Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

El objetivo general del siguiente experimento es analizar lisados de células individuales mediante ensayos de fluorescencia o inmunoensayos. Esto se logra primero creando un dispositivo microfluídico y recubriendo la cámara interna con anticuerpos. Luego, en una segunda etapa, se inmovilizan células individuales en las trampas y se exponen a diversos reactivos para estimular una respuesta celular.

Una válvula en forma de anillo se cierra rápidamente y el tampón de lisis fluye a través del dispositivo. La válvula en forma de anillo se abre brevemente y las células se lisan dentro de la microcámara, permitiendo que las proteínas liberadas se unan a los anticuerpos en alta concentración debido al pequeño volumen. A continuación, se abre la válvula en forma de anillo.

Se lava la cámara y se introducen los reactivos de detección en la cámara microscópica cerrada. Se monitorea el aumento de la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo mediante un microscopio de fluorescencia; los resultados demuestran la capacidad de este sistema para detectar cuantitativa y confiablemente un analito de interés liberado por células individuales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del análisis de una sola célula.

En particular, permitió investigaciones sistemáticas sobre la respuesta celular a las variaciones en el entorno químico. Podemos observar regulaciones al alza o a la baja de moléculas intracelulares como resultado del estímulo químico. Esta técnica presenta dos ventajas principales.

La primera es que podemos exponer las células inmovilizadas a un entorno químico definido que sea constante o cambie periódicamente. En segundo lugar, podemos realizar análisis altamente sensibles y específicos del estado sin ninguna contaminación cruzada ni pérdida de analitos debida al transporte. Para comenzar, fabrique tres obleas maestras diferentes de SU ocho según se describe en el protocolo de texto adjunto.

Uno se utilizará para crear la capa fluidica, uno para la capa de control y un tercero para el sello de microcontacto. A continuación, fabrique los chips microfluídicos comenzando con la preparación de una mezcla de 10 a 1 de PDMS y un agente de curado. Mezcle ambas partes vigorosamente y desgasifique la solución durante 30 minutos o hasta que la mezcla esté libre de burbujas.

A continuación, coloque la oblea dentro de la capa de control dentro de una placa de Petri y sujétela en la base con cinta adhesiva. Vierta aproximadamente 50 gramos de PDMS encima para crear una capa de cuatro a cinco milímetros de espesor y coloque la oblea durante al menos dos horas en un horno a 80 grados Celsius para asegurar la curación completa del PDMS. Repita el mismo procedimiento para la oblea de impresión por contacto microscópico, pero utilice aproximadamente 20 gramos de PDMS en lugar de 50, obteniendo así una capa de PDMS de cuatro a cinco milímetros de espesor.

Para preparar la capa inferior, aplique por centrifugación una capa de PDMS de 40 micrones de altura sobre el oblea con la capa microfluídica. Utilice una velocidad de rotación de 2000 RPM durante 60 segundos. Cure la capa de PDMS en un horno durante una hora a 80 grados Celsius, una vez que todas las partes hayan curado.

Retire la capa de control del oblea y córtele en trozos con ayuda de la cuchilla de afeitar. Luego, haga orificios para la conexión de presión utilizando una punción de biopsia de un milímetro y cubra los canales con cinta para su almacenamiento. A continuación, retire el PDMS de encima del oblea para impresión por contacto microscópico y prepare sellos del tamaño del área de la cámara.

Guarde las piezas libres de polvo en un cajón hasta su uso. Luego, coloque la oblea recubierta por centrifugación y la capa de control de cuatro a cinco milímetros de espesor en un limpiador de plasma. Exponga las piezas a 18 vatios durante 45 segundos utilizando plasma de oxígeno a 0,75 milibares.

Después del tratamiento con plasma, alinee rápidamente ambas capas bajo un microscopio con una distancia de trabajo grande. Añada algo de PDMS de reserva alrededor de las piezas superiores colocadas para facilitar la eliminación del PDMS del oblea. Luego, coloque la oblea en un horno a 80 grados Celsius durante al menos una hora.

Una vez curado, utilice un escalpelo para retirar cuidadosamente el PDMS del oblea y recortar los microchips, haciendo orificios de perforación para las conexiones fluidicas con una punción de biopsia de 1,5 milímetros. Además, cree un depósito en el microchip cortando la parte superior de una punta de pipeta de 200 microlitros y utilizando algo de PDMS semicurado sobrante. Péguelo en la parte superior.

Luego, cure el chip en el horno a 80 grados Celsius durante al menos una hora. Comience limpiando un portaobjetos de vidrio y las piezas de PDMS. Limpie un portaobjetos de vidrio con jabón.

Lávelo con agua destilada y luego nuevamente con etanol. Seque la lámina utilizando una corriente de nitrógeno. Utilice cinta para eliminar cualquier residuo y partículas de polvo del PDMS.

Luego coloque la pieza de PDMS y el vidrio limpio. Deslice dentro del limpiador de plasma durante 45 segundos a 18 vatios para asegurar una unión firme; coloque el chip sobre una placa calefactora durante cinco minutos tras el tratamiento con plasma. Después del sellado, corte la parte inferior de algunas puntas de pipeta de 200 microlitros. Llénelas con 10 a 15 microlitros de PBS filtrado con 4 % de BSA y colóquelas en las entradas del dispositivo.

Luego, use puntas cortadas con 10 a 15 microlitros de PBS añadidos y colóquelas en los canales de control. A continuación, coloque los chips en la centrífuga y hágales girar a 800 veces la gravedad durante cinco minutos para llenar los canales con líquido. Si queda aire en alguno de los canales, repita este paso hasta que los canales estén completamente llenos.

Incubar la solución de bloqueo durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, lavar la solución de la capa de fluido con PBS a un flujo de 10 microlitros por minuto. Mediante una bomba de jeringa, el dispositivo ya está listo para experimentos celulares para preimprimir la lámina de vidrio para inmunoensayos; incubar sellos de impresión por contacto microscópica de PDMS con BSA biotinilada al 0,5 % en una placa de Petri limpia.

Después de media hora, limpie las estampas cuidadosamente y rápidamente con agua destilada y seque la estampa bajo un flujo de nitrógeno. Una vez seca, coloque rápidamente las estampas sobre un portaobjetos limpio para depositar la albúmina suero bovina biotinilada patrón. No mueva la estampa después de colocarla y verifique que esté en contacto con el portaobjetos de vidrio.

Si es necesario, golpee ligeramente el sello, pero no presione con fuerza. Luego, coloque el sello junto con la parte superior del chip microfluídico en la cámara de plasma y expóngalos a plasma de oxígeno a 18 vatios durante 45 segundos. Después del tratamiento con plasma, retire el sello del portaobjetos de vidrio.

Respirar sobre la superficie hará que el patrón sea visible. Alinee las microcámaras encima de la superficie impresa. Una vez alineadas, coloque el chip sobre una placa calefactora a 50 grados Celsius durante 30 minutos para bloquear la superficie restante, introduzca una solución de BSA al 4 % filtrada estérilmente en PBS en el chip mediante una centrífuga como se mostró anteriormente, incube el microchip durante al menos 30 minutos y luego lave la solución fuera de la capa de fluido con PBS a un flujo de 10 microlitros por minuto.

Utilizando una bomba de jeringa, use el chip directamente o guárdelo hasta dos semanas a cuatro grados centígrados en una caja húmeda. A continuación, cree una superficie de unión completamente funcional introduciendo avadon en PBS en el depósito. Haga fluir la solución para arrastrar el avadon a través de los canales fluidos posteriormente.

Lave el depósito exhaustivamente y pase los canales con PBS. A continuación, añada la proteína G al depósito y hágala pasar a través de los canales. Elimine el exceso de proteína G lavando el depósito y el chip con PBS.

A continuación, agregue el anticuerpo de interés al depósito y hágalo circular a través de los canales. Luego detenga el flujo para permitir la unión y lave los canales con PBS; análogos marcados con fluorescencia pueden utilizarse para verificar la calidad del proceso de impresión antes de introducir las células en los canales. Recolecte las células adheridas, como las células HEK 293 mostradas aquí, utilizando un tampón de disociación libre de enzimas, y luego filtre las células para reducir el número de cúmulos celulares; una vez filtradas, introdúzcalas en una jeringa.

Con una concentración de 300.000 células por mililitro, cargue las células en el chip utilizando flujo directo en la bomba de jeringa durante aproximadamente tres minutos a una velocidad de 10 a 20 microlitros por minuto para células adhesivas como estas, con el fin de evitar la adhesión no específica de las células cuando las trampas estén llenas; luego, cierre las cámaras presurizando la capa superior con tres bares. A continuación, examine las cámaras utilizando un microscopio. Si se observa que muchas células se han adherido no específicamente a la superficie interna de las cámaras, ábralas rápidamente e intente eliminarlas mediante lavado con tampón de disociación celular a un flujo de 10 a 30 microlitros por minuto.

Para el ensayo de glucosa seis fosfato deshidrogenasa o G six PDH, agregue dos milimolares de glucosa, seis fosfato 0,5 milimolares, y una DP 0,5 unidades por mililitro de matrices DIA y 0,3 milimolares de RIN a un tampón de lisis y asegúrese de que esté bien mezclado. Una vez que los canales estén despejados, haga pasar el tampón de lisis de G six PDH a través del chip a un flujo de 30 microlitros por minuto. Mientras el tampón de lisis está fluyendo, abra y cierre rápidamente las cámaras, dejándolas abiertas durante 500 milisegundos para permitir que el lisis entre en la cámara; inmediatamente después del lisis, comience a monitorear la reacción cinética.

En este ejemplo, se puede monitorear un producto fluorescente a lo largo del tiempo. Aquí se muestra una matriz de cámaras que fueron llenadas con colorante alimentario naranja y luego selladas mediante la presurización de la capa de control ubicada sobre las microcámaras. Tras el cierre de las cámaras, se enjuagó colorante alimentario verde a través de los canales para mostrar la hermeticidad de las cámaras.

Cada cámara contiene un volumen de solo 625 picolitros de fluido, lo que mantiene la concentración de moléculas liberadas por las células lisadas lo suficientemente alta para su análisis. Además, las válvulas pueden abrirse y cerrarse de manera que se elimina la contaminación cruzada entre las cámaras. Dentro de estas cámaras, es posible medir analitos tales como la cantidad de lisosomas liberados por una sola célula U 9 37 activada con PMA, mientras cataliza enzimáticamente la producción de una molécula fluorescente dentro de la cámara.

Las líneas verdes representan el cambio en la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo para las cámaras ocupadas por una célula. También se muestra la intensidad de fluorescencia para una cámara sin células, representada por la línea negra punteada. A modo de comparación, este ensayo muestra el efecto de una molécula tóxica sobre la integridad de la membrana mediante la medición de una enzima intracelular, la G seis PDH.

La línea negra representa las muestras de control sin influencia tóxica, mientras que la línea naranja representa las células influenciadas por la toxina mostrada. A continuación se muestra un ejemplo de un inmunoensayo para la proteína intracelular. Los anticuerpos GFP anti GFP se inmovilizaron sobre la superficie y, una vez que las células fueron lisadas, la cinética de unión de las proteínas GFP se visualizó mediante microscopía TURB.

El tiempo 0,1 marca la introducción del tampón de lisis en el tiempo 0. El GFP comienza a acumularse en la superficie, lo que indica que ha ocurrido la lisis celular y que el GFP ha difundido hacia la superficie. La unión del GFP a los anticuerpos finaliza en el tiempo 0,3. En este ejemplo final, el GA DH liberado se une a los anticuerpos de captura en la superficie y luego se añaden los anticuerpos de detección conjugados con HRP.

Una vez que se eliminaron por lavado todos los anticuerpos de detección no unidos, se introdujo el reactivo de detección y la reacción transcurrió durante un período de tiempo. A continuación se muestra una comparación de la cantidad de GA DH, previamente intracelular, en cantidades animales entre células U 9 37 y HEC 2 93, medida mediante este método. Después de ver este video, usted debería tener una buena comprensión de cómo preparar los chips microfluídicos, cómo modificar la superficie para permitir inmunoensayos y, finalmente, cómo utilizar el dispositivo para el análisis de una sola célula.

Este método puede emplearse para ayudar a responder muchas preguntas de investigación en el campo de la biología de célula única.