme y seguro. Deje abiertos los vasos sanguíneos más pequeños para permitir que el tampón drene desde el tejido.

Ahora, aumente el caudal de la bomba peristáltica a entre 110 y 460 mililitros por minuto. Una perfusión adecuada se observa cuando la pieza de hígado presenta un color más claro durante todo el rango de caudal utilizado. Esto depende del tamaño del hígado, utilizando tasas de perfusión más altas para hígados más grandes.

En general, una velocidad media de perfusión de 44 mililitros por minuto por cánula es ideal para una variedad de pesos hepáticos diferentes. El caudal elegido debe provocar un ligero aumento de volumen del fragmento de hígado. Mantenga el fragmento de hígado húmedo durante la perfusión cubriéndolo con un trozo de gasa empapada en solución salina.

Después de perfundir el tejido con un litro de solución, para eliminar cualquier sangre residual en el fragmento de hígado, cambie el líquido de perfusión a la solución dos y realice la perfusión durante 10 minutos. A continuación, cambie el líquido de perfusión a la solución tres y perfunda con medio litro.

Ahora cambie el fluido de perfusión a la solución cuatro, que contiene colagenasa. Realice esta perfusión de manera recirculante durante nueve a doce minutos o hasta que el hígado esté suficientemente digerido. El tejido hepático debe parecer que se desintegra ligeramente bajo la cápsula brillante.

El hígado también debe sentirse blando al ser explorado con el lado romo de un escalpelo. Es importante digerir el trozo de hígado durante el tiempo adecuado, ya que una digestión excesiva puede provocar una viabilidad baja de los hepatocitos y una digestión insuficiente puede provocar un rendimiento bajo de hepatocitos. Comience apagando la bomba peristáltica y retirando la cánula del trozo de hígado.

Luego, coloque el tejido en un vaso de cristalización que contenga entre 100 y 200 mililitros de la solución cinco. Retire cuidadosamente la cápsula glistening y agite suavemente para liberar las células. Si hay regiones que no están bien perfundidas, se puede utilizar un escalpelo para cortar a través de estas regiones y liberar las células contenidas en su interior.

Agregue más solución cinco según sea necesario durante el proceso y, finalmente, lleve el volumen de la solución cinco a 500 mililitros. Ahora filtre la suspensión celular dos veces. Primero, filtre las células a través de una malla de nailon de 210 micrones hacia un matraz cónico de un litro.

Luego filtre las células a través de una malla de nailon de 70 micrones hacia un matraz cónico de un litro. Vierta dos volúmenes iguales de la suspensión celular en tubos de centrífuga de 200 mililitros. A continuación, centrifugue la suspensión celular filtrada a 72 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Aspire el sobrenadante y resuspenda suavemente el pellet celular en aproximadamente 200 mililitros de la solución cinco. Repita la centrifugación y la resuspensión tres veces; tras la centrifugación final, resuspenda las células en solución de almacenamiento frío para obtener una concentración final de dos a cinco millones de hepatocitos por mililitro. Se puede utilizar un ensayo con azul de tripano para medir con precisión el recuento celular utilizando un hemocitómetro.

Se muestran aquí hepatocitos teñidos con azul de tripan provenientes de 648 aislamientos. La viabilidad promedio de los hepatocitos humanos aislados fue de 77 ± 10 %. El rendimiento promedio de hepatocitos fue de 13 ± 11 millones de hepatocitos por gramo de hígado mediante inmunofluorescencia. Los hepatocitos aislados que presentaron tinción positiva para albúmina en color verde tuvieron una pureza de 94 ± 1 % para determinar la pureza de los hepatocitos.

La tinción por inmunofluorescencia se realizó cuatro veces con cinco réplicas por ensayo. La microscopía de contraste de fase muestra las características morfológicas de los hepatocitos, como su gran tamaño celular y su forma poligonal. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar hepatocitos humanos utilizando un procedimiento de perfusión con colagenasa en dos pasos.