Automatizados análisis de comportamiento de alto rendimiento en larvas de pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es identificar defectos de comportamiento en las larvas de pez cebra después del tratamiento con tóxicos o productos farmacéuticos. Esto se logra recolectando y tratando primero los embriones o larvas con productos químicos hasta los primeros siete días de desarrollo. El segundo paso es hacer carriles de natación agropecuarios utilizando moldes especialmente diseñados.

A continuación, las larvas tratadas se colocan en los carriles de los agros para su análisis de comportamiento mediante fotografía time-lapse. El paso final es importar las imágenes a la imagen J y utilizar una macro específica escrita internamente para recopilar datos de coordenadas XY de las larvas en los carriles. En última instancia, el ensayo conductual de alto rendimiento se utiliza para encontrar diferencias en el comportamiento de evitación y del eje figma, así como en la velocidad de natación y el descanso entre los grupos de tratamiento.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como los disponibles comercialmente es que podemos utilizar nuestro método para observar comportamientos más complejos. También es barato de construir y fácil de configurar. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia del comportamiento, como cómo los tóxicos afectan el desarrollo y el comportamiento del cerebro durante la exposición embrionaria temprana.

También puede proporcionar información sobre defectos cerebrales sutiles en los seres humanos, que no se pueden encontrar con otras pruebas de toxicidad actuales. Por lo general, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades porque atrapar las larvas puede ser difícil. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos tienen una curva de aprendizaje, ya que el protocolo implica sistemas personalizados.

Para comenzar este procedimiento, inserte platos de vidrio Pyrex con césped artificial hecho de hilo verde en los tanques. Al amanecer, deje los platos en los tanques durante dos horas para recolectar embriones de pez cebra. Vierta los platos de vidrio que contienen los embriones sobre un colador de mano con agua desionizada.

A continuación, cultive los embriones en agua de huevo que contenga 60 miligramos por litro de océano instantáneo en agua desionizada y 0,25 miligramos por litro de azul de metileno, que se utiliza como inhibidor del moho. Los embriones pueden alojarse entre 50 y 60 larvas por 50 mililitros o en tanques de cría más grandes hasta que los embriones estén listos para ser tratados con tóxicos. Dependiendo de la hipótesis del experimento individual, los embriones pueden ser tratados inmediatamente o durante etapas específicas de desarrollo utilizando tóxicos o farmacéuticos, que generalmente se disuelven en DMSO y luego se diluyen directamente en el medio de agua de huevo.

El color azul se utiliza con fines de demostración en video durante el tratamiento embrionario y de larvas. Las larvas y los embriones pueden alojarse en placas de Petri profundas a una densidad de aproximadamente 50 a 60 larvas por 50 mililitros hasta que el análisis de comportamiento a los siete días después de la fertilización cambie la solución de agua del huevo al menos cada dos días para evitar el crecimiento de hongos o bacterias de los embriones muertos. Se fabricaron moldes de plástico para crear carriles utilizando aros, que se vierte en placas de plástico de un solo pocillo de Thermos Scientific.

Los moldes contienen cinco carriles en los que los lados tienen un ángulo de 60 grados. ¿Ve el protocolo de texto que acompaña a este video para conocer las dimensiones de los moldes y las placas? Primero, prepare los aros derritiendo 0.8%aros en agua desionizada con 60 miligramos por litro de océano instantáneo.

A continuación, genere los carriles vertiendo 50 mililitros de los aros derretidos en una sola placa de pocillo. A continuación, coloque muy lentamente el molde encima de los aros líquidos que eliminan cualquier formación de burbujas. Retira el molde cuando el aros se haya enfriado.

Los aros lanes se pueden almacenar a temperatura ambiente con las tapas en los platos hasta por 36 horas. Para el análisis de comportamiento de alto rendimiento, los gabinetes de imágenes están preparados con una cámara digital de 15 megapíxeles conectada a la parte superior del gabinete hacia abajo en la parte inferior del gabinete. Un portátil con pantalla de 15,6 pulgadas se coloca con la pantalla hacia arriba.

Para evitar el sobrecalentamiento de las larvas, lo mejor es utilizar un portátil con una temperatura de pantalla que no supere los 28 grados centígrados. Coloque un difusor de plástico encima de la pantalla del portátil en el que se colocarán las placas de agros. El difusor evitará más patrones en las imágenes recopiladas.

Para comenzar la captura de imágenes, mueva con cuidado las larvas de la placa de Petri al carril de agros para ayudar a reducir el estrés de las larvas. Se pueden colocar hasta 20 larvas en cada carril, pero normalmente se utilizan cinco larvas por carril para facilitar el seguimiento más preciso de la velocidad de nado y para reducir el número de larvas que se necesitan por experimento, llene los carriles con agua de huevo, con o sin productos farmacéuticos o tóxicos, según el experimento. No llene los carriles por completo hasta que estén colocados en los gabinetes de imágenes para evitar el desbordamiento.

Espere 10 minutos para que las larvas se aclimaten después del período de aclimatación. Coloque cuatro placas a mano directamente encima de la pantalla de la computadora portátil. En este momento, los carriles se pueden rematar con huevo, agua o tratamiento químico para que quede nivelado con la parte superior del carril para eliminar sombras en los bordes de los carriles.

En las imágenes, programe la computadora para la fotografía de lapso de tiempo, tomando fotografías cada seis segundos para un total de 300 imágenes por experimento. Configure la cámara a una resolución más baja para obtener imágenes a velocidad de video. Mientras que la resolución más baja limita las grabaciones a una sola placa de pocillos múltiples.

Las grabaciones de video son apropiadas para imágenes de eventos de natación rápida. Utilice una presentación de PowerPoint como estímulo aversivo para las larvas en esta demostración. El PowerPoint comienza con un fondo blanco en blanco durante 15 minutos, seguido de 15 de una barra roja móvil en la mitad superior del plato.

Para evitar la evaporación del líquido dentro de los carriles aros, mantenga el tiempo máximo de imagen por debajo de una hora. Abra las imágenes con la imagen J en esta demostración. Se utiliza una macro interna para el análisis de larvas de cinco carriles y puede ponerse a disposición de cualquier usuario.

Utilice las indicaciones de la macro para establecer los parámetros, como el número de imágenes y el color que se van a restar. A continuación, la macro divide automáticamente el canal de color para que se pueda eliminar el color rojo. Resta el fondo, aplica un umbral e identifica las larvas mediante análisis de partículas.

Después de que todas las imágenes se ejecuten a través de la macro J de la imagen, se mostrará un archivo de resultados que contendrá las coordenadas XY de las larvas individuales para cada imagen, junto con el número de imagen y el número de carril. Guarde el archivo de resultados en formato Excel y ordénelo en función del fondo en blanco frente al fondo de la barra móvil y, a continuación, el número de pozo. Use una plantilla de Excel que tenga ecuaciones integradas para determinar automáticamente la ubicación de las larvas en los pozos, la distancia entre ellas, la velocidad de movimiento y la cantidad de descanso.

La plantilla de Excel más reciente creada en el laboratorio de Cretin está disponible, previa solicitud, para construir gráficos que muestran varios grupos de tratamiento en la hoja de Excel, junto con la prueba T para la comparación entre grupos de tratamiento y controles. Se pueden realizar análisis estadísticos adicionales utilizando el programa estadístico SPSS. Se muestran los resultados de las larvas tratadas con agua de huevo y DMSO como controles y las concentraciones variables de un pesticida organofosforado que se encuentra comúnmente en los alimentos no orgánicos.

Aquí, las barras blancas muestran los datos de las larvas expuestas a un fondo en blanco, y las barras rojas muestran los datos de las larvas expuestas a la barra móvil roja. Control. Las larvas cultivadas en el agua de los huevos muestran una mayor preferencia por estar en el plato después de que se les presenta la barra roja en movimiento. Se obtienen resultados similares cuando las larvas se cultivan en agua de huevo que contiene un microgramo por mililitro de DMSO, un solvente que se usa comúnmente para disolver varios productos farmacéuticos y tóxicos como 1000 soluciones madre.

Los gráficos indican las mediciones que se pueden obtener del análisis de comportamiento, incluido el porcentaje de larvas en el carril, el porcentaje de larvas al final del carril, el porcentaje de larvas en el borde del carril, la distancia entre los peces, la velocidad de nado de las larvas y el porcentaje de tiempo que las larvas están en reposo. Los resultados que se muestran son una muestra de un experimento. Sin embargo, cuando se repiten, los resultados indican que la velocidad de natación y el comportamiento de las figmas se ven alterados por las bajas concentraciones de pesticidas organofosforados, que imitan los niveles en la comida humana Una vez dominados, las imágenes y el análisis de imágenes se pueden realizar en una hora y media si se realizan correctamente.

El aspecto más importante de este procedimiento es recordar mantener limpio el medio cultural reemplazándolo diariamente por un medio nuevo.