Protocolos optimizados para

El objetivo de este trabajo es mostrar cómo preparar una suspensión de lípidos de micobacterias altamente viable. Para inyección en ratones desnudos. Conservaremos la bacteria viva de un ratón infectado, preferiblemente durante la etapa temprana de la infección.

Para garantizar rendimientos de explantes altamente viables, sacrificar al animal dentro de la cabina de seguridad biológica. Sostener la pata trasera con pinzas hemostáticas. Cortarlas con tijeras y sumergirlas en yodo al 2% durante 20 minutos para descontaminación, manteniendo la posición del punto con la planta del pie hacia arriba.

Recolecte el tejido blando. Con una hoja de bisturí, retire los huesos de la primera y quinta falanges para facilitar la homogenización del tejido. Coloque el tejido en una placa de Petri estéril. Raspe la epidermis.

Corte el tejido granulomatoso en pequeños fragmentos con tijeras y espere para el cálculo posterior del programa de rendimiento de tejido. Transfiera los pequeños fragmentos a un tubo que contenga un ml de solución salina balanceada de Hank. Añada un ml adicional de Hank y homogenice el tejido tres veces durante 15 segundos cada vez a velocidad cuatro.

Coloque un filtro celular en un tubo cónico estéril de 50 ml. Aplique la suspensión sobre el filtro mediante pipeta y deje que la solución pase por gravedad. Para eliminar los restos celulares, añada otros 2 MLS de Hank's a la suspensión y homogenice nuevamente.

Utilizando el mismo ciclo, haga pasar la suspensión a través de este filtro. Enjuague el filtro añadiendo alícuotas. Para llevar el volumen total de la suspensión a nueve ml, añada un ml de solución de tripsina al 0,5 % a la suspensión para obtener una concentración final del 0,05 %.

Mezcle invirtiendo suavemente el tubo e incube a 37 grados Celsius durante 60 minutos. Tras la incubación, aforar el volumen del sobrenadante a cuatro mL añadiendo solución salina estéril, centrifugue a 1700 G durante 30 minutos a cuatro grados Celsius, deseche el sobrenadante y resuspenda el precipitado golpeando suavemente el tubo. Añada un mL de solución salina y mezcle.

Transfiera la suspensión a un tubo nuevo. Homogenice la suspensión vascular utilizando una jeringa de insulina de un ml con aguja de calibre 26 mientras transfiere la suspensión a un tubo nuevo. Realice el control microbiológico de la suspensión colocando dos gotas del medio 18, siete H nueve infusión cerebral cardíaca.

11 Stein Genesen incubado a 37 grados Celsius. Luego, seguir los procedimientos rutinarios de control microbiológico. Para tinción con código Z.

Prepare una dilución uno a diez y una dilución uno a cien de la suspensión S en solución salina. Homogenice cada dilución antes de preparar estas muestras para el recuento. Prepare tres portaobjetos dibujando tres círculos de 10 milímetros de diámetro interno en la superficie de cada uno, utilizando un marcador de tinta permanente.

Ahora rodee los círculos con un rotulador para inmunohistoquímica. Etiquete estos compartimentos con un lápiz número 2 para prepararlos con las tres concentraciones de suero: sin diluir, uno a diez y uno a cien.

Pipetee cinco microlitros de la solución fenólica sérica y 10 microlitros de la suspensión salina en cada círculo, homogenice y distribuya la suspensión uniformemente en toda el área del círculo. Utilizando el mango de un asa desechable, coloque estas láminas sobre una mesa nivelada para que sequen tras el secado. Fíjelas pasando estas láminas tres veces sobre la llama azul con las suspensiones bacterianas orientadas hacia arriba.

Realice un código Zuni de mantenimiento. Examine estas láminas. Las tres diluciones.

Seleccione la dilución más adecuada para el recuento de sary. Prepare 200 microlitros de suspensión de sary muerta mediante la autoclave de la suspensión vascular durante 30 minutos a 121 grados Celsius. Utilice el kit de viabilidad bacteriana L 7 0 0 7 live dead con iluminación posterior para la tinción fluorescente del lípido microbacteriano.

Prepare una dilución 1:10 de la solución A y una dilución 1:20 de la solución B justo antes de usarla. A cada 200 microlitros de la suspensión vascular original no diluida y muerta, agregue 3,6 microlitros de la solución A diluida y seis microlitros de la solución B diluida. Después de 15 minutos de incubación en la oscuridad, centrifugue la suspensión a 10.600 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Retire el sobrenadante con la pipeta.

Se suspende el precipitado en 50 microlitros de glicerol al 10 %, se homogeniza mediante pipeteo ascendente y descendente. Se colocan ocho microlitros de cada suspensión sobre un portaobjetos de vidrio y se cubre con una pequeña laminilla. Proteger de la luz.

Observe las suspensiones bajo microscopio fluorescente. Prepare una suspensión con una concentración de 10 a siete BA lip por ml, que contenga un ml de medio de congelación en cada vial criogénico. Luego añada 150 microlitros de la suspensión S a un ml del medio de congelación y homogenice invirtiendo el tubo.

Coloque el vial criogénico dentro del recipiente de congelación. Mantenga el recipiente a menos 80 grados Celsius durante al menos 24 horas. Transfiera los tubos a una caja de almacenamiento y manténgalos a menos 80 grados Celsius para su descongelación.

Deshielo de la suspensión congelada en un baño de agua ajustado a 37 grados Celsius. Transfiera la suspensión a un tubo cónico que contenga 20 millas de solución salina estéril cent. Se negó a concentrar.

El baline siguió el protocolo Z de mantenimiento para el recuento y el protocolo de tinción fluorescente para la determinación de la variabilidad. Prepare una suspensión que contenga de 10 a ocho BA por comida, homogenice la suspensión antes de inocular cada animal. Aspire cien microlitros en una jeringa de insulina e inocule treinta microlitros en las almohadillas traseras de las patas de cada animal en la determinación de viabilidad.

Se observa fluorescencia verde en todos los BAI y fluorescencia roja únicamente en ese bai. Cuando esos BAI son controles estériles, se observa la misma intensidad de luz verde y roja de BAI. La inoculación de M Lepar congelado durante diferentes períodos produce un aumento de 10 a 1000 veces en el número de BAI recuperados después de siete meses.

Como observación final, nos gustaría añadir que, dado que IL leid no crece in vitro, este protocolo permite una forma rápida y sencilla de mantener viable yl Leid disponible para usos posteriores en el laboratorio.