Control cuantitativo y temporal del Microambiente oxígeno en el Islote de un solo nivel

El objetivo general de este procedimiento es aplicar hipoxia intermitente escalada en minutos a islotes pancreáticos a escala micro para investigar los efectos de preacondicionamiento. Esto se logra primero fabricando un dispositivo microfluídico multimodal con una membrana delgada permeable a los gases. El segundo paso consiste en crear un sistema computarizado de modulación de oxígeno.

A continuación, los orificios se cargan cuidadosamente en el dispositivo, y luego se conectan las microfluídica de líquido y de oxígeno. El paso final consiste en coordinar la microscopía con las microfluídica multimodal para visualizar los parámetros de los orificios que cambian durante la modulación del oxígeno. En última instancia, la técnica de orificios con hipoxia intermitente se utiliza para demostrar que la respuesta a la glucosa está claramente deteriorada en condiciones de hipoxia.

Aunque las modulaciones temporales de la hipoxia pueden entrenar a los ocelos para responder con menor deterioro. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el oxígeno disuelto o el uso de una cámara hipóxica es que es precisa. La concentración de oxígeno podría administrarse a los párpados en intervalos de tiempo rápidos y minúsculos, sin estrés cortante provocado por flujos complicados.

También permite el monitoreo en tiempo real con microscopía de piso. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del trasplante de Alli, como definir los deterioros hipóxicos en los sitios de trasplante o los regímenes de acondicionamiento previo para mejorar los resultados del trasplante. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la hipoxia en Alli.

También puede aplicarse a otros tejidos y sistemas, como el sistema nervioso central, tejidos cardíacos, el riñón y otros órganos de trasplante. La demostración en video de este método es fundamental, ya que muchos de los pasos de fabricación del dispositivo y manipulación del ojal resultan difíciles de aprender debido a la naturaleza novedosa e interdisciplinaria de la técnica, pero inherente a los desafíos o familiarización. Comience fabricando la capa superior del dispositivo microfluídico.

Para lograr esto, vierta la mezcla de PDMS con DGA premezclada en una altura de 1,5 milímetros dentro de una placa de Petri vacía y cure a 80 grados Celsius durante dos horas. A continuación, fabrique la capa microfluídica de glucosa con el molde maestro de la cámara de perfusión aplicando mediante centrifugado dos capas de 350 micrones de espesor de SU 8 21 50 para formar una única capa de 700 micrones sobre un oblea de silicio de cuatro pulgadas. Luego, expóngala a luz ultravioleta utilizando la máscara fotolitográfica de la capa microfluídica de glucosa para transferir el patrón de microcanales a la capa de SU 8.

Lave el área no expuesta con el revelador SU ocho. A continuación, vierta la mezcla previa de PDMS sobre el MA hasta una altura de tres milímetros y cure a 80 grados Celsius durante dos horas. Una vez curado, corte la capa microfluídica de glucosa según la forma deseada y utilice un punzón de dos milímetros para formar los puertos de entrada y salida, así como un punzón de ocho milímetros de diámetro para la cámara principal.

A continuación, fabrique la plantilla de micropozos para la inmovilización del párpado mediante recubrimiento por centrifugado de una capa de 100 micrones de espesor de SU 8 2100 sobre un sustrato limpio de silicio de cuatro pulgadas, y luego utilice litografía UV para transferir el patrón de micropozos a esta capa. Enjuague las áreas no expuestas con revelador una vez completada la plantilla de micropozos. Añada dos capas de 100 micrones de PDMS mediante recubrimiento por centrifugado a 900 RPM durante 30 segundos, y luego cure durante 10 minutos a 80 grados Celsius para producir cada capa.

Una vez finalizado, perforar los orificios de entrada y salida con un diámetro de dos milímetros. Por último, fabricar el molde maestro del microcanal de gas girando SU 8 2100 hasta un espesor de 100 micrones, como en la capa anterior, y transferir nuevamente los patrones del microcanal de gas mediante litografía UV. Enjuagar el área no expuesta con revelador.

A continuación, vierta una capa de PDMS de 1,5 milímetros de espesor sobre el molde maestro de microfluídica de gas y cure a 80 grados Celsius durante dos horas. Luego, corte el PDMS con la cuchilla de afeitar según la forma deseada. A continuación, perfore orificios de entrada y salida de dos milímetros de diámetro en la capa de cubierta para alinearlos con las posiciones correspondientes en las otras capas, a fin de unir las múltiples capas entre sí.

Primero, prepárelos limpiando las superficies con cinta adhesiva, exponiéndolas a un arco de corona y luego alineando las capas manualmente en el siguiente orden. Primero, una la membrana a la capa de gas inferior con los micropozos orientados hacia arriba. A continuación, una la capa microfluídica de glucosa encima de la membrana con micropozos.

Finalmente, una la capa de entrada y salida en la parte superior, encapsulando todo el conjunto. Ayude a formar un enlace seguro colocando un peso de un kilogramo encima del conjunto y hornee a 100 grados Celsius durante tres horas. Luego, verifique fugas.

Pruebe el dispositivo cargando agua en la capa acuosa, sumergiendo el dispositivo y haciendo pasar aire a través de la capa gaseosa con la jeringa mientras busca fugas. Finalmente, esterilice los dispositivos libres de fugas haciendo pasar etanol al 70 % a través de la capa acuosa durante uno o dos minutos. Configure los microdispensadores conectando primero los cables de control de los microdispensadores a las unidades controladoras incluidas.

Luego, conecte los controladores a la placa de E/S digital en los puertos que corresponden a sus controles de LabVIEW. A continuación, conecte las fuentes de alimentación de corriente continua de cinco voltios y veinte voltios a sus contactos correspondientes en las unidades de accionamiento y conecte la E/S digital a una computadora portátil para ejecutar los códigos de LabVIEW para el control de gases, tal como se describe en el apéndice del protocolo de texto adjunto. Luego, conecte un microdispensador al nitrógeno y el otro al aire comprimido, ambos conteniendo un 5 % de dióxido de carbono, y ajuste ambos gases a dos PSI. Conecte las salidas de los dispensadores en una unión en T antes de que entren al dispositivo microfluídico.

A continuación, monte el dispositivo sobre la platina calefactada de un microscopio invertido con oxígeno al 0 % y al 21 % conectado al dispositivo. Luego, coloque un sensor de oxígeno de fibra óptica en la salida de fluido del dispositivo para medir el oxígeno disuelto en la salida en tiempo real. A continuación, conecte el dispositivo a una bomba peristáltica e inicie el flujo de agua a través del dispositivo a 250 microlitros por minuto.

Caracterice la respuesta transitoria de la modulación de oxígeno alternando los microdispensadores entre 5 y 21 % de oxígeno. Conecte una bomba peristáltica al dispositivo microfluídico y coloque el tubo sobre una placa calefactora de 37 grados Celsius para calentar el fluido antes de que ingrese al dispositivo microfluídico. Además, conecte el puerto de salida de los microfluídicos de glucosa a un colector de fracciones para comenzar a diseccionar ratones C57 negro seis y aislar los islotes pancreáticos mediante digestión con colagenasa y separación por gradiente de densidad Ficoll, tal como se describe en los siguientes videos disponibles en JoVE, una vez aislados.

Incube los fragmentos oculares en medio RPMI 1640 que contenga 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina y 20 milimolares de HEPES, en placas de Petri durante 24 a 48 horas. Utilice los fragmentos oculares dentro de los dos días siguientes para asegurar resultados consistentes. A continuación, prepare un tampón fresco de Krebs-Ringer bicarbonato según se describe en el protocolo de texto adjunto, con una solución que contenga dos milimolares de glucosa y otra que contenga 14 milimolares de glucosa.

Caliente las soluciones en tubos cónicos de 50 mililitros colocándolos en un baño de agua a 37 grados Celsius. Luego, prepare el tinte para los ocelos aislados añadiendo cinco micromolar de 4:02 AM y DMSO y 2,5 micromolar de RH 1 23 y etanol al 100% a dos mililitros del tampón de Krebs que contiene dos milimolar de glucosa. A continuación, recoja los ocelos con una pipeta de 10 microlitros e incúbelos en el tinte durante 30 minutos a 37 grados Celsius.

Una vez teñidos, cargue aproximadamente 20 orificios en el dispositivo a través de la entrada del microcanal de glucosa. Dirija los orificios hacia la cámara mediante el cebado del tampón desde la salida hacia la entrada. Luego, perfunda los orificios y el tampón durante 10 minutos para eliminar los colorantes en exceso.

Primero, haga pasar un tampón bicarbonato de Krebs ringer de dos milimolar a través del sistema durante cinco minutos para establecer una línea base de pulso normal. Luego, estimule la cámara con el tampón de glucosa de 14 milimolar durante 15 minutos, seguido de un lavado de 15 minutos con el tampón de glucosa de dos milimolar. Durante este proceso, registre la emisión a 510 nanómetros excitando a 340 nanómetros y 380 nanómetros.

Asimismo, registre la emisión a 530 de RH 1 23 excitando el colorante a 480 nanómetros. Para minimizar las perturbaciones convectivas durante la modulación del oxígeno, aplique flujo de tampón durante los pasos de estimulación y lavado, y asegúrese de detener el flujo en los otros pasos durante la prueba. Recoja el efluente de la salida de glucosa a intervalos de un minuto para su uso en análisis adicionales. Mediante el enfoque microfluídico mostrado en este video, es posible regular rápidamente el porcentaje de oxígeno que fluye cerca de la membrana delgada de PDMS utilizando microinyectores computarizados.

Aquí se muestra un ejemplo de esta modulación que varía desde un minuto hasta seis minutos. También es posible proporcionar modulaciones cuantitativas de menos de un minuto del oxígeno entre dos y 8,5 partes por millón, suministrando oxígeno entre el 5 y el 21%. La línea azul muestra el porcentaje de oxígeno suministrado y la verde representa el oxígeno disuelto resultante en partes por millón. Cuando este ciclo se aplica para crear hipoxia intermitente en los orificios, se pueden observar los beneficios del acondicionamiento previo de los orificios frente a la hipoxia, en comparación con un pulso normóxico irregular, al notar la mejora en la relación for después del tratamiento. Los efectos de la hipoxia y de la hipoxia intermitente pueden observarse en el sobrepico y en el amortiguamiento de las oscilaciones de los transitorios de calcio; como se muestra aquí, en azul está la respuesta normóxica.

En rojo se observa la respuesta hipóxica, y la línea verde representa la respuesta hipóxica condicionada. Aquí se muestran las mediciones de calcio, potencial mitocondrial e insulina. Son los resultados de microscopía fluorescente en tiempo real y del ensayo off-chip EISA utilizando el efluente microfluídico del sistema. Conjuntamente, estos datos comienzan a conformar una visión multimodal de la respuesta glucosa-insulina bajo hipoxia transitoria.

Una vez dominada, esta técnica puede completarse en dos días si se realiza correctamente: un día para la fabricación del dispositivo y el aislamiento de las células del párpado, y otro día para los experimentos con el párpado. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar la concentración de oxígeno administrada mediante la medición del gas en el dispositivo después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del flujo fetal y de la microfisiología tisular exploraran cómo la hipoxia y los patrones temporales de oxígeno pueden afectar enfermedades como la diabetes, las cardiovasculares y los trastornos neurológicos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo controlar la modulación de oxígeno, manipular microtejidos y generar mediciones repetibles y significativas de hipoxia tisular utilizando dispositivos microfluídicos multimodales.