Name: Control cuantitativo y temporal del Microambiente oxígeno en el Islote de un solo nivel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Aprende a controlar el oxígeno en islotes pancreáticos mediante un dispositivo microfluídico multimodal con membrana permeable a gases. Este método permite modular la hipoxia intermitente con precisión temporal y monitorear en tiempo real los parámetros celulares.

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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Grants R01 DK091526 (JO), NSF 0852416(DTE) y Chicago Diabetes Project.

1. Preparando los islotes del ratón
<ol>
	<li>Diseccionar ratones C57BL/6 y aislar islotes mediante digestión de colagenasa y separación por gradiente de densidad de Ficoll. (Refiérase a los artículos de JOVE referenciados en2,3).</li>
	<li>Incubar los islotes en medio RPMI-1640 que contenga 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 20 mM de HEPES en placas de Petri (37 °C, 5% de CO2). Después del aislamiento, islotes de cultivo durante 24 horas antes de su uso en experimentos. Utilice los islotes dentro de 1-2 días para garantizar resultados consistentes.</li>
</ol>
2. Creación de la plataforma microfluídica
<ol>
	<li>Generar las geometrías de la microestructura en fotomáscaras de transparencia para cada capa del dispositivo: 1) entrada y salida, 2) capa microfluídica de glucosa con cámara de perifusión (8 mm de diámetro x 3 mm, 150 μl), 3) membrana de 200 μm con micropocillos (500 μm de diámetro, 100 μm de profundidad), y 4) capas microfluídicas de gas.</li>
	<li>Para fabricar la capa de entrada y salida, vierta PDMS premezclado y desgasificado a una altura de 1,5 mm en una placa de Petri en blanco y cure a 80 °C durante 2 horas. Perfore puertos de entrada/salida de 2 mm de diámetro.</li>
	<li>Para fabricar la capa microfluídica de glucosa, haga girar dos capas de 350 μm de SU8-2150 para formar una sola capa de 700 μm en una oblea de silicio de 4 pulgadas.
	<ol>
		<li>Exponga la luz ultravioleta a través de la fotomáscara adecuada para transferir el patrón de microcanales al SU8 después del revelado, produciendo un maestro de 700 μm de altura.</li>
		<li>Vierta PDMS premezclado y desgasificado en este maestro a una altura de 3 mm y cure a 80 °C durante 2 horas. Corte este PDMS para darle forma con una cuchilla de afeitar.</li>
		<li>Perfore los puertos de entrada/salida de 2 mm de diámetro, así como la cámara de 8 mm de diámetro.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para fabricar la membrana de 200 μm con micropocillos, centrifuga SU8-2100 a 100 μm. Aplique la misma litografía UV para transferir patrones de micropocillos a este maestro de 100 μm de altura.
	<ol>
		<li>Haga girar PDMS premezclado y desgasificado en este maestro a 900 rpm durante 30 segundos y cure a 80 °C durante 10 min. Gire una segunda capa encima de la primera utilizando las mismas condiciones, lo que da como resultado una membrana de PDMS de 200 μm que contiene patrones de micropocillos.</li>
		<li>Perfore puertos de entrada/salida de 2 mm de diámetro a través de esta membrana</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para fabricar la capa microfluídica de gas, centrifuga SU8-2100 a 100 μm. Aplique la misma litografía UV para transferir patrones microfluídicos de gas a este maestro de 100 μm de altura.
	<ol>
		<li>Vierta el PDMS premezclado y desgasificado sobre este maestro a una altura de 1,5 mm y cure a 80 °C durante 2 horas. Corte el PDMS para darle forma con una cuchilla de afeitar.</li>
		<li>Perfore puertos de entrada/salida de 2 mm de diámetro a través de esta capa</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para unir las múltiples capas, prepárelas limpiándolas con cinta adhesiva, exponiéndolas al arco de corona y luego alineándolas a mano en el siguiente orden.
	<ol>
		<li>Adhiera la membrana a la capa de gas inferior con los micropocillos hacia arriba.</li>
		<li>Unir la glucosa microfluídica en la parte superior de la membrana del micropocillo.</li>
		<li>Pega la capa de entrada y salida en la parte superior, encapsulando todo el conjunto.</li>
		<li>Refuerce la unión agregando 1 kg de peso encima y hornee a 100 °C durante 3 horas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pruebe las fugas del dispositivo completo cargando agua en la capa acuosa y luego sumergiendo todo el dispositivo bajo el agua. Luego, haga fluir el aire a través de la capa de gas con una jeringa vacía.</li>
	<li>Esterilice los dispositivos sin fugas con etanol al 70% a través de la capa acuosa y luego enjuague con tampón PBS, en el que el dispositivo se almacena a 4 °C hasta su uso.</li>
</ol>
3. Configuración del microdispensador
<ol>
	<li>Obtenga 2 microdispensadores, fuentes de alimentación de 5 V y 20 V CC y una placa de E/S digital para construir la configuración de mezcla y suministro de oxígeno.
	<ol>
		<li>Conecte los cables de control de los microdispensadores a las unidades de controlador incluidas.</li>
		<li>Conecte los controladores a la placa de E/S digital en los puertos correspondientes a los controles de Labview.</li>
		<li>Conecte las fuentes de alimentación de 5 V y 20 V a los contactos correspondientes de las unidades de accionamiento.</li>
		<li>Conecte la E/S digital a una computadora portátil para ejecutar códigos Labview para el control de gas (Apéndice).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Conecte un microdosificador al nitrógeno y otro al aire comprimido, ambos con 5% de CO2. Ajuste ambos gases a 2 psi. Conecte las salidas de los dispensadores en una unión en T antes de ingresar al dispositivo microfluídico.</li>
	<li>Utilizando un dispositivo a prueba de fugas, caracterice la respuesta transitoria de la modulación de oxígeno mediante el ciclo de los microdispensadores entre 5-21% de oxígeno, mientras mide el oxígeno disuelto en el agua con un sensor de oxígeno de fibra óptica (consulte la lista de equipos y los resultados representativos).</li>
</ol>
4. Configuración en la microscopía
<ol>
	<li>Monte el dispositivo en la platina calentada del microscopio invertido.</li>
	<li>Conecte los gases 0% y 21%O2 al dispositivo y calibre con el sensor de oxígeno.</li>
	<li>Conecte el puerto de salida de la microfluídica de glucosa a un colector de fracciones.</li>
	<li>Prepare el tampón de bicarbonato Krebs Ringer (KRB): 129 mM de NaCl, 5 mM de NaHCO3, 4,7 mM de KCl, 1,2 mM de KH2PO4, 1 mM de CaCl2,2H 2O, 1,2 mM de MgSO,4,7H 2O, 10 mM de HEPES pH 7,35-7,40, 2 mM de glucosa basal y 5% de FBS.</li>
	<li>Preparar dos soluciones tampón que contengan 2 mM y 14 mM de glucosa respectivamente en tubos cónicos de 50 ml bañados en baño de agua a 37 °C.</li>
	<li>Conecte una bomba peristáltica para extraer el tampón a 250 μl/min en el tubo. Haga fluir el tubo sobre una placa calefactora a 37 °C antes de entrar en el dispositivo microfluídico.</li>
	<li>Para teñir los islotes, agregue Fura-2 AM en DMSO y Rh123 en etanol al 100% a 2 ml de KRB para alcanzar concentraciones finales de colorante de 5 μM y 2,5 μM, respectivamente.</li>
	<li>Recoja los islotes con una pipeta de 10 μl e incube en colorantes durante 30 min a 37 °C.</li>
	<li>Cargue aproximadamente 20 islotes en el dispositivo a través de la entrada de microcanal de glucosa. Dirija los islotes a la cámara cebando el tampón desde la salida hasta la entrada.</li>
	<li>Perfunda los islotes en tampón durante 10 minutos para lavar el exceso de tintes.</li>
</ol>
5. Ejecución de la estimulación simultánea de oxígeno y glucosa
<ol>
	<li>Administre un pulso de estimulación de glucosa con 5 min de línea de base establecido por KRB2, seguido de 15 min de estimulación de 14 mM, luego lave durante 15 min en KRB2.</li>
	<li>Récord de longitud de onda de excitación de 340/380 nm para Fura-2 y emisión de 534 para Rh123.</li>
	<li>Realice mediciones de un pulso normal (14 mM normóxico) antes de cada experimento.</li>
	<li>Para la modulación del oxígeno (hipoxia/hipoxia intermitente), solo aplique flujo tampón durante los pasos de estimulación y lavado y ningún flujo en otros pasos, para minimizar las perturbaciones convectivas.</li>
	<li>Recoja los efluentes de la salida de glucosa a intervalos de 1 minuto para el ensayo de insulina ELISA.</li>
</ol>

<ol><li>Lo, J. F., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Preconditioning+via+Multimodal+Microfluidic+Modulation+of+Intermittent+Hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+I%3A+Digestion+and+Collection+of+Pancreatic+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue.</a> J. Vis. Exp.. , e1125(2009).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+II%3A+Purification+and+Culture+of+Human+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets.</a> J. Vis. Exp.. , e1343(2009).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Transplantation+in+Seven+Patients+with+Type+1+Diabetes+Mellitus+Using+a+Glucocorticoid-Free+Immunosuppressive+Regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen.</a> N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multi-Parametric+Islet+Perifusion+System+within+a+Microfluidic+Perifusion+Device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device.</a> J. Vis. Exp.. , e1649(2010).</li>
<li>Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+for+multimodal+characterization+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets.</a> Lab Chip. 9, 97-106 (2009).</li>
<li>Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Effects+Of+Intermittent+Hypoxia+In+Mice%3A+Steady+Versus+High+Frequency+Applied+Hypoxia+Daily+During+The+Rest+Period%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+-+Regu+Physiol%22%5BJournal%5D)">Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period.</a> AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+changes+in+glucose+and+insulin+regulation+during+intermittent+hypoxia+and+continuous+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia.</a> Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).</li>
<li>Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-specific+functional+studies+in+a+microfluidic+array+of+primary+mammalian+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes.</a> Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).</li>
<li>Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+aerobic+and+anaerobic+bacteria+and+mammalian+cells+with+a+microfluidic+differential+oxygenator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator.</a> Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).</li>
<li>Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+temporal+control+of+the+medium+gas+content+and+acidity+and+on-chip+generation+of+series+of+oxygen+concentrations+for+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures.</a> Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).</li>
<li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly%28dimethylsiloxane%29+bioreactors+during+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).</li>
<li>Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+integrated+microfluidic+platform+for+dynamic+oxygen+sensing+and+delivery+in+a+flowing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium.</a> Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+confined+chemical+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions.</a> Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).</li>
<li>Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+gradients+for+open+well+cellular+cultures+via+microfluidic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates.</a> Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Las múltiples modalidades integradas en esta técnica de hipoxia de islotes presentan varios puntos señalados aquí para la resolución de problemas. Primero, los islotes aislados continúan degradándose y desintegrándose en cultivo debido a las enzimas digestivas de las células acinares. Por lo tanto, estandarizar los experimentos a 1-2 días después del aislamiento de los islotes es fundamental para obtener resultados consistentes. En segundo lugar, el flujo acuoso se detuvo durante la hipoxia y la hipoxia intermitente para...

Hipoxia dinámica es importante en la biología, especialmente para los trasplantes de islotes Hipoxia dinámica es una fisiológico importante, así como parámetro fisiopatológico en muchos tejidos biológicos. Cambio en oxígeno, por ejemplo, es una señal potente del desarrollo en la angiogénesis. Por otra parte, los patrones espaciales y temporales de la hipoxia modulan HIF1-alfa y juegan un papel en enfermedades como el cáncer de páncreas. La hipoxia es también un factor de confusión que afectan los resultados del trasplante de islotes. Recientemente, temporalmente, las oscilaciones de la hipoxia, o hipoxia intermitente (IH) han demostrado beneficios en los islotes &quot;de preacondicionamiento&quot; 1. Sin embargo, los efectos de la hipoxia estáticos y transitorios sobre la fisiología del islote aún no han sido bien entendidas o estudiadas, sobre todo debido a la falta de herramientas adecuadas para controlar el microambiente de los islotes. Los islotes están bien vascularizados in vivo Islotes pancreáticos son 50-400<html> Agregados esferoidales m de células endocrinas, incluyendo las células beta y alfa-células que son responsables de la homeostasis de la glucosa; 56. Cuando los islotes se exponen a la glucosa estimulador en la sangre, la absorción y la glucólisis plomo para la producción de ATP, que se abre de potasio sensibles a ATP (KATP) canales y los resultados en el influjo de calcio que desencadena la exocitosis de los gránulos de insulina. El oxígeno es importante para conducir este proceso en gran medida metabólica y la secreción de insulina está influenciada significativamente por la dinámica del flujo de sangre y el suministro de oxígeno además de los gradientes de glucosa. Islotes realizar fácilmente esta respuesta de la glucosa de la insulina in vivo, ya que son altamente perfundidos en el páncreas, cada uno dentro de una longitud de la célula de un vaso capilar. Sin embargo, la densa red de capilares intraislet se elimina por la colagenasa durante islote aislamiento 2,3. En consecuencia, los suministros de oxígeno y de nutrientes se ven limitados a un perímetro de 100 m debido a las limitaciones de difusión. paso éxito &quot;&gt; Las técnicas actuales han limitado en la recreación microambiente islote Dinámica de oxígeno y de glucosa nativos Recreating de los islotes, clave para el modelado de condiciones fisiológicas y fisiopatológicas, es difícil de lograr con cámaras hipóxicas estándar que requieren flujo elaborada y carecen de un seguimiento continuo de las funciones de los islotes. Por otra parte, las terapias de trasplante para la diabetes Tipo I exponen islotes aislados a la hipoxia en el sistema portal hepático 4 que tiene pO mucho más bajo 2 (&lt;2%, 5-15 mm de Hg) en comparación con el páncreas fisiológica (5,6%, 40 mmHg). Post-trasplante, los injertos de islotes tomar dos semanas o más para ser revascularizado. Se ha demostrado que la exposición hipóxica deteriora la glucosa-insulina mecanismo de acoplamiento de los islotes. Entre los factores de acoplamiento estímulo-secreción, señalización de calcio, potenciales mitocondriales, y la cinética de la insulina puede ser fácilmente monitoreada usando microfluidos. Nuestra técnica de microfluidos anterior demostró esta reseguimiento de al-tiempo con una modulación precisa del microambiente acuosa alrededor solo islote 5,6. Sin embargo, la cuantificación de deterioro hipóxico del islote está obstaculizado por la falta de técnicas de estimulación y la monitorización simultánea. Por lo tanto, la combinación de control de microfluidos de oxígeno y monitoreo de los islotes puede mejorar estudios de hipoxia de los islotes. Microfluídica pueden recrear y modular el microambiente acuosa y oxígeno La técnica estándar para estudios de tejidos y la cultura de hipoxia se ha basado en cámaras de hipoxia. En general, las cámaras de hipoxia proporcionan concentraciones individuales de oxígeno con tiempos de equilibrio en ~ 10-30 min, incompatibles con la hipoxia dinámico minutos en escala. Dos estudios recientes utilizan pequeñas cámaras personalizadas para exposición a la hipoxia intermitente en ratones enteros, con resultados contradictorios sobre la respuesta a la insulina inducida por glucosa 7,8. Tenga en cuenta que en todo el nivel animal, el oxígeno respirado no es directamente tranprogramado para islotes capilar pO 2, debido a los controles en el sistema respiratorio. Además, estos estudios no tienen los niveles de oxígeno estandarizados, ni prevén medidas en tiempo real a nivel de tejido de los islotes. Por otro lado, la microfluídica de oxígeno pueden superar estas limitaciones mediante el control de oxígeno a través de redes de canales de gas. Por otra parte, la microfluídica es compatible con imágenes en vivo durante la modulación de oxígeno, una hazaña en la actualidad no es posible con cámaras hipóxicas estándar. Un número de estos nuevos enfoques de microfluidos utilizar la permeabilidad a los gases de polidimetilsiloxano para disolver las concentraciones de oxígeno en microcanales que fluyen los medios de comunicación sobre las células diana 9-14. Estos dispositivos también se han integrado varias concentraciones discretas de oxígeno, sensores de oxígeno basados ​​en fluorescencia, e incluso la generación química de oxígeno en el chip. Microfluidos basada en solvatación líquidos tienen dificultades para mantener, gradientes continuos estables como iT depende de mezcla convectiva que es sensible a las condiciones de flujo. En comparación, la técnica que usamos aquí se centra en la disminución de la trayectoria de difusión de la entrega de oxígeno. La solvatación de gas y el flujo de cizallamiento se eliminan mediante la difusión de oxígeno directamente a través de una membrana sembrada con células o tejidos de los islotes. Esto elimina los microfluidos adicionales necesarios para el control de solvatación y evita el estrés de cizalla innecesarios a los islotes, que a su vez puede desencadenar la liberación de insulina. Esta plataforma se ha utilizado para demostrar las especies reactivas del oxígeno (ROS) sobre regulación en los extremos tanto hiperóxicas e hipóxicas (2-97% O 2) en el cultivo de células 1,15. Debido a la prestación directa de oxígeno y la eliminación del flujo de tensiones, nuestra plataforma basada en la difusión proporciona la solución óptima de microfluidos para el estudio de la hipoxia de los islotes. Estimulación y monitoreo multimodal Microfluidos basada en la difusión también aporta beneficios adicionales cuando se adapta para el estudio de millas del islotecrophysiology. Mediante el uso de una membrana como barrera de difusión, el líquido puede ser aislado de las modulaciones de oxígeno, lo que permite controles de estimulaciones acuosas de glucosa independientemente de estímulos hipóxicos. Esto crea una estimulación simultánea de sándwich que espacialmente pin-puntos de entrega a los islotes. Además, como el gas es modulada temporalmente a través de microinyectores computarizados, que pueden modular la concentración de oxígeno 21 a 0% digitalmente con el tiempo transitorio menos de 60 seg. Los controles dinámicos de oxígeno y el microambiente de la glucosa en el microscopio permiten un protocolo multimodal en tiempo real que no sería posible o extraordinariamente engorroso el uso de cámaras de hipoxia estándar. El uso de este dispositivo, la señalización de calcio (Fura-AM), los potenciales mitocondriales (rodamina 123), y la cinética de insulina (ELISA) fueron monitorizados para proporcionar una imagen completa de la respuesta dinámica de la glucosa de la insulina en condiciones de hipoxia.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>Reactivo/Material</fuerte></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Laurell</td><td>WS-400</td><td></td></tr><tr><td>SU8</td><td>MicroChem</td><td>SU8-2150/SU8-2100</td><td></td></tr><tr><td>Placa calefactora digital</td><td>PMC Dataplate</td><td>722A</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de curado UV</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>PMDS</td><td>Dow Chemical</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Varita de corona</td><td>ETP</td><td>BD-20AC</td><td></td></tr><tr><td>Cámara</td><td>de vacío Bel-Art</td><td>420220000</td><td></td></tr><tr><td>Microdispensadores</td><td>The Lee Company</td><td>IKTX0322000A</td><td></td></tr> 5 <tr><td>V y 20 V DC</td> Power <td>Radio Shack</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NI USB</td><td>National Instrument</td><td>NI USB-6501</td><td></td></tr><tr><td>Termómetro</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Gilson</td><td>Minipulse 2</td><td></td></tr><tr><td>Sensor de oxígeno Ocean Optics</td><td></td><td>NeoFox</td><td></td></tr><tr><td>Colector de fracciones</td><td>Gilson</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>Pippette</td><td>Fisher Scientific</td><td>Finnpipette II 100&mu; l</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia invertido</td><td>Leica</td><td>DMI 4000B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubos cónicos</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 Sondas moleculares de colorante de fluorescencia</td><td>, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 123 Fluorescence Dye</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Culture</td><td>Media Sigma-Aldrich</td><td>RPMI-1640</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 en tubos de silicona</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 pulgadas x 1/8 pulgadas</td></tr><tr><td>1,5 ml Tubos Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conectores en Y</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>Conectores de jeringa de 1/16 pulgadas y 4 mm</td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>hembra Enchufe Luer 1/16 pulg</td></tr><tr><td>Conectores rectos</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16</td></tr><tr><td>pulg Conector</td><td>acodado Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 pulg</td></tr></tbody></table>

control cuantitativo y temporal del microambiente oxígeno en el islote de un solo nivel

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Oxigenación simultánea y seguimiento de los factores de acoplamiento estímulo-secreción de glucosa en una sola técnica es crítico para el modelado de estados fisiopatológicos de la hipoxia de los islotes, especialmente en entornos de trasplante. Técnicas de cámara de hipoxia estándar no pueden modular ambas estimulaciones al mismo tiempo ni proporcionar supervisión en tiempo real de los factores de acoplamiento estímulo-secreción de glucosa. Para hacer frente a estas dificultades, hemos aplicado una técnica de microfluidos de capas múltiples para integrar tanto acuosas como modulaciones de fase de gas a través de una membrana de difusión. Esto crea un sándwich de estimulación alrededor de los islotes microscaled dentro de la polidimetilsiloxano transparente (PDMS) de dispositivo, que permita el control de los factores de acoplamiento antes mencionados a través de microscopía de fluorescencia. Además, la entrada de gas es controlado por un par de Microdosificador, proporcionando, modulaciones cuantitativos sub-minuto de oxígeno entre 0-21%. Esta hipoxia intermitente se aplica para investigar un nuevo fenómeno de la islat preacondicionamiento. Por otra parte, armado con microscopía multimodal, hemos sido capaces de mirar calcio detallada y dinámica del canal K ATP durante estos eventos de hipoxia. Tenemos la visión de la hipoxia de microfluidos, especialmente esta técnica de fase dual simultáneo, como una herramienta valiosa en el estudio de los islotes, así como muchos tejidos in vivo ex.

Central en esta técnica de hipoxia de islotes es la capacidad de modular la estimulación en las fases acuosa y gaseosa dentro de la misma cámara microfluídica con transitorios a escala de minutos. Figura 1 muestra un resultado representativo de a) las estimulaciones duales y b) las modulaciones rápidas medidas dentro de la cámara de islotes. La modulación acuosa, mostrada mediante la introducción de fluoresceína en la cámara, alcanza el equilibrio tras tres o cuatro minutos de mezcla. Además, el oxígeno ...

El control microfluídico del oxígeno confiere algo más que comodidad y velocidad sobre las cámaras hipóxicas para experimentos biológicos. Especialmente cuando se implementa a través de la difusión a través de una membrana, el oxígeno microfluídico puede proporcionar modulaciones simultáneas de fase líquida y gaseosa a nivel de microescala. Esta técnica permite realizar experimentos dinámicos multiparamétricos críticos para el estudio de la fisiopatología de los islotes.

Control cuantitativo y temporal del Microambiente oxígeno en el Islote de un solo nivel

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

El objetivo general de este procedimiento es aplicar hipoxia intermitente escalada en minutos a islotes pancreáticos a escala micro para investigar los efectos de preacondicionamiento. Esto se logra primero fabricando un dispositivo microfluídico multimodal con una membrana delgada permeable a los gases. El segundo paso consiste en crear un sistema computarizado de modulación de oxígeno.A continuación, los orificios se cargan cuidadosamente en el dispositivo, y luego se conectan las microfluídica de líquido y de oxígeno. El paso final consiste en coordinar la microscopía con las microfluídica multimodal para visualizar los parámetros de los orificios que cambian durante la modulación del oxígeno. En última instancia, la técnica de orificios con hipoxia intermitente se utiliza para demostrar que la respuesta a la glucosa está claramente deteriorada en condiciones de hipoxia.Aunque las modulaciones temporales de la hipoxia pueden entrenar a los ocelos para responder con menor deterioro. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el oxígeno disuelto o el uso de una cámara hipóxica es que es precisa. La concentración de oxígeno podría administrarse a los párpados en intervalos de tiempo rápidos y minúsculos, sin estrés cortante provocado por flujos complicados.También permite el monitoreo en tiempo real con microscopía de piso. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del trasplante de Alli, como definir los deterioros hipóxicos en los sitios de trasplante o los regímenes de acondicionamiento previo para mejorar los resultados del trasplante. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la hipoxia en Alli.También puede aplicarse a otros tejidos y sistemas, como el sistema nervioso central, tejidos cardíacos, el riñón y otros órganos de trasplante. La demostración en video de este método es fundamental, ya que muchos de los pasos de fabricación del dispositivo y manipulación del ojal resultan difíciles de aprender debido a la naturaleza novedosa e interdisciplinaria de la técnica, pero inherente a los desafíos o familiarización. Comience fabricando la capa superior del dispositivo microfluídico.Para lograr esto, vierta la mezcla de PDMS con DGA premezclada en una altura de 1,5 milímetros dentro de una placa de Petri vacía y cure a 80 grados Celsius durante dos horas. A continuación, fabrique la capa microfluídica de glucosa con el molde maestro de la cámara de perfusión aplicando mediante centrifugado dos capas de 350 micrones de espesor de SU 8 21 50 para formar una única capa de 700 micrones sobre un oblea de silicio de cuatro pulgadas. Luego, expóngala a luz ultravioleta utilizando la máscara fotolitográfica de la capa microfluídica de glucosa para transferir el patrón de microcanales a la capa de SU 8.Lave el área no expuesta con el revelador SU ocho. A continuación, vierta la mezcla previa de PDMS sobre el MA hasta una altura de tres milímetros y cure a 80 grados Celsius durante dos horas. Una vez curado, corte la capa microfluídica de glucosa según la forma deseada y utilice un punzón de dos milímetros para formar los puertos de entrada y salida, así como un punzón de ocho milímetros de diámetro para la cámara principal.A continuación, fabrique la plantilla de micropozos para la inmovilización del párpado mediante recubrimiento por centrifugado de una capa de 100 micrones de espesor de SU 8 2100 sobre un sustrato limpio de silicio de cuatro pulgadas, y luego utilice litografía UV para transferir el patrón de micropozos a esta capa. Enjuague las áreas no expuestas con revelador una vez completada la plantilla de micropozos. Añada dos capas de 100 micrones de PDMS mediante recubrimiento por centrifugado a 900 RPM durante 30 segundos, y luego cure durante 10 minutos a 80 grados Celsius para producir cada capa.Una vez finalizado, perforar los orificios de entrada y salida con un diámetro de dos milímetros. Por último, fabricar el molde maestro del microcanal de gas girando SU 8 2100 hasta un espesor de 100 micrones, como en la capa anterior, y transferir nuevamente los patrones del microcanal de gas mediante litografía UV. Enjuagar el área no expuesta con revelador.A continuación, vierta una capa de PDMS de 1,5 milímetros de espesor sobre el molde maestro de microfluídica de gas y cure a 80 grados Celsius durante dos horas. Luego, corte el PDMS con la cuchilla de afeitar según la forma deseada. A continuación, perfore orificios de entrada y salida de dos milímetros de diámetro en la capa de cubierta para alinearlos con las posiciones correspondientes en las otras capas, a fin de unir las múltiples capas entre sí.Primero, prepárelos limpiando las superficies con cinta adhesiva, exponiéndolas a un arco de corona y luego alineando las capas manualmente en el siguiente orden. Primero, una la membrana a la capa de gas inferior con los micropozos orientados hacia arriba. A continuación, una la capa microfluídica de glucosa encima de la membrana con micropozos.Finalmente, una la capa de entrada y salida en la parte superior, encapsulando todo el conjunto. Ayude a formar un enlace seguro colocando un peso de un kilogramo encima del conjunto y hornee a 100 grados Celsius durante tres horas. Luego, verifique fugas.Pruebe el dispositivo cargando agua en la capa acuosa, sumergiendo el dispositivo y haciendo pasar aire a través de la capa gaseosa con la jeringa mientras busca fugas. Finalmente, esterilice los dispositivos libres de fugas haciendo pasar etanol al 70 % a través de la capa acuosa durante uno o dos minutos. Configure los microdispensadores conectando primero los cables de control de los microdispensadores a las unidades controladoras incluidas.Luego, conecte los controladores a la placa de E/S digital en los puertos que corresponden a sus controles de LabVIEW. A continuación, conecte las fuentes de alimentación de corriente continua de cinco voltios y veinte voltios a sus contactos correspondientes en las unidades de accionamiento y conecte la E/S digital a una computadora portátil para ejecutar los códigos de LabVIEW para el control de gases, tal como se describe en el apéndice del protocolo de texto adjunto. Luego, conecte un microdispensador al nitrógeno y el otro al aire comprimido, ambos conteniendo un 5 % de dióxido de carbono, y ajuste ambos gases a dos PSI. Conecte las salidas de los dispensadores en una unión en T antes de que entren al dispositivo microfluídico.A continuación, monte el dispositivo sobre la platina calefactada de un microscopio invertido con oxígeno al 0 % y al 21 % conectado al dispositivo. Luego, coloque un sensor de oxígeno de fibra óptica en la salida de fluido del dispositivo para medir el oxígeno disuelto en la salida en tiempo real. A continuación, conecte el dispositivo a una bomba peristáltica e inicie el flujo de agua a través del dispositivo a 250 microlitros por minuto.Caracterice la respuesta transitoria de la modulación de oxígeno alternando los microdispensadores entre 5 y 21 % de oxígeno. Conecte una bomba peristáltica al dispositivo microfluídico y coloque el tubo sobre una placa calefactora de 37 grados Celsius para calentar el fluido antes de que ingrese al dispositivo microfluídico. Además, conecte el puerto de salida de los microfluídicos de glucosa a un colector de fracciones para comenzar a diseccionar ratones C57 negro seis y aislar los islotes pancreáticos mediante digestión con colagenasa y separación por gradiente de densidad Ficoll, tal como se describe en los siguientes videos disponibles en JoVE, una vez aislados.Incube los fragmentos oculares en medio RPMI 1640 que contenga 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina y 20 milimolares de HEPES, en placas de Petri durante 24 a 48 horas. Utilice los fragmentos oculares dentro de los dos días siguientes para asegurar resultados consistentes. A continuación, prepare un tampón fresco de Krebs-Ringer bicarbonato según se describe en el protocolo de texto adjunto, con una solución que contenga dos milimolares de glucosa y otra que contenga 14 milimolares de glucosa.Caliente las soluciones en tubos cónicos de 50 mililitros colocándolos en un baño de agua a 37 grados Celsius. Luego, prepare el tinte para los ocelos aislados añadiendo cinco micromolar de 4:02 AM y DMSO y 2,5 micromolar de RH 1 23 y etanol al 100% a dos mililitros del tampón de Krebs que contiene dos milimolar de glucosa. A continuación, recoja los ocelos con una pipeta de 10 microlitros e incúbelos en el tinte durante 30 minutos a 37 grados Celsius.Una vez teñidos, cargue aproximadamente 20 orificios en el dispositivo a través de la entrada del microcanal de glucosa. Dirija los orificios hacia la cámara mediante el cebado del tampón desde la salida hacia la entrada. Luego, perfunda los orificios y el tampón durante 10 minutos para eliminar los colorantes en exceso.Primero, haga pasar un tampón bicarbonato de Krebs ringer de dos milimolar a través del sistema durante cinco minutos para establecer una línea base de pulso normal. Luego, estimule la cámara con el tampón de glucosa de 14 milimolar durante 15 minutos, seguido de un lavado de 15 minutos con el tampón de glucosa de dos milimolar. Durante este proceso, registre la emisión a 510 nanómetros excitando a 340 nanómetros y 380 nanómetros.Asimismo, registre la emisión a 530 de RH 1 23 excitando el colorante a 480 nanómetros. Para minimizar las perturbaciones convectivas durante la modulación del oxígeno, aplique flujo de tampón durante los pasos de estimulación y lavado, y asegúrese de detener el flujo en los otros pasos durante la prueba. Recoja el efluente de la salida de glucosa a intervalos de un minuto para su uso en análisis adicionales. Mediante el enfoque microfluídico mostrado en este video, es posible regular rápidamente el porcentaje de oxígeno que fluye cerca de la membrana delgada de PDMS utilizando microinyectores computarizados.Aquí se muestra un ejemplo de esta modulación que varía desde un minuto hasta seis minutos. También es posible proporcionar modulaciones cuantitativas de menos de un minuto del oxígeno entre dos y 8,5 partes por millón, suministrando oxígeno entre el 5 y el 21%. La línea azul muestra el porcentaje de oxígeno suministrado y la verde representa el oxígeno disuelto resultante en partes por millón. Cuando este ciclo se aplica para crear hipoxia intermitente en los orificios, se pueden observar los beneficios del acondicionamiento previo de los orificios frente a la hipoxia, en comparación con un pulso normóxico irregular, al notar la mejora en la relación for después del tratamiento. Los efectos de la hipoxia y de la hipoxia intermitente pueden observarse en el sobrepico y en el amortiguamiento de las oscilaciones de los transitorios de calcio; como se muestra aquí, en azul está la respuesta normóxica.En rojo se observa la respuesta hipóxica, y la línea verde representa la respuesta hipóxica condicionada. Aquí se muestran las mediciones de calcio, potencial mitocondrial e insulina. Son los resultados de microscopía fluorescente en tiempo real y del ensayo off-chip EISA utilizando el efluente microfluídico del sistema. Conjuntamente, estos datos comienzan a conformar una visión multimodal de la respuesta glucosa-insulina bajo hipoxia transitoria.Una vez dominada, esta técnica puede completarse en dos días si se realiza correctamente: un día para la fabricación del dispositivo y el aislamiento de las células del párpado, y otro día para los experimentos con el párpado. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar la concentración de oxígeno administrada mediante la medición del gas en el dispositivo después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del flujo fetal y de la microfisiología tisular exploraran cómo la hipoxia y los patrones temporales de oxígeno pueden afectar enfermedades como la diabetes, las cardiovasculares y los trastornos neurológicos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo controlar la modulación de oxígeno, manipular microtejidos y generar mediciones repetibles y significativas de hipoxia tisular utilizando dispositivos microfluídicos multimodales.

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Research

Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

Un dispositivo de microfluidos perifusion islote fue desarrollado para la evaluación de la dinámica de la secreción de insulina de los islotes y varias imágenes simultáneas de fluorescencia de la entrada de calcio mitocondrial y los posibles cambios.

A multi-paramétricos Islet Sistema Perifusion dentro de un dispositivo de microfluidos Perifusion

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