Motor transección del nervio y Time-lapse de imágenes de Conductas de células gliales en el pez cebra en vivo

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de lapso de tiempo del comportamiento de las células gliales tras una lesión del nervio periférico en larvas de pez cebra vivas. Esto se logra primero montando larvas de pez cebra anestesiadas en agarosa de punto de fusión bajo en placas de Petri con fondo de vidrio y posicionándolas con una aguja de disección. A continuación, se coloca la larva montada en el microscopio confocal.

Se selecciona un nervio para la ablación y se adquiere una imagen de los axones y las células gliales del nervio no lesionado. A continuación, se seleccionan áreas de interés (ROI) a lo largo del nervio y se dispara el láser para ablacionar las áreas seleccionadas, creando una sección nerviosa. Finalmente, se realiza un registro por intervalos de los axones y las células gliales tras la sección nerviosa.

Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran el comportamiento dinámico de las células gliales durante la degeneración y regeneración nerviosa mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la regeneración y la biología de las células gliales, como ¿cómo responden las células gliales a la lesión nerviosa? y ¿cómo coordinan los distintos subtipos de células gliales su comportamiento durante la degeneración y regeneración?

Después de cruzar peces cebra adultos que contienen transgenes que marcan con fluorescencia las neuronas motoras y los tipos celulares gliales de interés, e incubar los embriones hasta 24 horas post-fecundación (HPF), retire el agua de huevo y sustitúyala por agua de huevo con un inhibidor del pH o PTU antes de devolver los embriones al incubador. A partir de este momento y hasta aproximadamente las 96 HPF, utilice un microscopio de disección fluorescente para examinar los embriones en busca de la presencia del gen fluorescente deseado. Transfiera los embriones positivos a agua de huevo fresca con PTU y devuélvalos al incubador.

Cuando las larvas alcancen seis días post-fecundación o DPF, seleccione algunos embriones para su montaje y transfiéralos a un recipiente más pequeño. Retire el agua del recipiente y reemplácela inmediatamente con agua de huevo PTU que contenga trica al 0,02%. Incube las larvas en el anestésico durante aproximadamente cinco minutos. Coloque un poco de agarosa de bajo punto de fusión al 0,8 % preparada previamente según el protocolo descrito en el texto en un vaso de precipitados con agua del grifo y caliéntelo en un microondas.

Durante 30 segundos o hasta que el agar se derrita, deje que el vaso de precipitados se enfríe hasta que el tubo de agar se sienta tibio al tacto. A continuación, transfiera una larva anestesiada a un platillo de vidrio de fondo de 35 milímetros. Retire cualquier agua presente en el platillo.

Luego, cubra inmediatamente las larvas con suficiente agaros caliente para llenar la porción del platillo con fondo de vidrio. A medida que el agaros se endurece, use una aguja de disección para colocar las larvas de lado. A continuación, inclínelas ligeramente hacia la espalda, asegurándose de que la larva montada esté tocando el vidrio en la parte inferior del platillo, lo cual es necesario para la lesión y la obtención de imágenes.

Utilice la aguja para mantener las larvas en posición hasta que el agar se solidifique y las larvas queden inmovilizadas. Luego, pipetee lentamente suficiente agua trica en el recipiente para cubrir completamente los geles de agar y las larvas. Encienda todos los instrumentos del microscopio confocal, los láseres de diodo apropiados para excitar los transgenes de pez cebra y el láser de colorante bombeado por nitrógeno.

Asegúrese de que el divisor de haz en blanco esté en su lugar y de que la celda de colorante y el láser de 435 nanómetros estén colocados. Abra completamente el atenuador del láser y luego abra el software de imagen con el objetivo de inmersión en agua de 63 x 1.2 na y una lámina de vidrio con un lado reflectante. Utilice la iluminación de campo claro para localizar y enfocar un rayón o marca en el espejo.

Mediante software de imagen, visualice y enfoque las marcas en la pantalla del ordenador desde la ventana que controla la calibración del láser y los ajustes de potencia. Establezca el número de pulsos en uno y la atenuación en 3 % de transmisión desde la barra de herramientas principal. Seleccione la herramienta de elipse y haga clic sobre la imagen en la pantalla del ordenador.

Para crear una única ROI circular, repita el proceso otras tres veces hasta que haya cuatro ROI circulares distribuidas aleatoriamente sobre la imagen. A continuación, active el láser. Si el láser funciona y está calibrado correctamente, esto creará cuatro pequeñas marcas punteadas, una dentro de cada ROI circular. Luego, retire la lámina de vidrio del portaobjetos del microscopio y limpie el objetivo.

Sustituya el divisor de haz en blanco por el divisor de haz al 100 % ILL para seccionar un nervio motor mediante ablación láser. Aplique una pequeña gota de medio de inmersión acuoso sobre el objetivo y coloque el platillo con la larva montada sobre la platina adecuada utilizando pinzas para estabilizarlo, con ayuda del ocular y la iluminación de campo amplio. Enfóquese en las larvas y localice las neuronas motoras.

Examine los nervios en los hemisegmentos del 10 al 20 y seleccione un nervio motor para la sección. A continuación, muestre una vista en vivo del nervio en la pantalla del ordenador. Seleccione los planos Z y adquiera una imagen de los axones y las células gliales del nervio no lesionado.

Luego, prepare la configuración de imágenes de lapso de tiempo para capturar proyecciones Z de todos los tipos celulares a intervalos de cinco a treinta minutos. Dependiendo del experimento, retire el divisor de haz al 100 %ILL y sustitúyalo por el blanco. Regrese a la vista en vivo del nervio y utilice el canal fluorescente adecuado para observar los axones que serán seccionados.

Utilizando la herramienta de elipse, cree una ROI elíptica delgada en el área que se va a ablacionar. Luego, cree ROI más pequeñas dentro de la región seleccionada en la ventana que controla la configuración del láser. Establezca el número de pulsos en dos y la placa de atenuación en 18 % de transmisión.

Luego dispare el láser dentro de las ROI seleccionadas. Espere 10 segundos o más y vuelva a verificar el área ablacionada en busca de fluorescencia. Tenga en cuenta que una ROI puede parecer inicialmente ablacionada cuando en realidad está fotoblanqueada, y es posible que las ROI deban modificarse ligeramente durante el proceso de ablación para lograr una sección completa.

Si la fluorescencia regresa, aumente la potencia del láser y active el láser. Repita nuevamente este procedimiento hasta que la fluorescencia desaparezca dentro de la R OIS y no regrese dentro de los 10 segundos. Una vez finalizada la ablación, inicie la adquisición de imágenes en intervalos cuando finalice el registro temporal.

Utilice un software de imágenes para compilar los datos y crear proyecciones Z compuestas en color para cada punto temporal. Cree una película rápida para analizar simultáneamente el comportamiento de los axones y las células gliales. El ensayo descrito aquí puede utilizarse para evaluar la respuesta de las células gliales y otras poblaciones celulares asociadas al nervio frente a la lesión axonal in vivo.

Se muestra aquí un ejemplo de una lesión nerviosa creada mediante este método y la respuesta de las células gliales circundantes. El experimento se realizó en seis peces cebra transgénicos DPF que expresaban EGFP dirigido a la membrana en ggl perineurales y DS rojo citosólico en neuronas motoras. La lesión se realizó a lo largo de la proyección rostral de un nervio motor del tronco, que luego se registró mediante imágenes de lapso de tiempo en los canales EGFP y DS rojo.

Esto permitió la visualización simultánea del comportamiento de los axones y las células gliales inmediatamente después de la lesión. Estas imágenes son puntos temporales estáticos tomados de la película con lapso de tiempo. La elipse punteada muestra la región de interés (ROI) que fue ablacionada utilizando el láser a un minuto.

Después de la transección o MPT, el área ablada carecía de fluorescencia y la zona de lesión medía aproximadamente 3,5 micrómetros desde el muñón proximal hasta el distal. El éxito de una transección puede confirmarse mediante la obtención de imágenes del muñón nervioso distal y la búsqueda de signos de degeneración walleriana, incluyendo la fragmentación del axón distal y la eliminación rápida. La ausencia de fluorescencia axonal a lo largo del muñón distal a las 120 MPT indica que estos axones han sufrido efectivamente degeneración walleriana y que la transección fue exitosa.

Ajustar la potencia del láser a un valor ideal es fundamental al realizar experimentos de ablación láser. La potencia ideal del láser ablará limpiamente el nervio únicamente dentro de la región de interés seleccionada (ROI), mientras que potencias demasiado bajas o demasiado altas producirán resultados subóptimos; aquí se muestra una lesión realizada con una potencia de láser demasiado baja. La fluorescencia permaneció dentro de la ROI tras disparar el láser, lo que resultó en una transección incompleta.

Por otro lado, como se demuestra en esta figura, una potencia láser demasiado alta produjo una ablación extremadamente grande. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo montar peces cebra para experimentos de transección con láser. Realice una transección utilizando un láser de colorante con bomba de nitrógeno y evalúe la respuesta de las células circundantes mediante imágenes confocales de lapso de tiempo.