Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

El objetivo general del siguiente experimento es analizar lisados de células individuales mediante fluorescencia o inmunoensayos. Esto se logra creando primero un dispositivo microfluídico y recubriendo la cámara interna con anticuerpos. A continuación, las células individuales se inmovilizan en las trampas y se exponen a varios reactivos para estimular una respuesta celular en un segundo paso.

Una válvula en forma de anillo se cierra rápidamente y el tampón de lisis fluye a través del dispositivo. La válvula en forma de anillo se abre durante un corto período de tiempo y las células se lisan dentro de la microcámara, lo que permite que las proteínas liberadas se unan a los anticuerpos a una alta concentración debido al pequeño volumen. A continuación, se abre la válvula en forma de anillo.

La cámara se lava y los reactivos de detección se introducen en la microcámara cerrada. El aumento de la intensidad de la fluorescencia se monitoriza a lo largo del tiempo utilizando un microscopio de fluorescencia, los resultados demuestran la capacidad de este sistema para detectar de forma cuantitativa y fiable un analito de interés liberado de células individuales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del análisis de una sola celda A.

En particular, se dedicó a realizar investigaciones sistemáticas sobre la respuesta celular a las variaciones en el entorno químico. Podemos ver regulaciones hacia arriba o hacia abajo de las moléculas intracelulares como resultado del estímulo químico. Hay dos ventajas principales de esta técnica.

La primera es que podemos exponer las células inmovilizadas a un entorno químico definido que es constante o cambia periódicamente. En segundo lugar, podemos reformar análisis altamente sensibles y específicos del estado sin ninguna contaminación cruzada o pérdida de analitos debido al transporte. Para comenzar, fabrique las tres obleas maestras SU ocho diferentes como se describe en el protocolo de texto adjunto.

Uno se utilizará para crear la capa fluídica, otro para la capa de control y un tercero para el micro sello de contacto. A continuación, fabrique los chips microfluídicos comenzando con la preparación de una mezcla de 10 a uno de PDMS y un agente de curado. Mezcle ambas partes vigorosamente y desgasifique la solución durante 30 minutos o hasta que la mezcla esté libre de burbujas.

A continuación, coloque la oblea dentro de la capa de control dentro de una placa de Petri y péguela con cinta adhesiva en la parte inferior. Vierta aproximadamente 50 gramos de PDMS encima para crear una capa de cuatro a cinco milímetros de espesor y coloque la oblea durante al menos dos horas en un horno a 80 grados centígrados para asegurar el curado completo del PDMS. Repita el mismo procedimiento para la oblea de impresión por microcontacto, pero use aproximadamente 20 gramos de PDMS en lugar de 50, lo que da como resultado una capa de PDMS de cuatro a cinco milímetros de grosor.

Para preparar la capa inferior, apliques una capa de PDMS de 40 micras de alto sobre la oblea con la capa microfluídica. Usando una velocidad de rotación de 2000 RPM durante 60 segundos. Cura la capa de PDMS en un horno durante una hora a 80 grados centígrados cuando todas las partes se hayan curado.

Retire la capa de control de la oblea y córtela en pedazos con la ayuda de la hoja de afeitar. A continuación, perfore los orificios de conexión de presión con una punción de biopsia de un milímetro y cubra los canales con cinta adhesiva para su almacenamiento. A continuación, retire el PDMS de la oblea de impresión por microcontacto y prepare sellos del tamaño del área de la cámara.

Guárdelos sin polvo en un cajón hasta su uso. A continuación, coloque la oblea recubierta de centrifugación y la capa de control de cuatro a cinco milímetros de grosor en un limpiador de plasma. Exponga las piezas a 18 vatios durante 45 segundos utilizando plasma de oxígeno a 0,75 milibares.

Después del tratamiento con plasma, alinee rápidamente ambas capas bajo un microscopio con una gran distancia de trabajo. Agregue algunos PDMS de repuesto alrededor de las partes superiores colocadas para facilitar la extracción del PDMS de la oblea. Luego coloque la oblea en un horno a 80 grados centígrados durante al menos una hora.

Una vez curado, utilice un bisturí para retirar con cuidado el PDMS de la oblea y para cortar los microchips perforar los orificios de acceso para las conexiones fluidas con una punción de biopsia de 1,5 milímetros. Además, cree un depósito en el microchip cortando la parte superior de la punta de una pipeta de 200 microlitros y utilizando un poco de PDMS semicurado de repuesto. Pégalo encima.

A continuación, cure el chip en el horno a 80 grados centígrados durante al menos una hora. Comience limpiando un portaobjetos de vidrio y las piezas de PDMS. Limpie un portaobjetos de vidrio con jabón.

Enjuáguelo con agua destilada y luego nuevamente con etanol. Seque el portaobjetos con un chorro de nitrógeno. Utilice cinta adhesiva para eliminar cualquier residuo y partículas de polvo del PDMS.

A continuación, coloque la pieza PDMS y el vidrio limpio. Deslícelo en el limpiador de plasma durante 45 segundos a 18 vatios para asegurar una unión hermética, coloque el chip en una placa caliente durante cinco minutos después del tratamiento con plasma Después de la unión, corte la parte inferior de unas puntas de pipeta de 200 microlitros. Llénelos con 10 a 15 microlitros de PBS filtrado con 4%BSA y colóquelos en las entradas del dispositivo.

Luego use puntas de corte con 10 a 15 microlitros agregados de PBS y colóquelas en los canales de control. A continuación, coloque las virutas en la centrífuga y gírelas a 800 veces la gravedad durante cinco minutos para llenar los canales de líquido. Si queda aire en alguno de los canales, repita este paso hasta que los canales estén completamente llenos.

Incube la solución de bloqueo durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave la solución de la capa de líquido con PBS a un caudal de 10 microlitros por minuto. Utilizando una bomba de jeringa, el dispositivo ya está listo para los experimentos celulares para preimprimir el portaobjetos de vidrio para inmunoensayos e incubar sellos de impresión de microcontacto PDMS con BSA biotinilado al 0,5% en una placa de Petri limpia.

Después de media hora, limpie los sellos a fondo y rápidamente con agua destilada y seque el sello bajo un chorro de nitrógeno. Una vez secos, coloque rápidamente los sellos en un portaobjetos de vidrio limpio para depositar el BSA biotinilado estampado. No mueva el sello después de colocarlo y verifique que el sello esté en contacto con el portaobjetos de vidrio.

Si no es ligeramente, golpee el sello, pero no presione hacia abajo con fuerza. A continuación, coloque el sello junto con la parte superior del chip microfluídico en la cámara de plasma y exponga al plasma de oxígeno a 18 vatios durante 45 segundos. Después del tratamiento con plasma, retire el sello del portaobjetos de vidrio.

Respirar en la superficie hará que el patrón sea visible. Alinee las microcámaras en la parte superior de la superficie impresa. Una vez alineado, coloque el chip en una placa caliente a 50 grados centígrados durante 30 minutos para bloquear la superficie restante, introduzca una solución BSA filtrada estéril al 4% en PBS en el chip con una centrífuga como se muestra anteriormente, incube el microchip durante al menos 30 minutos y luego lave la solución de la capa de fluido con PBS a un caudal de 10 microlitros por minuto.

Con una bomba de jeringa, use el chip directamente o guárdelo hasta dos semanas a cuatro grados centígrados en una caja húmeda. A continuación, cree una superficie de unión completamente funcional introduciendo avadon en PBS en el depósito. Después, haga fluir la solución para extraer el avadon a través de los canales de fluido.

Enjuague bien el depósito y enjuague los canales con PBS. A continuación, añade la proteína G al depósito y tira de ella a través de los canales. Lave cualquier exceso de proteína G enjuagando el depósito y el chip con PBS.

A continuación, agregue el anticuerpo de interés al reservorio y hágalo fluir a través de los canales. A continuación, detenga el flujo para permitir la unión antes de lavar los canales con PBS de forma fluorescente, los análogos etiquetados se pueden utilizar para comprobar la calidad del proceso de impresión antes de introducir células en los canales. Recoja las células adheridas, como las células HE 2 9 3 que se muestran aquí, utilizando un tampón de disociación libre de enzimas, y luego fíltrelas para reducir el número de grupos de células una vez filtradas, cárguelas en una jeringa.

A 300.000 células por mililitro, cargue las células en el chip utilizando el flujo directo en la bomba de jeringa durante unos tres minutos a una velocidad de 10 a 20 microlitros por minuto para células adhesivas como estas para evitar la adhesión inespecífica de las células cuando se llenan las trampas, cierre las cámaras presurizando la capa superior con tres barras. A continuación, examine las cámaras con un microscopio. Si se encuentra que muchas células se han adherido de manera no específica a la superficie dentro de las cámaras, ábralas rápidamente e intente lavarlas con un tampón de disociación celular a un caudal de 10 a 30 microlitros por minuto.

Para el ensayo de glucosa seis fosfato deshidrogenasa o G seis PDH, agregue dos matrices de glucosa milimolar, seis fosfato 0,5 milimolares y 0,5 unidades DP por mililitro DIA y 0,3 milimolares RIN a un tampón de lisis y asegúrese de que esté bien mezclado. Una vez que se hayan despejado los canales, extraiga el tampón de lisis G six PDH a través del chip a un caudal de 30 microlitros por minuto. A medida que el tampón de lisis fluye, abra y cierre rápidamente las cámaras, dejándolas abiertas durante 500 milisegundos para permitir que la lisis ingrese a la cámara inmediatamente después de que la lisis comience a monitorear la reacción cinética.

En este ejemplo, un producto fluorescente se puede monitorear a lo largo del tiempo. Aquí se muestra una serie de cámaras que se llenaron con colorante alimentario naranja y luego se cerraron presurizando la capa de control por encima de las microcámaras. Después del cierre de la cámara, se enjuagó el colorante alimentario verde a través de los canales para mostrar la estanqueidad de las cámaras.

Cada cámara contiene un volumen de solo 625 picolitros de fluido que mantiene la concentración de moléculas liberadas por las células lisas lo suficientemente alta para el análisis. Además, las válvulas se pueden abrir y cerrar de manera que se elimine la contaminación cruzada entre las cámaras. Dentro de estas cámaras, es posible medir analitos como la cantidad de lisosoma liberado de una sola célula U 9 37 activada por PMA, ya que cataliza enzimáticamente la producción de una molécula fluorescente dentro de la cámara.

Las líneas verdes representan el cambio en la intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo para las cámaras ocupadas por una célula. También se muestra la intensidad de fluorescencia para una cámara sin células representada por la línea de puntos negra. A modo de comparación, este ensayo muestra el efecto de una molécula tóxica en la integridad de la membrana mediante la medición de una enzima intracelular G six PDH.

La línea negra representa las muestras de control sin influencia tóxica, mientras que la línea naranja representa las células influenciadas por la toxina mostrada. A continuación, se muestra un ejemplo de un inmunoensayo para la proteína intracelular. Los anticuerpos anti GFP se inmovilizaron en la superficie y, una vez que se lisaron las células, se visualizó la cinética de unión de las proteínas GFP mediante microscopía de césped.

El tiempo 0,1 marca la introducción del tampón de lisis en el momento 0,2 La GFP comienza a acumularse en la superficie, lo que significa que se ha producido la lisis celular y la GFP se ha difundido a la superficie. La unión de GFP a los anticuerpos se completa en el tiempo 0,3. En este último ejemplo, se añadieron GA DH liberados unidos a capturar anticuerpos en la superficie y luego se añadieron anticuerpos de detección acoplados a HRP.

Una vez que se eliminaron todos los anticuerpos de detección no unidos, se introdujo el reactivo de detección y la reacción fue con el tiempo. A continuación se presenta una comparación de la cantidad de GA DH previamente intracelular en cantidades animales entre las células U 9 37 y HEC 2 93 medidas utilizando este método. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar los chips microfluídicos, cómo modificar la superficie para permitir inmunoensayos y, finalmente, cómo usar el dispositivo para el análisis de una sola célula.

Este método se puede emplear para ayudar a responder muchas preguntas desencadenantes en el campo de la biología de células individuales.