Control cuantitativo y temporal del Microambiente oxígeno en el Islote de un solo nivel

El objetivo general de este procedimiento es aplicar hipoxia intermitente a escala de minutos a los ojales pancreáticos micro escalados para investigar los efectos del preacondicionamiento. Esto se logra fabricando primero un dispositivo microfluídico multimodal con una membrana delgada permeable al gas. El segundo paso es crear un sistema computarizado de modulación de oxígeno.

A continuación, los ojales se cargan cuidadosamente en el dispositivo y, a continuación, se conectan la microfluídica líquida y de oxígeno. El paso final es coordinar la microscopía con la microfluídica multimodal para visualizar los parámetros de los ojales que se modifican durante la modulación del oxígeno. En última instancia, se utiliza la técnica de hipoxia intermitente con ojales para mostrar que la respuesta de la glucosa está claramente alterada en la hipoxia.

Mientras que las modulaciones temporales de la hipoxia pueden entrenar a los ojales para que respondan con menos deterioro. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el oxígeno disuelto o el uso de una cámara hipóxica, es que es preciso. La concentración de oxígeno podría llegar a los párpados en intervalos de tiempo rápidos y minúsculos sin el estrés de los flujos complicados.

También permite la monitorización en tiempo real con suelo y microscopía. Este máster puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del trasplante Alli, como la definición de las deficiencias hipóxicas en los sitios de trasplante o los regímenes de preacondicionamiento para mejorar los resultados del trasplante. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la hipoxia de Alli.

También se puede aplicar a otros tejidos y sistemas como el sistema nervioso central, los tejidos cardíacos, el riñón y otros órganos trasplantados. La demostración en video de este método es fundamental, ya que muchos de los dispositivos de fabricación y manejo de ojales. Los pasos son difíciles de aprender debido a la novedosa naturaleza interdisciplinaria de la técnica, pero inherentes a la desafiante o familiarizada fabricación de la capa de cobertura del dispositivo microfluídico.

Para lograr esto, vierta DGA PDMS premezclados a una altura de 1,5 milímetros en una placa de Petri en blanco y cúrela a 80 grados Celsius durante dos horas. A continuación, fabrique la capa microfluídica de glucosa con un maestro de cámara de profusión mediante un recubrimiento giratorio de dos capas de 350 micras de espesor de SU 8 21 50 para formar una sola capa de 700 micras en una oblea de silicona de cuatro pulgadas. Luego, expóngalo a la luz ultravioleta usando la fotomáscara de capa microfluídica de glucosa para transferir el patrón de microcanales a la capa SU de ocho capas.

Enjuague el área no expuesta con revelador SU eight. A continuación, vierta los DGA PDMS premezclados en el MA hasta una altura de tres milímetros y cure a 80 grados centígrados durante dos horas. Una vez curado, corte la capa microfluídica de glucosa para darle forma y use un punzón de dos milímetros para formar los puertos de entrada y salida, así como un punzón de ocho milímetros de diámetro para la cámara principal.

A continuación, fabrique el maestro de micropocillos para la inmovilización de párpados mediante el recubrimiento giratorio de una capa de 100 micras de espesor de SU 8 2100 sobre una oblea de silicona limpia de cuatro pulgadas, y luego use litografía UV para transferir el patrón de micropocillos a esta capa. Enjuague las áreas no expuestas con revelador cuando el maestro de micropocillos esté completo. Agregue dos capas de 100 micras de PDMS mediante un recubrimiento giratorio a 900 RPM durante 30 segundos y luego cure durante 10 minutos a 80 grados Celsius para producir cada capa.

Una vez terminado, perfore la entrada de dos milímetros de diámetro en los puertos de salida. Finalmente, fabrique el maestro microfluídico de gas girando SU 8 de 2100 a 100 micras de espesor como en la capa anterior, y transfiera los patrones microfluídicos de gas nuevamente usando litografía UV. Enjuaga el área no expuesta con revelador.

A continuación, vierta una capa de 1,5 milímetros de espesor de PDMS sobre el maestro microfluídico de gas y cure a 80 grados centígrados durante dos horas. A continuación, corte el PDMS para darle forma con la cuchilla de afeitar. A continuación, perfore dos puertos de entrada y salida de diámetro en la capa de cubierta para alinearlos con el lugar donde se encuentran en las otras capas y unir las múltiples capas.

Primero, prepárelos limpiando las superficies con cinta adhesiva, exponiéndolas a un arco de corona y luego alineando las capas a mano en el siguiente orden. Primero, adhiera la membrana a la capa de gas inferior con los micropozos hacia arriba. A continuación, adhiera la capa microfluídica de glucosa sobre la membrana del micropocillo.

Finalmente, pegue la capa de entrada y salida en la parte superior, encapsulando todo el conjunto. Ayude a formar una unión estrecha agregando un peso de un kilogramo en la parte superior del ensamblaje y horneándolo a 100 grados centígrados durante tres horas. Luego fuga.

Pruebe el dispositivo cargando agua en la capa acuosa, sumergiendo el dispositivo y haciendo fluir el aire a través de la capa de gas con la jeringa mientras busca fugas. Finalmente, esterilice los dispositivos sin fugas haciendo pasar etanol al 70% a través de la capa acuosa durante uno o dos minutos. Configure los micro dispensadores conectando primero los cables de control de los micro dispensadores a las unidades de controlador incluidas.

A continuación, conecte los controladores a la placa de E/S digital en los puertos correspondientes a sus controles de vista de laboratorio. A continuación, conecte las fuentes de alimentación de CC de cinco voltios y 20 voltios a sus contactos correspondientes en las unidades de accionamiento y conecte la E/S digital a una computadora portátil para ejecutar códigos de vista de laboratorio para el control de gas como se describe en el apéndice del protocolo de texto adjunto. A continuación, conecte un microdosificador al nitrógeno y el otro al aire comprimido, ambos con un 5% de dióxido de carbono, y ajuste ambos gases a dos PS. Conecto las salidas del dispensador en una unión en T antes de ingresar al dispositivo microfluídico.

A continuación, monte el dispositivo en la platina calentada de un microscopio invertido con 0% y 21% de oxígeno conectado al dispositivo. A continuación, coloque un sensor de oxígeno de fibra óptica en la salida de fluido del dispositivo para medir el oxígeno disuelto dentro de la salida en tiempo real. Luego conecte el dispositivo a una bomba peristáltica y comience a hacer fluir agua a través del dispositivo a 250 microlitros por minuto.

Caracterizar la respuesta transitoria de la modulación del oxígeno mediante el ciclo de los microdosificadores entre el cinco y el 21% de oxígeno. Conecte una bomba peristáltica al dispositivo microfluídico y coloque el tubo sobre una placa calefactora de 37 grados Celsius para calentar el fluido antes de que ingrese al dispositivo microfluídico. Además, conecte el puerto de salida de la microfluídica de glucosa a un colector de fracciones para comenzar a diseccionar C 57 black six ratones y aislar los ojales pancreáticos mediante la digestión de colagenasa y la separación en gradiente de densidad F ccal como se describe en los siguientes videos disponibles de JoVE una vez aislados.

Incubar los ojales en un medio RPMI 1640 que contenga 10% de FBS, 1% de estreptomicina de penicilina y 20 pilas milimolares en placas de Petri durante 24 a 48 horas. Utilice los ojales dentro de los dos días para garantizar resultados consistentes. A continuación, prepare un tampón de bicarbonato Krebs ringer fresco como se describe en el protocolo de texto adjunto con una solución que contenga dos milimolares de glucosa y otra que contenga 14 milimolares de glucosa.

Caliente las soluciones en tubos cónicos de 50 mililitros colocándolos en un baño de agua a 37 grados centígrados. A continuación, prepare la tinción para los ojales aislados añadiendo cinco micromolares de 4:02 AM y DMSO y 2,5 micromolares de RH 1 23 y etanol al 100% a dos mililitros del tampón Krebs que contiene dos milimolares de glucosa. A continuación, coja los ojales con una pipeta de 10 microlitros e incube en la tinción durante 30 minutos a 37 grados centígrados.

Una vez teñido, cargue aproximadamente 20 ojales en el dispositivo a través de la entrada de microcanal de glucosa. Dirija los ojales hacia la cámara cebando el tampón desde la salida hacia la entrada. A continuación, perfunde los ojales y tampona durante 10 minutos para eliminar el exceso de tintes.

En primer lugar, extraiga dos milimolares de tampón de bicarbonato Krebs ringer a través del sistema durante cinco minutos para establecer una línea de base de pulso normal. A continuación, estimule la cámara con el tampón de glucosa de 14 milimolares durante 15 minutos, seguido de un lavado de 15 minutos con el tampón de glucosa de dos milimolares. Durante este proceso, registre los 510 nanómetros para dos emisiones excitando la dieta a 340 nanómetros y 380 nanómetros.

Además, registre la emisión 530 de RH 1 23 excitando el tinte a 480 nanómetros. Para minimizar las perturbaciones convectivas durante la modulación del oxígeno, aplique un flujo tampón durante los pasos de estimulación y lavado, y asegúrese de detener el flujo en los otros pasos durante la prueba. Recoja los efluentes de la salida de glucosa a intervalos de un minuto para usarlos en análisis adicionales utilizando el enfoque microfluídico que se muestra en este video, es posible regular el porcentaje de oxígeno que fluye a través de la delgada membrana de PDMS rápidamente utilizando los microinyectores computarizados.

Este es un ejemplo de esta modulación que va de un minuto a seis minutos. También es posible proporcionar modulaciones cuantitativas sub-minuto de oxígeno entre dos y 8,5 partes por millón suministrando oxígeno entre el cinco y el 21%La línea azul muestra el porcentaje de oxígeno suministrado y la verde es el oxígeno disuelto resultante en partes por millón. Cuando se aplica este ciclo para crear hipoxia intermitente en los ojales, se pueden observar los beneficios del preacondicionamiento de los ojales contra la hipoxia en comparación con el pulso normóxico irregular al observar la mejora de la relación después del tratamiento, los efectos de la hipoxia y la hipoxia intermitente se pueden observar en el sobreimpulso y la amortiguación de la oscilación de los transitorios de calcio, como se muestra aquí en azul es la respuesta normóxica.

En rojo está la respuesta hipóxica, y la línea verde es la respuesta hipóxica condicionada. Aquí se muestra la medida del calcio, el potencial mitocondrial y la insulina. Son los resultados de la microscopía fluorescente en tiempo real y el ensayo EISA fuera de chip utilizando el efluvio microfluídico del sistema juntos, estos comienzan a construir una vista multimodal de la respuesta de la insulina de la glucosa bajo un transitorio hipóxico.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en dos días si se realiza correctamente, un día para la fabricación del dispositivo y para aislar las células del párpado y un día para los experimentos con los párpados en sí. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar la concentración de oxígeno suministrado casando el controlador de gas del dispositivo después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en la microfisiología de la salida fetal y otros tejidos exploraran cómo la hipoxia y los patrones temporales de oxígeno pueden afectar a enfermedades como la diabetes, los trastornos cardiovasculares y neurológicos.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo controlar la modulación del oxígeno, manipular microtejidos y generar mediciones repetibles y significativas de la hipoxia tisular utilizando dispositivos microfluídicos multimodales.