Motor transección del nervio y Time-lapse de imágenes de Conductas de células gliales en el pez cebra en vivo

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes en time-lapse del comportamiento de las células gliales después de una lesión de nervios periféricos en larvas vivas de pez cebra. Esto se logra montando primero larvas de pez cebra anestesiadas en aros de bajo punto de fusión en placas de Petri con fondo de vidrio y colocándolas con una aguja de disección. A continuación, las larvas montadas se colocan en el microscopio confocal.

Se selecciona un nervio para la ablación y se obtiene una imagen de los axones y las células gliales del nervio no lesionado. A continuación, se seleccionan las ROI a lo largo del nervio y se dispara el láser para extirpar las zonas seleccionadas creando una transección del nervio. Por último, se obtienen imágenes de los axones y las células gliales en time-lapse después de la transección del nervio.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el comportamiento dinámico de las células gliales durante la degeneración y regeneración nerviosa a través de la microscopía confocal de lapso de tiempo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la regeneración y la biología de las células gliales, como ¿cómo responden las células gliales a las lesiones nerviosas? ¿Y cómo coordinan los distintos subtipos gliales su comportamiento durante la degeneración y la regeneración?

Después de cruzar peces cebra adultos que contienen transgenes que marcan fluorescentemente las neuronas motoras y los tipos de células gliales de interés e incubar los embriones hasta 24 horas después de la fertilización o HPF, retire el agua de huevo y reemplácela con un diente de pH o PTU en agua de huevo antes de devolver los embriones a la incubadora. A partir de este punto de tiempo hasta aproximadamente 96 HPF, use un endoscopio de disección fluorescente para examinar los embriones para detectar la presencia del gen fluorescente deseado. Transfiera los embriones positivos a agua fresca de huevo PTU y devuélvalos a la incubadora.

Cuando las larvas alcancen los seis días después de la fertilización o DPF, seleccione algunos embriones para montarlos y transfiéralos a un plato más pequeño. Retire el agua del plato y reemplácela inmediatamente con 0.02%trica En agua de huevo PTU, incubar las larvas en anestesia aproximadamente cinco minutos. Coloque un Eloqua de 0,8% de agros de bajo punto de fusión previamente preparado de acuerdo con el protocolo de texto en un vaso de precipitados con agua del grifo y un microondas.

Durante 30 segundos o hasta que el agros se derrita, deje que el vaso de precipitados se enfríe hasta que el tubo de agros se sienta tibio al tacto. A continuación, transfiera una larva anestesiada a un plato con fondo de vidrio de 35 milímetros. Retira el agua del plato.

Luego, cubra inmediatamente las larvas con suficientes aros calientes para llenar la porción del plato con fondo de vidrio. A medida que el agros se endurece, use una aguja de disección para colocar las larvas de lado. Luego inclínelo ligeramente sobre su espalda, asegurándose de que las larvas montadas toquen el vidrio en el fondo del plato, lo cual es necesario para lesiones e imágenes.

Utilice la aguja para mantener las larvas en su posición hasta que el agro se solidifique y las larvas queden inmovilizadas. Luego, pipetee lentamente suficiente agua trica en el plato para cubrir completamente los agros y las larvas. Encienda toda la instrumentación del microscopio confocal, los láseres de diodo apropiados para excitar los transgenes del pez cebra y el láser de tinte bombeado con nitrógeno.

Asegúrese de que el divisor de haz en blanco esté en su lugar y que la celda de coer y tinte de 435 nanómetros esté en su lugar. Abra completamente el atenuador láser y luego abra el software de imagen con la lente de inmersión en agua de 63 x 1,2 na y un portaobjetos de vidrio con un lado espejado. Usa la iluminación de campo claro para encontrar y enfocar un rasguño o grabado en el espejo.

Usando el software de imágenes, vea y enfoque los grabados en la pantalla de la computadora desde la ventana que controla la calibración del láser y la configuración de energía. Establezca el número de pulsos en uno y la atenuación en 3% de transmisión desde la barra de herramientas principal. Seleccione la herramienta de elipse y haga clic en la imagen en la pantalla de la computadora.

Para crear un único ROI circular, repita el proceso tres veces más hasta que haya cuatro RI circulares espaciadas aleatoriamente sobre la imagen. A continuación, dispara el láser. Si el láser funciona y está calibrado correctamente, se crearán cuatro pequeños grabados puntuales, uno dentro de cada ROI circular. A continuación, retire el portaobjetos de cristal de la platina del microscopio y limpie el objetivo.

Reemplace el divisor de haz en blanco con el divisor de haz 100%ILL para seccionar un nervio motor mediante ablación láser. Aplique una pequeña gota de medio de inmersión en agua al objetivo y coloque el plato con la larva montada en la etapa apropiada usando clips para estabilizarlo usando el ocular y la iluminación de campo amplio. Concéntrese en las larvas y localice las neuronas motoras.

Escanee los nervios en los segmentos hemis 10 a 20 y seleccione un nervio motor para la transección. A continuación, muestre una vista en vivo del nervio en la pantalla de la computadora. Seleccione los planos Z y obtenga una imagen de los axones y las células gliales del nervio no lesionado.

A continuación, prepare los ajustes de imágenes de lapso de tiempo para capturar proyecciones Z de todos los tipos de células en intervalos de cinco a 30 minutos. Dependiendo del experimento, retire el divisor de haz 100%ILL y reemplácelo con la pieza en bruto. Regrese a la vista en vivo del nervio y use el canal fluorescente apropiado para ver los axones que se seccionarán.

Con la herramienta de elipse, cree un ROI elíptico delgado en el área que se va a ablacionar. A continuación, cree ROI más pequeños dentro de la región seleccionada en la ventana que controla la configuración del láser. Ajuste el número de pulsos a dos y la placa de atenuación al 18% de transmisión.

A continuación, dispare el láser dentro de los ROI seleccionados. Espere 10 segundos o más y vuelva a revisar el área ablacionada para ver si hay fluorescencia. Tenga en cuenta que un ROI puede aparecer inicialmente ablacionado cuando en realidad está fotoblanqueado y es posible que sea necesario modificar ligeramente los ROI durante el curso de la ablación para lograr una transección completa.

Si vuelve la fluorescencia, aumente la potencia del láser y dispare el láser. Nuevamente, repita esto hasta que la fluorescencia desaparezca dentro del R OIS y no regrese dentro de los 10 segundos. Una vez completada la ablación, comience a tomar imágenes de lapso de tiempo cuando se complete el lapso de tiempo.

Utilice software de creación de imágenes para compilar datos y crear proyecciones Z compuestas en color para cada punto de tiempo. Cree una película de tiempo rápido para analizar el comportamiento de las células gliales de los axones simultáneamente. El ensayo descrito aquí se puede utilizar para evaluar la respuesta de las células gliales y otras poblaciones de células asociadas a los nervios a la lesión axonal in vivo.

Aquí se muestra un ejemplo de una lesión nerviosa creada con este método y la respuesta de las células gliales circundantes. El experimento se realizó en seis peces cebra transgénicos DPF que expresaban un EGFP dirigido a la membrana en ggl perineural y rojo DS citosólico en neuronas motoras. La lesión se produjo a lo largo de la proyección rostral de un nervio motor del tronco que luego se tomó una imagen de lapso de tiempo en los canales rojos EGFP y DS.

Esto permitió la visualización simultánea de los comportamientos de los axones y las células gliales inmediatamente después de la lesión. Estas imágenes son puntos de tiempo estáticos tomados de la película time-lapse. La elipse punteada muestra el ROI que se ablacionó con el láser en un minuto.

Después de la transección o MPT, el área ablacionada carecía de fluorescencia y la zona de lesión medía aproximadamente 3,5 micrómetros desde el muñón proximal hasta el distal. El éxito de una transección se puede confirmar mediante la obtención de imágenes del muñón del nervio distal y la búsqueda de signos de degeneración walleriana, incluida la fragmentación del axón distal y el aclaramiento rápido. La ausencia de fluorescencia axonal a lo largo del muñón distal a 120 MPT indica que estos axones han sufrido degeneración walleriana y la transacción fue exitosa.

Ajustar la potencia del láser a una configuración ideal es fundamental cuando se realizan experimentos de ablación con láser. Los ajustes ideales de potencia del láser ablacionarán limpiamente el nervio sólo dentro del ROI seleccionado, y los ajustes de potencia del láser que son demasiado bajos o demasiado altos producirán resultados subóptimos, ya que aquí hay una lesión que se realizó con la potencia del láser demasiado baja. La fluorescencia permaneció dentro del ROI después de disparar el láser, lo que resultó en una transección incompleta.

Por otro lado, como se demuestra en esta figura, una potencia láser demasiado alta produjo una ablación extremadamente grande. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo montar pez cebra para experimentos de transección con láser. Cree una transección utilizando un láser de tinte con bomba de nitrógeno y evalúe la respuesta de las células circundantes mediante imágenes confocales de lapso de tiempo.