Name: Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Aprende a analizar lisados de células individuales mediante ensayos de fluorescencia e inmunológicos utilizando un dispositivo microfluídico con cámaras recubiertas de anticuerpos. Este método permite cuantificar proteínas intracelulares con alta sensibilidad.

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Los autores agradecen Tom Robinson para la prueba de lectura del manuscrito, C. Bärtschi y H. Benz para la construcción del sistema de control de presión a medida. También nos gustaría reconocer el uso de las instalaciones de sala limpia primero y el Centro de Microscopía de luz (LMC), tanto en la ETH Zürich. El trabajo fue financiado por Merck Serono y el Consejo Europeo de Investigación (CEI) a través del Programa Marco de séptima (ERC Starting Grant, el proyecto no. 203428, nμLIPIDs).

1. SU-8 de fabricación Maestro Preparar dos moldes maestros para los canales (de fluidos y control, para esquemas y dimensiones ver Figura 2) con el siguiente protocolo pero con diferentes patrones de máscara. El proceso se muestra en la Figura 3a. <ol><li> Comience por calentamiento de una oblea de silicio de 4 pulgadas por 10 min a 180 ° C. Cargue la oblea deshidratado en un spin-revestidor y utilizar el siguiente protocolo para spin-coating SU-8 2015: <ol><li> Haga girar la oblea a 100 rpm durante 20 segundos (tapa abierta de spin-revestidor, dispense SU-8 durante este paso, cierre la tapa después de la dispensación). </li><li> Girar la oblea a 500 rpm durante 10 seg (extendería el resistir sobre toda la oblea). </li><li> Girar la oblea a 1750 rpm durante 30 seg (define la altura de la resistirse a 20 micras). </li></ol></li><li> Eliminar resistir desde el borde de la oblea con acetona (utilizar un hisopo), ya que esto lo contrario se adhieren a la zona de cocción en el siguiente paso. Transfiera la oblea para ahotplate a 95 ° C y el calor durante 4 min. Después de la softbake, exponer el resistirse a través de una fotomáscara pegado a sodalime vidrio en un alineador de la máscara con la luz UV (150 mJ / cm 2, medida a 365 nm). </li><li> Después de la exposición, calentar la oblea de nuevo a 95 ° C durante 5 minutos sobre una placa caliente. Enfriar la oblea a RT y luego sumergirlo en un baño de SU-8 desarrollador durante 4 min. Agitar suavemente para quitar sin impresionar SU-8. Lave la oblea con isopropanol grado de sala limpia y secar con nitrógeno. Revise debajo de un microscopio si el desarrollo se ha realizado correctamente (especialmente las trampas de células). Si las trampas de células están completamente desarrollados, el reflejo de la oblea de silicio debe ser visible. Si es necesario, el desarrollo de la oblea de nuevo durante unos minutos. </li><li> Hornear la oblea en un horno durante 2 horas a 180 ° C para eliminar todo disolvente residual. Compruebe la altura de los canales con un perfilador paso. Si la altura es diferente de la altura deseada, repita este protocolo de comenzar en el paso 1.1 con una nueva oblea ycambiar la velocidad de centrifugado (paso 1.1.3). Finalizar la fabricación del molde maestro por silanizar la oblea con 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorodecilo-dimethylchloro-silano en un desecador durante toda la noche. </li></ol> 2. Fabricación Maestro para la impresión por microcontacto <ol><li> Con el fin de preparar los moldes maestros para la impresión por microcontacto, deshidratar una oblea de silicio durante 10 minutos a 180 ° C. Spin-capa de 1 ml HDMS en esta oblea a 7500 rpm durante 30 segundos (el resistir adhiere mejor a una superficie silanizada). Spin-capa 2 ml de AZ1518 positivo resisten con este protocolo: <ol><li> Dispensación estático de la oponga resistencia a la oblea. </li><li> Haga girar la oblea durante 5 segundos a 500 rpm. </li><li> Haga girar la oblea durante 60 segundos a 4000 rpm. </li></ol></li><li> Después de un segundo softbake 50 a 100 ° C sobre una placa caliente, exponer al resistir a la luz ultravioleta (21 mJ / cm 2 a 365 nm) a través de una fotomáscara y en un alineador de la máscara. Desarrollar el resistir en un baño de AZ 726 de 75 seg. Enjuague la oblea desarrollado con DI-agua y golpe dry con nitrógeno. Eliminar el disolvente residual mediante el calentamiento de la oblea a 115 ° C durante 50 seg. Silaniza la oblea al vacío durante la noche. </li></ol> 3. La fabricación del chip de microfluidos Un diseño de dispositivo de dos capas se utiliza para estos experimentos. Las dos capas se preparan por separado y se unen entre sí, antes de que el chip se une finalmente en un portaobjetos de vidrio (Figura 3b). Este paso se describe la producción de las capas de PDMS y el sello de PDMS para la impresión por microcontacto. <ol><li> Preparar una mezcla 10:01 de PDMS y agente de curado. Prepare unos 80 g de PDMS en total (usando nuestros diseños, esto se traducirá en 10 fichas). Mezclar ambas partes vigorosamente y desgasificar la PDMS hasta que la mezcla esté libre de burbujas (~ 30 min). </li><li> Coloque las tabletas con la capa de control dentro de una caja de Petri con cinta adhesiva en la parte inferior. A continuación, vierta ~ 50 g de PDMS en la parte superior y colocar la oblea durante al menos 2 horas en un horno a 80 º C para asegurar la completacurado de los PDMS. Repita el mismo procedimiento para la oblea de la impresión por microcontacto, para esto se necesita ~ 20 g de PDMS. </li><li> Spin-capa de PDMS en la oblea con la capa de fluido a una velocidad de rotación de 2000 rpm para formar una capa de alta PDMS aproximadamente 40 micras. Curar el PDMS en un horno durante al menos 1 hora a 80 ° C. </li><li> Cuando ambas partes se curan, retire la capa de control de la oblea y cortar en pedazos con una cuchilla de afeitar. Hacer agujeros de conexión de presión mediante el uso de un golpeador biopsia 1 mm. Para el almacenamiento, es conveniente poner un pedazo de cinta adhesiva sobre los canales. </li><li> Para unir las dos capas, tome la oblea spin-revestido y la parte superior y colocarlos en un limpiador de plasma 23. Después del tratamiento de plasma, alinear rápidamente dos partes con un microscopio con una gran distancia de trabajo. Agregue un poco de PDMS piezas de alrededor de las partes superiores colocados. Este paso no es obligatorio, sin embargo, facilita la eliminación de los PDMS de la oblea. Coloque la oblea en un horno a 80 ° C durante al menos 1 hr. </li><li> Utilice un bisturí para retirar con cuidado el PDMS de la oblea y reducir los microchips. Hacer agujeros de acceso para las conexiones de fluidos con un golpeador biopsia 1,5 mm. </li><li> El chip de PDMS está terminado y se puede almacenar durante meses. Opcional: Si el chip se utiliza con un depósito, cortar la parte superior de una punta de pipeta de 200 l y utilizar algunos de repuesto, PDMS semicurados para pegar en la parte superior. Ponga el chip en el horno de nuevo a 80 ° C durante al menos 1 h. </li></ol> 4. Vinculación a la diapositiva de cristal Para utilizar el dispositivo para ensayos enzimáticos directos, el único paso necesario después de la unión es el bloqueo de las superficies. Para este protocolo, proceda a A. Sin embargo, para utilizar el chip de microfluidos para inmunoensayos o ELISA, por favor consulte el protocolo B para restringir los sitios de unión sólo en la placa de vidrio (es decir, para la microscopía TIRF o SPR). Si esta restricción no es importante, consulte a A, pero el uso de conjugados con biotina en el paso 4.3 y continúe con el paso 4.8en el protocolo B para crear una superficie completamente funcional. Antes de realizar el protocolo A y B: Se recomienda para filtrar todas las soluciones de proteínas usadas antes de introducirlos en el chip. Escombros y de proteína agregados pueden de otro modo bloquear trampas de células, reduciendo así el número de cámaras que se pueden utilizar para el análisis. Para este fin, utilizar una unidad de filtro de adsorción no proteico para filtrar todas las soluciones antes de su introducción en los canales. Protocolo A (ensayos enzimáticos) <ol><li> Para finalizar el dispositivo de microfluidos, unir las partes de PDMS en un portaobjetos de vidrio. Para ello, primero limpiar un portaobjetos de vidrio con jabón, agua destilada y etanol. Secar el portaobjetos con una corriente de nitrógeno. Limpie la parte PDMS con cinta scotch. </li><li> Ponga la parte PDMS y el portaobjetos de vidrio limpio en el filtro de plasma de 45 segundos a 18 W. Para asegurar una unión fuerte, poner el chip en un plato caliente (100 ° C) durante 5 min. </li><li> Después de la unión, llene el chip con fLUID. Una manera fácil de conseguir esto es utilizar la fuerza centrífuga. Corte la parte inferior de la punta 200 l pipeta. Para los canales fluídicos, llenarlos con la solución de bloqueo (albúmina de suero bovino (4% w / v) o poli-L-lisina) glicol de polietileno injertado (0,05% w / v) y colocar las puntas en las entradas. Rellene las entradas de la capa de control, ya sea con agua o con una solución isosmótico, por ejemplo, PBS. Coloque el chip en la centrífuga (800 xg) durante 5 min. Los canales deben ser ahora llenos de líquido completamente. Si no, repita este paso. </li><li> Incubar la solución de bloqueo durante al menos 30 min a temperatura ambiente. Lavar la solución de la capa de fluido con PBS a un caudal de 10 l / min utilizando una bomba de jeringa. El dispositivo está ahora listo para experimentos de células. </li></ol> Protocolo B (inmunoensayos) Para obtener una visión completa de la modificación de la superficie del paso 4.7 en adelante, por favor consulte la Tabla 1. <ol start="5"><li> EnPDMS Cubate sellos para impresión por microcontacto con una solución BBSA / BSA (por ejemplo, 1-100). Después de 30 min, limpiar los sellos a fondo con agua destilada y secar el sello bajo una corriente de nitrógeno. Colocar rápidamente los sellos en un portaobjetos de vidrio limpio (Figura 4). </li><li> Exponer el portaobjetos de vidrio con el sello junto con la parte superior del chip microfluídico a plasma de oxígeno durante 45 segundos a la máxima potencia (18 W) en un limpiador de plasma. Después del tratamiento de plasma, quitar el sello y alinear la superficie impresa debajo de las microcámaras del dispositivo. Coloque el chip durante 30 min sobre una placa caliente a 50 ° C. </li><li> Para bloquear la superficie restante, introducir solución esterilizada por filtración de BSA (4% (w / v) en PBS) en el chip con una centrífuga (véase el paso 4.2). Incubar durante 1 hora y lavar la solución de la capa de fluido con PBS (véase el paso 4.3). El chip se puede usar entonces directamente o almacenarse durante hasta 2 semanas a 4 ° C en una caja húmeda. </li><li> Para un surfac de unión completamente funcionalE, introducir avidina (0,025% (w / v) en PBS) en el depósito. Utilice una velocidad de flujo de 5 l / min durante 30 min para retirar la solución de avidina a través de los canales de fluido. Después, enjuague PBS durante 10 min. Enjuagar el depósito a fondo. </li><li> Después, añadir la proteína G (0,0025% (w / v) en PBS) y lavando durante otros 30 min. Lavar con PBS durante otros 10 min después. A continuación, añadir el anticuerpo de interés (0,0001% (w / v) en PBS) durante 10 min. Después de 10 min, detener el flujo durante 15 min para permitir la unión. A continuación, lavar con PBS durante 10 min. </li></ol> 5. Experimentos de células El protocolo está escrito en términos generales debido a la variedad de posibles ensayos. A modo de ejemplo se indican los reactivos necesarios para el ensayo de toxicidad G6PDH. La eficiencia de las células atrapando inicial del dispositivo es de alrededor de 2,5%, es decir, 5 de cada 200 células quedarán atrapados. La ocupación final de las trampas de células depende fuertemente de la línea celular utilizada, el protocolo de suspenderla línea celular y el tiempo, las células se lavan a través del canal. Para células que crecen naturalmente en suspensión (tales como U937), células individuales se pueden encontrar en aproximadamente el 75% de las cámaras después de unos pocos minutos. Las otras cámaras, o bien no están llenos, o ocupadas por dos o más células. En general, la ocupación de una sola célula es más pequeño para líneas de células adherentes. Cuando se utiliza el protocolo de suspensión más bien leve que aquí se presenta, el porcentaje disminuye a aproximadamente 30% (HEK, células MLT). La ocupación de una sola célula puede ser mejorada por tratamiento con tripsina de las células, pero esto también puede alterar los resultados de los experimentos. Dependiendo de la molécula diana, adsorción o absorción de PDMS pueden influir en los resultados. La adsorción se puede reducir mediante el bloqueo de las superficies con BSA o PLL-g-PEG. La absorción es poco probable para la mayoría de las biomoléculas hidrófilas, pero debe ser revisado para (pequeñas) componentes celulares lipofílicas. <ol><li> Preparar las células de acuerdo con el protocolo específico (por ejemplo, </em&gt; drogadicción). Para las células en suspensión, añadir las células directamente en el chip. Para las líneas de células adhesivas, utilizar tampón de disociación libre de enzima para producir una suspensión celular. Filtrar las células antes de su introducción en el chip para reducir la cantidad de grupos de células. </li><li> Cargar las células en el chip utilizando una bomba de jeringa y el flujo hacia delante, en lugar de retirar la suspensión de células. Utilice una velocidad de flujo de 5 l / min para las líneas celulares en suspensión y mayores tasas de flujo de 10-20 l / min para células adhesivas ya para reducir de fijación no específica de las células sobre las paredes del canal. </li><li> Cuando se llenan las trampas, cerrar las cámaras. Si muchas células se adhieren de forma no específica a la superficie, tratar de lavarlos con tampón de disociación celular a una velocidad de flujo de 10-30 l / min. </li></ol> Protocolo A (ensayos enzimáticos) <ol start="4"><li> Retirar tampón de lisis a través del chip. Para este ejemplo, este tampón es un tampón de hipoosmolar con adición de Tween 20 (Tris-HCl 10, 10mM de KCl, 1,5 mM de MgCl 2, 1% (v / v) de Tween 20). Para la lisis, las cámaras de abrir y cerrar rápidamente (es decir, 500 ms para caudales de 10 a 50 l / min 7,21). Para el ensayo de G6PDH, añadir 2 mM de glucosa-6-fosfato, NADP 0,5 mM, 0,5 U / ml de diaforasa y 0,3 mM de resazurina al tampón de lisis. Iniciar el seguimiento de la cinética de reacción inmediatamente después de la lisis. </li></ol> Nota: Elija cualquier tampón que es adecuado para el ensayo, sin embargo, ten en mente que los detergentes fuertes (como Triton, SDS) las células lisan inmediatamente y dará lugar a una pérdida del analito durante la apertura de la cámara. Protocolo B (inmunoensayos) Para una breve descripción de los experimentos de ELISA de células (tasas de flujo, el estado de la cámara, etc), por favor consulte la Tabla 1. <ol start="5"><li> Para ELISA, añadir el reactivo de detección requerido (por ejemplo, anticuerpo secundario, antígeno marcado) directamente al tampón de lisis. La invención añadidas Tween 20 reduce la adsorción no específica. Lisar las células según la etapa 5.4. Incubar la mezcla durante 10-15 minutos para permitir la unión (tiempo de incubación dependiendo del antígeno utilizado y el anticuerpo). </li><li> Conjugados de enzima-anticuerpo que adsorbidos no específicamente a las paredes de los canales pueden conducir a una conversión del reactivo de detección ya en el interior del depósito y los canales. Para reducir los problemas de esta adsorción, lave un inhibidor de la permanente de la enzima de detección utilizado a través del chip durante el tiempo de incubación (cámaras cerradas, antes de añadir el reactivo de detección). Para HRP, utilice HCl 20 mM en agua para inactivar permanentemente las enzimas no específicamente adsorbidos. </li><li> Después del tiempo de incubación, introducir el reactivo de detección (por ejemplo, Amplex Red y peróxido de hidrógeno para HRP) al chip. Abra las cámaras de nuevo en breve para lavar el anticuerpo secundario no unido de distancia y añadir el reactivo de detección. Iniciar el seguimiento de la cinética de reacción inmediatamente. </li><li> Calibración: Inmovilizarel anticuerpo contra la diana de interés. Cerrar cámaras. Preparar diferentes concentraciones de analito en tampón o en lisado de células fuera del chip. Aplicar una concentración en el chip y rápidamente cambiar el volumen interior de las cámaras (500 ms de tiempo de apertura). Este tiempo de apertura es suficientemente corto para garantizar que no se produce la acumulación adicional de lavado analito, y sólo un número específico de moléculas desde el volumen de la micro-cámara se detecta. A partir de la concentración conocida de antígeno dentro de la solución y el volumen de la cámara (625 PL), calcular la cantidad dentro de la cámara. Después, continúe con el paso 5.5 e introducir el resto de detección. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Tecnología microfluídica ha abierto nuevas y fascinantes posibilidades para el análisis de una sola célula. En particular, la posibilidad de atrapar e inmovilizar las células individualmente por herramientas microfluídicos ha permitido estudios sistemáticos a corto y largo plazo sobre las propiedades de una sola célula y la respuesta. Además, la encapsulación de células en microgotas de alta frecuencia, generados en un microchip, ha permitido estudios de secreción de células individuales, que no se pueden realizar con l...

Muchos estudios en el pasado han revelado diferencias entre células dentro de una población de células grandes 1-3, en particular, la señalización de los procesos 4, o las cantidades de biomoléculas intracelulares tales como proteínas, metabolitos, 5,6 y 7,8 cofactores. Estas heterogeneidades se considera que son de importancia fundamental para la adaptación celular y la evolución 9, sino que también juegan un papel clave en la aparición y el tratamiento de enfermedades como el cáncer 10-13. Por lo tanto, los estudios sobre el nivel de una sola célula son de gran interés en la investigación biológica y farmacológica, en particular si estos estudios revelan las diferentes respuestas de las células después del tratamiento con sustancias químicas bioactivas. En los últimos años, muchas plataformas analíticas se han desarrollado que facilitan el análisis de células vivas individuales o la composición química del contenido de la celda. Mientras que células activadas por fluorescencia (FACS) es el oro StAndard para el análisis de muy alto rendimiento de células vivas individuales, el método no puede ser empleado para la cuantificación de compuestos intracelulares o secretadas. La aparición de plataformas de microfluidos ha prometido estrategias analíticas novedosas para el posicionamiento, el tratamiento y la observación de las células individuales. Un hito en la microfluídica se alcanzó con la integración de las válvulas de PDMS flexibles realizadas por Quake y compañeros de trabajo 14,15. Estas válvulas son útiles ya que pueden aislar a las regiones en el chip, por ejemplo, separar dos culturas 16. Además, son especialmente aplicable para el análisis de células individuales y, por tanto, ayudan a reducir los problemas de dilución del analito. La potencia de este enfoque para el análisis de una sola célula se ha demostrado recientemente por Hansen y compañeros de trabajo, que analizaron la expresión de genes de cientos de células individuales en paralelo 17. Cuando el objetivo proteínas y metabolitos, el análisis es muy difícil debido a la falta de un adecuadométodos mplification, el gran número de diferentes compuestos presentes, y sus variaciones en la naturaleza química. Además, se espera que la mayoría de biomoléculas intracelulares a estar presentes en bajo número de copias en el orden de unos pocos diez miles 18, por lo tanto, el método analítico utilizado debe tener una alta sensibilidad. Ensayos más potentes, como los inmunoensayos y los inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA) son difíciles de integrar en los dispositivos de microfluidos, ya que requieren varios pasos de lavado y de incubación, así como la inmovilización de superficie. Debido a estos desafíos, no es sorprendente que sólo unos pocos ejemplos han sido reportados donde las proteínas o metabolitos se cuantificaron en el nivel de una sola célula. Por ejemplo, los estudios sobre la secreción de compuestos fluorescentes han sido reportados 19,20. Recientemente, la aplicación con ELISA se presentó para el análisis de secretadas (no fluorescentes) proteínas a partir de un cultivo de células (THP-1 células) 21 y solo (immune) células 10. Orientación de las proteínas intracelulares, Shi et al. Desarrolló un dispositivo de microfluidos que facilitó la identificación de proteínas intracelulares para el análisis de las vías de señalización en las células tumorales por medio de un inmunoensayo 11. Sin embargo, se determinaron sólo cantidades relativas de las proteínas y no hay amplificación enzimática se utilizan para aumentar la señal para las proteínas de baja abundancia. Recientemente, hemos sido capaces de combinar un microdispositivo captura de una sola célula con ensayos de fluorescencia 8 e inmunoensayos 22 (Figura 1). Las células están atrapados pasivamente en las estructuras de vallas micronizada, que permiten el suministro y el intercambio (rápida) de medio y otros agentes químicos sin ningún movimiento de las células. Una válvula en forma de anillo alrededor de cada trampa permite el aislamiento de la célula en un volumen muy pequeño (&quot;la microcámara&quot;). Esta válvula se acciona inmediatamente después de la introducción de un tampón de lisis celular (hipoosmolar), sena vez que la prevención de moléculas intracelulares o moléculas secretadas a difundir lejos. Lo más importante, debido al pequeño tamaño del volumen (625 PL) se evita gran dilución de las moléculas. Además, puesto que la lisis y análisis se llevan a cabo en en la misma posición en el chip, no hay pérdida de analitos debido al transporte. El diseño de chips descrito aquí tiene 8 filas alternas de 7 ó 8 microcámaras, por un total de 60 microcámaras. Las cámaras son accionados en filas, de manera que se impide la contaminación cruzada a lo largo de una línea. La plataforma se puede utilizar en combinación con ensayos de fluorescencia, así como ensayos inmunológicos (Figura 1D). Para este último, hemos establecido protocolos para la inmovilización de los anticuerpos, que son compatibles con la producción de chips y proceso de montaje. De ahí que la plataforma se abre el camino para ensayos sensibles, fiables y cuantificables a nivel de células individuales. Hasta ahora, se ha utilizado el dispositivo para el análisis de la ienzimas ntracellular y secretadas (cuantificación relativa mediante ensayos enzimáticos), cofactores intracelulares, proteínas y pequeñas moléculas (cuantificación absoluta por ensayos de punto final o ELISA). En lo que sigue, se describe el proceso de fabricación de chips por medio de litografía blanda de múltiples capas y los protocolos para los patrones de los anticuerpos por medio de la impresión por microcontacto y química de superficie. Además, se dan algunos ejemplos de uso de chips y las operaciones.

<table><tbody><tr><td><fuerte>REACTIVOS:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nombre de la empresa de reactivos Número de</td><td></td><td>catálogo</td><td>Comentarios (opcional)</td></tr><tr><td>SU-8 2015</td><td>MicroChem Corp. (Netwon, MA)</td><td>n.a.1H,1H,2H,2H-Perfluorodecil-dimetilclorosilano</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ABCR (Karlsruhe, Alemania)</td><td>AB103608</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &beta;-D-N,N&prime;-hidrato de diacetilquitobiósido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9763</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Alemania)</td><td>100014</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>AppliChem (Axon Lab AG)</td><td>A-2568</td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518</td><td>AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Alemania)</td><td>n.a.AZ</td><td></td></tr> <tr><td>726 developer</td><td>AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Alemania)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-4503</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina, biotina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-8549</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de disociación celular</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Hexametildisilazano (HDMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40215</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Fluka</td><td>84422</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Alemania)</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>MR developer 600</td><td>Microresist technology GmbH (Berlín, Alemania)</td><td>n.a.PBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG injertado</td><td>SuSoS, (D&uuml; bendorf, Suiza)</td><td>n.a.PLL-g-PEG</td><td></td></tr> <tr><td>biotina injertada</td><td>SuSoS, (D&uuml; bendorf, Suiza)</td><td>n.a.Cloruro</td><td></td></tr> <tr><td>de potasio</td><td>Fluka</td><td>60132</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G, biotina</td><td>Sigma Fine Chemicals</td><td>41624</td><td></td></tr><tr><td>Oblea de silicio</td><td>Si-Mat (Kaufering, Alemania)</td><td>n.a.Sylgard</td><td></td></tr> <tr><td>184 Kit de elastómero de silicona (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>39100000</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)-aminometano</td><td>Biorad</td><td></td><td></td>1610716</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biorad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nombre del material</td><td>Número de catálogo</td> de <td>la empresa</td><td>Comentarios (opcional)</td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Filtro de jeringa PES</td><td>TRP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>1/1,5 mm perforadora de biopsia</td><td>Miltex, York PA</td><td>33-31AA/33-31A</td><td></td></tr><tr><td>Cell Trics filter 20 &micro; m</td><td>Partec</td><td>04-004-2325</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sigma 3-18K</td><td>Kuehner</td><td>n.a.Placa</td><td></td></tr> <tr><td>calefactora HP 160 III BM</td><td>Sawatec, Sax, Suiza</td><td>n.a.MA-6</td><td></td></tr> <tr><td>alineador de máscaras</td><td>Karl Suess</td><td>n.a.Microscopio</td><td></td></tr> <tr><td>Multizoom AZ100M</td><td>Nikon Corporation</td><td>n.a.Photomask</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Microlitho, Essex, Reino Unido</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de plasma PDC-32G</td><td>Harrick</td><td>n.a.Recubridor</td><td></td></tr> de <tr><td>centrifugado Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE</td><td>Laurell</td><td>n.a.Módulos</td><td></td></tr> <tr><td>de centrifugado SM 180 BM</td><td>Sawatec, Sax, Suiza</td><td>n.a.Perfilador</td><td></td></tr> de <tr><td>pasos Dektak XT Advanced</td><td>Bruker</td><td>n.a.Bomba</td><td></td></tr> <tr><td>de jeringa neMESYS</td><td>Cetoni</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Se presenta un dispositivo de microfluidos que permite la determinación cuantitativa de biomoléculas intracelulares en múltiples células individuales en paralelo. Para este propósito, las células están atrapados pasivamente en el medio de una microcámara. Tras la activación de la capa de control, la célula se aísla del volumen que rodea en una pequeña cámara. El volumen que rodea a continuación, puede ser intercambiado sin afectar a la célula aislada. Sin embargo, al abrirse corta y cierre de la cámara, la solución en la cámara puede ser sustituido dentro de unos pocos cientos de milisegundos. Debido a la reversibilidad de las cámaras, las células pueden ser expuestos a diferentes soluciones secuencialmente de una manera altamente controlable, por ejemplo, para la incubación, el lavado, y finalmente, la lisis celular. Las microcámaras bien cerrados permiten la retención del lisado, minimizar y controlar la dilución después de la lisis celular. Desde la lisis y el análisis se producen en el mismo lugar, se retiene una alta sensibilidad porque no más lejos dilution o pérdida de los analitos se produce durante el transporte. Por tanto, el diseño microcámara permite el análisis fiable y reproducible de un número muy reducido de copias de moléculas intracelulares (attomoles, zeptomoles) liberadas por las células individuales. Además, muchos microcámaras pueden estar dispuestos en un formato de matriz, permitiendo el análisis de muchas células a la vez, dado que los instrumentos ópticos adecuados se utilizan para el seguimiento. Ya hemos utilizado la plataforma para los estudios de prueba de concepto para analizar las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores y segundos mensajeros en forma cuantificable, ya sea relativa o absoluta.

Nuestra plataforma es capaz de analizar una variedad de intracelular, así como moléculas secretadas presentes en o producidos por células individuales. Aquí, nos gustaría presentar diferentes estudios ejemplo para subrayar la variedad de posibles ensayos. Daremos un ejemplo para una enzima secretada (Figura 5a), así como una enzima intracelular (Figura 5b) y proteína (Figuras 5C y D). Para más ejemplos, como cofactores o pequeñas moléculas, consulte Eye...

En este artículo se presenta un chip de microfluidos para el análisis de células individuales. Permite la cuantificación de las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores, y segundos mensajeros por medio de ensayos fluorescentes o inmunoensayos.

Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

El objetivo general del siguiente experimento es analizar lisados de células individuales mediante ensayos de fluorescencia o inmunoensayos. Esto se logra primero creando un dispositivo microfluídico y recubriendo la cámara interna con anticuerpos. Luego, en una segunda etapa, se inmovilizan células individuales en las trampas y se exponen a diversos reactivos para estimular una respuesta celular.Una válvula en forma de anillo se cierra rápidamente y el tampón de lisis fluye a través del dispositivo. La válvula en forma de anillo se abre brevemente y las células se lisan dentro de la microcámara, permitiendo que las proteínas liberadas se unan a los anticuerpos en alta concentración debido al pequeño volumen. A continuación, se abre la válvula en forma de anillo.Se lava la cámara y se introducen los reactivos de detección en la cámara microscópica cerrada. Se monitorea el aumento de la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo mediante un microscopio de fluorescencia; los resultados demuestran la capacidad de este sistema para detectar cuantitativa y confiablemente un analito de interés liberado por células individuales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del análisis de una sola célula.En particular, permitió investigaciones sistemáticas sobre la respuesta celular a las variaciones en el entorno químico. Podemos observar regulaciones al alza o a la baja de moléculas intracelulares como resultado del estímulo químico. Esta técnica presenta dos ventajas principales.La primera es que podemos exponer las células inmovilizadas a un entorno químico definido que sea constante o cambie periódicamente. En segundo lugar, podemos realizar análisis altamente sensibles y específicos del estado sin ninguna contaminación cruzada ni pérdida de analitos debida al transporte. Para comenzar, fabrique tres obleas maestras diferentes de SU ocho según se describe en el protocolo de texto adjunto.Uno se utilizará para crear la capa fluidica, uno para la capa de control y un tercero para el sello de microcontacto. A continuación, fabrique los chips microfluídicos comenzando con la preparación de una mezcla de 10 a 1 de PDMS y un agente de curado. Mezcle ambas partes vigorosamente y desgasifique la solución durante 30 minutos o hasta que la mezcla esté libre de burbujas.A continuación, coloque la oblea dentro de la capa de control dentro de una placa de Petri y sujétela en la base con cinta adhesiva. Vierta aproximadamente 50 gramos de PDMS encima para crear una capa de cuatro a cinco milímetros de espesor y coloque la oblea durante al menos dos horas en un horno a 80 grados Celsius para asegurar la curación completa del PDMS. Repita el mismo procedimiento para la oblea de impresión por contacto microscópico, pero utilice aproximadamente 20 gramos de PDMS en lugar de 50, obteniendo así una capa de PDMS de cuatro a cinco milímetros de espesor.Para preparar la capa inferior, aplique por centrifugación una capa de PDMS de 40 micrones de altura sobre el oblea con la capa microfluídica. Utilice una velocidad de rotación de 2000 RPM durante 60 segundos. Cure la capa de PDMS en un horno durante una hora a 80 grados Celsius, una vez que todas las partes hayan curado.Retire la capa de control del oblea y córtele en trozos con ayuda de la cuchilla de afeitar. Luego, haga orificios para la conexión de presión utilizando una punción de biopsia de un milímetro y cubra los canales con cinta para su almacenamiento. A continuación, retire el PDMS de encima del oblea para impresión por contacto microscópico y prepare sellos del tamaño del área de la cámara.Guarde las piezas libres de polvo en un cajón hasta su uso. Luego, coloque la oblea recubierta por centrifugación y la capa de control de cuatro a cinco milímetros de espesor en un limpiador de plasma. Exponga las piezas a 18 vatios durante 45 segundos utilizando plasma de oxígeno a 0,75 milibares.Después del tratamiento con plasma, alinee rápidamente ambas capas bajo un microscopio con una distancia de trabajo grande. Añada algo de PDMS de reserva alrededor de las piezas superiores colocadas para facilitar la eliminación del PDMS del oblea. Luego, coloque la oblea en un horno a 80 grados Celsius durante al menos una hora.Una vez curado, utilice un escalpelo para retirar cuidadosamente el PDMS del oblea y recortar los microchips, haciendo orificios de perforación para las conexiones fluidicas con una punción de biopsia de 1,5 milímetros. Además, cree un depósito en el microchip cortando la parte superior de una punta de pipeta de 200 microlitros y utilizando algo de PDMS semicurado sobrante. Péguelo en la parte superior.Luego, cure el chip en el horno a 80 grados Celsius durante al menos una hora. Comience limpiando un portaobjetos de vidrio y las piezas de PDMS. Limpie un portaobjetos de vidrio con jabón.Lávelo con agua destilada y luego nuevamente con etanol. Seque la lámina utilizando una corriente de nitrógeno. Utilice cinta para eliminar cualquier residuo y partículas de polvo del PDMS.Luego coloque la pieza de PDMS y el vidrio limpio. Deslice dentro del limpiador de plasma durante 45 segundos a 18 vatios para asegurar una unión firme; coloque el chip sobre una placa calefactora durante cinco minutos tras el tratamiento con plasma. Después del sellado, corte la parte inferior de algunas puntas de pipeta de 200 microlitros. Llénelas con 10 a 15 microlitros de PBS filtrado con 4 % de BSA y colóquelas en las entradas del dispositivo.Luego, use puntas cortadas con 10 a 15 microlitros de PBS añadidos y colóquelas en los canales de control. A continuación, coloque los chips en la centrífuga y hágales girar a 800 veces la gravedad durante cinco minutos para llenar los canales con líquido. Si queda aire en alguno de los canales, repita este paso hasta que los canales estén completamente llenos.Incubar la solución de bloqueo durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, lavar la solución de la capa de fluido con PBS a un flujo de 10 microlitros por minuto. Mediante una bomba de jeringa, el dispositivo ya está listo para experimentos celulares para preimprimir la lámina de vidrio para inmunoensayos; incubar sellos de impresión por contacto microscópica de PDMS con BSA biotinilada al 0,5 % en una placa de Petri limpia.Después de media hora, limpie las estampas cuidadosamente y rápidamente con agua destilada y seque la estampa bajo un flujo de nitrógeno. Una vez seca, coloque rápidamente las estampas sobre un portaobjetos limpio para depositar la albúmina suero bovina biotinilada patrón. No mueva la estampa después de colocarla y verifique que esté en contacto con el portaobjetos de vidrio.Si es necesario, golpee ligeramente el sello, pero no presione con fuerza. Luego, coloque el sello junto con la parte superior del chip microfluídico en la cámara de plasma y expóngalos a plasma de oxígeno a 18 vatios durante 45 segundos. Después del tratamiento con plasma, retire el sello del portaobjetos de vidrio.Respirar sobre la superficie hará que el patrón sea visible. Alinee las microcámaras encima de la superficie impresa. Una vez alineadas, coloque el chip sobre una placa calefactora a 50 grados Celsius durante 30 minutos para bloquear la superficie restante, introduzca una solución de BSA al 4 % filtrada estérilmente en PBS en el chip mediante una centrífuga como se mostró anteriormente, incube el microchip durante al menos 30 minutos y luego lave la solución fuera de la capa de fluido con PBS a un flujo de 10 microlitros por minuto.Utilizando una bomba de jeringa, use el chip directamente o guárdelo hasta dos semanas a cuatro grados centígrados en una caja húmeda. A continuación, cree una superficie de unión completamente funcional introduciendo avadon en PBS en el depósito. Haga fluir la solución para arrastrar el avadon a través de los canales fluidos posteriormente.Lave el depósito exhaustivamente y pase los canales con PBS. A continuación, añada la proteína G al depósito y hágala pasar a través de los canales. Elimine el exceso de proteína G lavando el depósito y el chip con PBS.A continuación, agregue el anticuerpo de interés al depósito y hágalo circular a través de los canales. Luego detenga el flujo para permitir la unión y lave los canales con PBS; análogos marcados con fluorescencia pueden utilizarse para verificar la calidad del proceso de impresión antes de introducir las células en los canales. Recolecte las células adheridas, como las células HEK 293 mostradas aquí, utilizando un tampón de disociación libre de enzimas, y luego filtre las células para reducir el número de cúmulos celulares; una vez filtradas, introdúzcalas en una jeringa.Con una concentración de 300.000 células por mililitro, cargue las células en el chip utilizando flujo directo en la bomba de jeringa durante aproximadamente tres minutos a una velocidad de 10 a 20 microlitros por minuto para células adhesivas como estas, con el fin de evitar la adhesión no específica de las células cuando las trampas estén llenas; luego, cierre las cámaras presurizando la capa superior con tres bares. A continuación, examine las cámaras utilizando un microscopio. Si se observa que muchas células se han adherido no específicamente a la superficie interna de las cámaras, ábralas rápidamente e intente eliminarlas mediante lavado con tampón de disociación celular a un flujo de 10 a 30 microlitros por minuto.Para el ensayo de glucosa seis fosfato deshidrogenasa o G six PDH, agregue dos milimolares de glucosa, seis fosfato 0,5 milimolares, y una DP 0,5 unidades por mililitro de matrices DIA y 0,3 milimolares de RIN a un tampón de lisis y asegúrese de que esté bien mezclado. Una vez que los canales estén despejados, haga pasar el tampón de lisis de G six PDH a través del chip a un flujo de 30 microlitros por minuto. Mientras el tampón de lisis está fluyendo, abra y cierre rápidamente las cámaras, dejándolas abiertas durante 500 milisegundos para permitir que el lisis entre en la cámara; inmediatamente después del lisis, comience a monitorear la reacción cinética.En este ejemplo, se puede monitorear un producto fluorescente a lo largo del tiempo. Aquí se muestra una matriz de cámaras que fueron llenadas con colorante alimentario naranja y luego selladas mediante la presurización de la capa de control ubicada sobre las microcámaras. Tras el cierre de las cámaras, se enjuagó colorante alimentario verde a través de los canales para mostrar la hermeticidad de las cámaras.Cada cámara contiene un volumen de solo 625 picolitros de fluido, lo que mantiene la concentración de moléculas liberadas por las células lisadas lo suficientemente alta para su análisis. Además, las válvulas pueden abrirse y cerrarse de manera que se elimina la contaminación cruzada entre las cámaras. Dentro de estas cámaras, es posible medir analitos tales como la cantidad de lisosomas liberados por una sola célula U 9 37 activada con PMA, mientras cataliza enzimáticamente la producción de una molécula fluorescente dentro de la cámara.Las líneas verdes representan el cambio en la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo para las cámaras ocupadas por una célula. También se muestra la intensidad de fluorescencia para una cámara sin células, representada por la línea negra punteada. A modo de comparación, este ensayo muestra el efecto de una molécula tóxica sobre la integridad de la membrana mediante la medición de una enzima intracelular, la G seis PDH.La línea negra representa las muestras de control sin influencia tóxica, mientras que la línea naranja representa las células influenciadas por la toxina mostrada. A continuación se muestra un ejemplo de un inmunoensayo para la proteína intracelular. Los anticuerpos GFP anti GFP se inmovilizaron sobre la superficie y, una vez que las células fueron lisadas, la cinética de unión de las proteínas GFP se visualizó mediante microscopía TURB.El tiempo 0,1 marca la introducción del tampón de lisis en el tiempo 0. El GFP comienza a acumularse en la superficie, lo que indica que ha ocurrido la lisis celular y que el GFP ha difundido hacia la superficie. La unión del GFP a los anticuerpos finaliza en el tiempo 0,3. En este ejemplo final, el GA DH liberado se une a los anticuerpos de captura en la superficie y luego se añaden los anticuerpos de detección conjugados con HRP.Una vez que se eliminaron por lavado todos los anticuerpos de detección no unidos, se introdujo el reactivo de detección y la reacción transcurrió durante un período de tiempo. A continuación se muestra una comparación de la cantidad de GA DH, previamente intracelular, en cantidades animales entre células U 9 37 y HEC 2 93, medida mediante este método. Después de ver este video, usted debería tener una buena comprensión de cómo preparar los chips microfluídicos, cómo modificar la superficie para permitir inmunoensayos y, finalmente, cómo utilizar el dispositivo para el análisis de una sola célula.Este método puede emplearse para ayudar a responder muchas preguntas de investigación en el campo de la biología de célula única.

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Investigación

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