Aislamiento y Caracterización química del lípido A de bacterias gram-negativas

El objetivo general del siguiente experimento es aislar el lipopolisacárido de la superficie externa de las bacterias gramnegativas y caracterizar estructuralmente la porción de lípidos con el uso de protocolos de MS en tándem. Esto se logra mediante la extracción química de lipopolisacárido de la superficie celular bacteriana y la posterior hidrólisis ácida suave para liberar el lípido A de la porción de polisacárido del lipopolisacárido y la posterior hidrólisis ácida suave para liberar el lípido A de la porción de polisacárido del lipopolisacárido. Como segundo paso, se analiza una solución de lípido A mediante MSMS de ionización por electrospray.

En nuestro procedimiento, el lípido A se analiza mediante disociación inducida por colisión o por disociación ultravioleta basada en MS MS para la caracterización estructural. Los resultados muestran diferencias en el patrón de fragmentación en los espectros de masas producidos a partir de la disociación inducida por colisión o de los protocolos de MS basados en la fotodisociación ultravioleta, donde UVPD produce un patrón de fragmentación más informativo. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que la espectrometría de masas en tándem permite la elucidación de los analitos diana a partir de la interpretación de los patrones de fragmentación del diagnóstico.

Las fotos ultravioleta, la disociación en particular, es un método MSMS de alta energía que produce iones de fragmento más diversos que las técnicas existentes, como la disociación inducida por colisión. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el método de espectrometría de masas UVPD utilizado aún no se comercializa. Además, el método utiliza un láser que se ha integrado con un espectrómetro de masas mediante una modificación personalizada antes de comenzar este procedimiento.

Recoja las células de una centrífuga de cultivo bacteriano de 250 milésimas de pulgada a 10.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, vierta el sobrenadante del medio, lave el pellet de la celda con 50 milésimas de pulgada de un XPBS. Después de centrifugar para representar el pellet, las células vierten el sobrenadante.

A continuación, suspenda las células en 40 milésimas de pulgada de un XPBS y divídalas entre 2 tubos de centrífuga de teflón de 250 milésimas de pulgada. Agregue 25 milésimas de pulgada de cloroformo y 50 milésimas de pulgada de metanol a cada tubo para obtener una mezcla monofásica. Mezclar por inversión e incubar a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos.

Para asegurar una lisis celular completa, centrifugar la mezcla a 2000 veces G durante 20 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Lave el pellet de LPS con aproximadamente 100 milésimas de pulgada de una mezcla monofásica Bly dire. Centrifugar a 2000 veces G durante 20 minutos y desechar el sobrenadante.

Agregue 27 milésimas de pulgada de tampón de hidrólisis ácida suave al pellet de LPS y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta que solo queden pequeñas partículas que se soniquen con una punta de sonda para obtener un Resus homogéneo. Suspenda el pellet de LPS en solución en un ciclo de trabajo constante durante 20 segundos al 50% de salida. Repita la sonicación de la muestra dos veces con 20 segundos por ráfaga y aproximadamente cinco segundos entre ráfagas.

A continuación, hervir las muestras al baño maría durante 30 minutos. Retire los tubos del baño de agua y deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente. Antes de proceder a extraer el lípido A después de la hidrólisis, convierta la solución SDS en una mezcla BLY dire de dos fases agregando 30 mil de cloroformo y 30 mil de metanol para obtener una mezcla de tampón de hidrólisis de hidrólisis ácida suave y metanol de cloroformo mezclada por inversión y centrífuga.

La muestra S durante 10 minutos a 2000 veces G. Con una pipeta de vidrio, extraiga la fase inferior en un tubo de centrífuga de teflón limpio. A continuación, realice una segunda extracción añadiendo 30 milésimas de pulgada de la fase inferior de una mezcla bifásica preequilibrada a la fase superior en el tubo de muestra mezclado por inversión y centrifugar 2000 veces G durante 10 minutos. Extraiga la fase inferior con una pipeta de vidrio y piscina con la fase inferior extraída. Previamente.

Lave las fases inferiores agrupadas agregando 114 mil de fase superior bly dire preequilibrada para crear una mezcla bifásica bly dire mezclada por inversión y centrífuga. Jet 2000 veces G durante 10 minutos con una transferencia de vidrio. Pipeta. Transfiera la fase inferior a un matraz evaporador rotativo de vidrio limpio y seque la muestra mediante evaporación rotativa.

A continuación, agregue cinco milésimas de pulgada de una mezcla de metanol de cloroformo al matraz giratorio y haga sonicato de baño durante al menos 30 segundos. Para ayudar en la suspensión de lípidos A de los lados del matraz. Utilice una pipeta de transferencia de vidrio para transferir el lípido a un tubo de vidrio limpio tapado con un tapón de rosca fenólico revestido con A-P-T-F-E.

Seque la muestra bajo un chorro de nitrógeno utilizando un secador de nitrógeno. Vuelva a suspender el lípido seco en una milésima de pulgada de una mezcla de metanol con cloroformo. Después de la adición de disolvente vórtice la mezcla para asegurar una suspensión completa del resus.

Transfiera a un pequeño frasco de muestra de vidrio y seque con un secador de nitrógeno. Almacene la muestra seca a menos 20 grados centígrados hasta el análisis posterior de TLC o MS. La muestra puede almacenarse a menos 20 grados centígrados hasta su posterior análisis.

Una vez que se haya preparado la muestra, mezcle 200 microlitros de metanol de grado HPLC con 200 microlitros de cloroformo de grado HPLC en un vial de muestra de vidrio pequeño vacío, transfiera 200 microlitros de la mezcla de solvente de metanol de cloroformo al vial con lípido A y sonique el contenido del vial durante cinco minutos o hasta que todo el material se haya disuelto. A continuación, configure el espectrómetro de masas para electros de modo negativo. Ionización por pulverización: llene una jeringa de 250 microlitros con una solución lipídica.

Inserte la jeringa en una bomba de jeringa e infunda directamente el lípido diluido. Una muestra a un caudal de 2,0 a 3,5 microlitros por minuto. Optimice y mejore la señal de iones lipídicos ajustando la óptica de iones.

Recoge el espectro de masas del lípido. Una especie aísla y activa el lípido objetivo A seleccionando CID como método MSM. A continuación, aumente el voltaje CID o la energía de colisión normalizada hasta que el lípido precursor.

Una especie tiene aproximadamente un 10% de abundancia relativa en comparación con el producto más alto de adquisición de iones y el promedio de los espectros hasta que se logra una señal suficiente para el ruido. Para los iones del producto, prepare la muestra y el espectrómetro de masas como se describe en la sección anterior. Encienda el láser conectado al espectrómetro de masas.

Configure el software del instrumento para que el láser active el láser excimer cuando los iones ingresen a la celda HCD después de este encendido en el generador de pulsos de modo que el láser se pulse cada dos milisegundos. Aísle el lípido un ion precursor seleccionando HCD como el método MS MS y ajuste la energía de colisión al 1% de la energía de colisión normalizada active el ion lipídico aislado aumentando la energía del láser y ajustando el número de pulsos de láser, que generalmente es de diez y seis milijulios. Finalmente, adquiera y promedie los espectros hasta que se logre una señal suficiente para el ruido.

Para los iones del producto UVPD. El espectro de masas del ion negativo MALDI TOF del lípido A de la cepa W 3 110 de E Coli K 12 produce la única especie e desprotonada con una relación masa/carga de 1796,2 como la principal especie observada. Los detalles de maldi para el análisis se discuten dentro del protocolo de texto.

Alternativamente, la misma muestra de lípidos sometida a ESI en modo negativo produce predominantemente iones lipídicos doblemente desprotonados con una relación de carga maestra de 898,1 ly se observan iones lipídicos desprotonados con una relación de carga maestra de 1796,20, pero de menor abundancia relativa a la fragmentación de especies doblemente desprotonada por CID o 193 nanómetros. La UVPD se realizó sobre el ion lipídico desprotonado de una sola e. Estas técnicas se pueden utilizar para asignar mejor las estructuras químicas, en particular de los lípidos.

Especie que contiene combinaciones complejas de modificaciones o modificaciones químicas no caracterizadas previamente. Los perfiles de fragmentación se muestran con líneas discontinuas que representan los sitios de escisión y coinciden con los valores de la relación de carga maestra debajo de cada estructura proporcionada. Los valores de la relación de carga maestra y los sitios de escisión resaltados en fuente roja representan iones de producto únicos asociados con el lípido marcado con UVPD 32 P.

Se analizó un aislado de dos cepas diferentes de E. coli K 12 por TLC. El protocolo para este procedimiento se detalla dentro del protocolo de texto. La cepa K 12 W 3 110 contiene mayoritariamente BIS y lípidos tris fosforilados A o es un patrón de TLC más complejo que se observa con lípidos 32 p.

A aislado de la cepa de E. coli, WD 1 0 1. WD 1 0 1 produce lípidos. Un muy modificado con rabino y fosfoetanolamina.

Dado que tanto uno como cuatro fosfatos primarios están disponibles para su modificación, el lípido A de WD 1 0 1 puede describirse como modificado individualmente que contiene solo un aminoarabinosa o fosfoetanolamina en el fosfato o doblemente modificado donde ambos fosfatos se modifican de manera combinatoria. Además de la modificación en uno y cuatro fosfatos primarios, también se observa la edición de palmitato y aumenta el valor de RF de la especie lipídica a en este sistema solvente. Este protocolo ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología exploren más a fondo las relaciones de estructura y función con respecto a cómo las modificaciones lipídicas afectan la biología de las bacterias gramnegativas.

También estamos muy interesados y hemos demostrado el poder de la EM basada en UVPD para caracterizar las estructuras de moléculas biológicamente importantes, como glicanos, proteínas, ácidos nucleicos y otros lípidos complejos. No olvide que trabajar con disolventes orgánicos, materiales biológicamente peligrosos y láseres puede ser extremadamente peligroso. Es importante enfatizar que los solventes deben manipularse en campanas de gases químicos ventiladas.

Siempre se debe usar el equipo de protección adecuado, como guantes y gafas, y el láser utilizado para la UVPD debe estar debidamente protegido.