Name: Aislamiento y Caracterización química del lípido A de bacterias gram-negativas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Aprende a aislar y caracterizar el lípido A de bacterias gram-negativas mediante espectrometría de masas en tándem. Este método avanza el conocimiento sobre resistencia antibiótica y respuestas inmunitarias del hospedador.

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Este trabajo fue apoyado por becas AI064184 y AI76322 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y por Grant 61789-MA-MUR de la Oficina de Investigación del Ejército de MST investigación también fue apoyada por Welch Beca de la Fundación F1155 y NIH subvención R01GM103655 a JSB

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<li>Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+eight+lipid+A+precursors+from+a+3-deoxy-D-manno-octylosonic+acid-deficient+mutant+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).</li>
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<li>Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+NMR+spectroscopy+of+lipid+A+molecules+containing+4-amino-4-deoxy-L-arabinose+and+phosphoethanolamine+substituents.+Different+attachment+sites+on+lipid+A+molecules+from+NH4VO3-treated+Escherichia+coli+versus+kdsA+mutants+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium.</a> The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).</li>
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<li>Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+investigation+of+bacterial+lipopolysaccharides+by+mass+spectrometry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry.</a> Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).</li>
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<li>Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+addition+to+Vibrio+cholerae+LPS+establishes+a+link+between+surface+remodeling+in+gram-positive+and+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).</li>
<li>Han, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+sulfation+in+a+Gram-negative+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium.</a> Nature. 3, 1153-1110 (2012).</li>
<li>Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+phosphorylation+of+lipid+A+is+linked+to+the+synthesis+of+undecaprenyl+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate.</a> Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).</li>
<li>Galloway, S. M., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+Escherichia+coli+defective+in+the+first+step+of+endotoxin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis.</a> The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).</li>
<li>Trent, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+a+polyisoprene-linked+amino+sugar+in+polymyxin-resistant+Salmonella+typhimurium+and+Escherichia+coli%3A+structural+characterization+and+transfer+to+lipid+A+in+the+periplasm%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).</li>
<li>Chung, H. S., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxygenases+in+Burkholderia+ambifaria+and+Yersinia+pestis+that+hydroxylate+the+outer+Kdo+unit+of+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).</li>
<li>Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+A+modifications+characteristic+of+Salmonella+typhimurium+are+induced+by+NH4VO3+in+Escherichia+coli+K12.+Detection+of+4-amino-4-deoxy-L-arabinose%2C+phosphoethanolamine+and+palmitate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).</li>
<li>Raetz, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kdo2-Lipid+A+of+Escherichia+coli%2C+a+defined+endotoxin+that+activates+macrophages+via+TLR-4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+lipid+research%22%5BJournal%5D)">Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4.</a> Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).</li>
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No hay conflictos de interés declarado.

En este protocolo hemos detallado el aislamiento de especies de lípido A partir de células enteras de bacterias, y descrito TLC o métodos analíticos basados ​​en MS para caracterizar químicamente el material aislado. Tandem espectrometría de masas es una estrategia poderosa para la caracterización estructural de novo de compuestos biológicos, y tiene un valor incalculable para la caracterización química de la panoplia de moléculas de lípido A se observan en la naturaleza. CID y UVPD son dos métodos de activació...

El lipopolisacárido (LPS) es la principal molécula de la superficie exterior de casi todos los organismos gram-negativas y consiste en tres dominios moleculares: un polisacárido distal antígeno O-, un oligosacárido de núcleo, y el lípido de membrana-asociada Un dominio depositado sobre la cara externa de la 1,2 bicapa de la membrana externa. El lípido A de dominio se compone de 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosonic (KDO) y un lípido residuos de una especie molecular, en donde el lípido A puede ser definida como la porción soluble en cloroformo de LPS después de la hidrólisis suave de ácido-1, 2. El lípido estándar Una molécula puede definirse químicamente como una columna vertebral diglucosamine que es hexa-acilada y bis-fosforilado; consistente con las principales especies de lípido A observadas en el organismo modelo Escherichia coli (E. coli) 1,2. Nueve genes expresados ​​constitutivamente, conservados a lo largo de las bacterias gram-negativas, son responsables de la producción del lípido A de dominio (Figura 1) 1,2. La mayoría de las bacterias tienen un conjunto adicional de los genes, que varían en el grado de conservación filogenética, que participan en la modificación química adicional del lípido A 3. Desfosforilación, eliminación de cadenas de acilo, y la adición de restos químicos tales como amino azúcares (por ejemplo aminoarabinosa) y / o fosfoetanolamina son las actividades más comúnmente observados (Figura 1). Muchas de las enzimas responsables de lípidos Una modificación son activados directamente por señales ambientales, como cationes bivalentes, o su expresión está regulada por dos sistemas de respuesta del regulador de los componentes 3. Reconocimiento de especies de lípidos A por el sistema inmune innato de acogida está mediada por el receptor Toll-like factor de diferenciación 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) co-receptor 4. Fuerzas hidrófobas entre MD2 y el lípido A cadenas de acilo, así como entre TLR4 y los &quot;grupos 1 y 4 de fosfato de lípido A promover la fuerte asociación de labioIdentificación A con TLR4/MD2 4,5. Las modificaciones que alteran el estado de acilación o la carga negativa del lípido A de lípidos basada impacto de TLR4/MD2 Un reconocimiento y estimulación aguas abajo de la respuesta inmune innata activadores de NF-kappa B y mediadores de la inflamación tales como TNF y IL-1-β 6,7. Modificaciones que enmascaran la carga negativa del lípido A también impiden péptidos antimicrobianos catiónicos bactericidas de la unión a bacterias Gram-negativas superficies celulares 3,8. Muchas modificaciones lípido A son la hipótesis de aumentar la aptitud bacteriana bajo condiciones ambientales específicas, como en el interior del huésped humano o en un nicho ecológico. Por esta razón muchas enzimas de modificación son objetivos atractivos para el desarrollo racional de compuestos antimicrobianos. La diversidad química de las estructuras de lípido A, con respecto al organismo y / o el medio ambiente, y las implicaciones biológicas de estas diversas estructuras hacer la caracterización estructural de lípido A un esfuerzo importante en Testudie de bacterias gram-negativas. Aislamiento de moléculas de lípidos A de bacterias enteras implica la extracción de LPS de la superficie celular bacteriana, un paso hidrolítica para liberar el lípido A, seguido de un procedimiento de purificación final 9-11. El procedimiento de extracción más frecuentemente citada LPS es el procedimiento de extracción de agua caliente-fenol, primero introducido por Westphal y Jann 10. Después de toda la extracción de LPS se somete a hidrólisis leve de ácido, que separa químicamente Kdo de la 6&#39;-hidroxilo del azúcar glucosamina distal del lípido A (Figura 1). Existen numerosas trampas para el procedimiento de agua caliente-fenol incluyendo el uso de un reactivo de alta peligrosidad, la necesidad de degradar ácidos co-extraídos nucleicos y proteínas, y varios días se requieren para completar el protocolo 10. Nuestro laboratorio ha desarrollado aún más la extracción y aislamiento de lípido A como el desarrollado por primera vez por Caroff y Raetz 12,13. En comparación con los procedimientos de agua caliente-fenol, el método presentado aquí es más rápida y eficiente, y se adapta a una amplia gama de volúmenes de cultivo de 5 ml a múltiples litros. Por otra parte, a diferencia de las extracciones de agua caliente de fenol, nuestro método no selecciona para rugosas o lisas-tipos de LPS, proporcionando una óptima recuperación de las especies de lípidos A. En nuestro protocolo, lisis química de las células bacterianas enteras se lleva a cabo utilizando una mezcla de cloroformo, metanol y agua, donde LPS pueden ser un sedimento por centrifugación. Una combinación de hidrólisis ácida suave y extracciones con disolvente (Bligh-Dyer) se utilizan para liberar lípido A de polisacárido unido covalentemente. El método de Bligh y Dyer se aplicó primero a la extracción de especies de lípidos a partir de una variedad de animales y tejidos vegetales 14, modificado aquí para separar polisacárido hidrolizado de lípido A. En esta etapa de separación final, cloroformo lípidos solubles particionan selectivamente en la parte baja orgánica fase. Para purificar más lípido A, fase inversa ocromatografía de columna de intercambio aniónico se puede utilizar 12. Después del aislamiento de la especie A de lípidos a partir de células enteras, un número de métodos de análisis se puede utilizar para caracterizar la estructura química del material aislado tales como RMN, TLC, y el análisis basado en MS. RMN permite no destructivo elucidación estructural y proporciona detalles estructurales relacionados con enlaces glucosídicos, la asignación inequívoca de posiciones de la cadena de acilo, y la asignación de sitios de unión para los lípidos modificaciones A como aminoarabinosa o fosfoetanolamina 15-17. El análisis de RMN de lípido A no se discute dentro de nuestro protocolo, pero se ha descrito adecuadamente en otras partes 15,16. Para un rápido análisis TLC basan métodos se utilizan con frecuencia, pero no proporcionan información directa sobre la estructura química fina. Protocolos basados ​​MS son el método más frecuentemente utilizado para caracterizar las estructuras lipídicas A 18,19. Matriz asociada desorción láser de ionización (MALDI)-MS se utiliza a menudo para estudiar inicialmente las especies intactas lípido. Iones de una sola carga se generan a partir del analito preparado de acuerdo con nuestros procedimientos de extracción. Como se requiere un análisis estructural más bien, los métodos basados ​​en MS / MS prueban más informativo que MALDI-MS. Junto a ionización por electrospray (ESI) de lípidos simple o múltiple cobrará un iones precursores son aún más fragmentado por disociación inducida por colisión (CID) o fotodisociación ultravioleta (UVPD), para generar iones producto estructuralmente informativos 18,20,21. Productos para bajar de Neutrales de lípido A iones precursores también se generan con frecuencia durante ESI-MS proporciona una capa adicional de información estructural. Espectrometría de masas en tándem (MS / MS) ha demostrado ser un método indispensable y versátil para la elucidación de las estructuras de lípido A. Durante MS / MS, los iones se activan para producir un patrón de fragmentación de diagnóstico que se puede utilizar para elucidar la estructura del ión precursor. El que más se available método MS / MS es CID. Este método produce fragmentos de iones a través de colisiones de la ión precursor seleccionado con un gas inerte de destino, lo que resulta en la deposición de energía que conduce a la disociación. CID ha demostrado ser una herramienta importante en la asignación de la estructura del lípido A para una amplia gama de especies bacterianas 22-33. Aunque CID es el método más universalmente aplicado MS / MS, se genera un conjunto limitado de iones de productos. 193 nm UVPD es una alternativa y un método de MS / MS complementaria. Este método utiliza un láser para irradiar iones, y la absorción de fotones resulta en la activación de los iones y posterior disociación. Esta energía superior técnica de MS / MS produce una gama más diversa de iones producto que CID y por lo tanto proporciona patrones de fragmentación más informativos. En particular, UVPD proporciona información sobre los cambios sutiles en las especies de lípidos A con base en divisiones en glicosídico, amina, acilo y CC bonos ligados 18,21,34.

<table><tbody><tr><td>Cloroformo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C607</td><td>Metanol de grado HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>Botellas de centrífuga de teflón FEP</td> de grado HPLC <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-562-21</td><td></td></tr><tr><td>Gel de sílice 60 placas TLC</td><td>EMD Biosciences</td><td>5626-6</td><td></td></tr><tr><td>Papel de cromatografía de grado No. 3MM</td><td>Whatman</td><td>3030700</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de masas Orbitrap Elite</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>ExciStar XS, Excimer, Lasrer</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emisores PicoTip Nanospray ESI</td><td>Nuevos Objetivos</td><td></td><td>&#8805; 30 &mu; m para reducir la obstrucción</td></tr><tr><td>Modelo 505 Generador de pulsos/retardo</td><td>Berkeley Nucleonics Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa caliente Thermoylne 2200</td><td>Barnstead/Thermolyne</td><td>HPA2235MQ</td><td></td></tr><tr><td>16x125 mm GPI 15-415 Tubos de cultivo de borosilicato desechables roscados</td><td>Corning Pyrex</td><td>99449-16X</td><td></td></tr><tr><td>Tapones de rosca de PTFE roscados reutilizables GPI 45-415</td><td>Corning</td><td>9999-152</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Imagen Molecular Personal (Phosphorimager)</td><td>BioRad</td><td>170-9400</td><td></td></tr><tr><td>Cassette de autorradiografía</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FBCS810</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorscreen SO230</td><td>Kodak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptide Mass Standards Kit</td><td>Sequazyme</td><td>P2-3143-00</td><td></td></tr><tr><td>Sonificador S250-A</td><td>Branson</td><td>101063196</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml 12x32 mm Vial de rosca de tornillo de base cónica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C4000-V1</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización química del lípido a de bacterias gram-negativas

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

El lipopolisacárido (LPS) es la principal molécula de la superficie celular de las bacterias gram-negativas, depositado sobre la cara externa de la bicapa de la membrana externa. LPS se pueden subdividir en tres dominios: el O-polisacárido distal, un oligosacárido de núcleo, y el lípido A de dominio que consiste en un lípido una especie molecular y residuos de ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosonic (KDO). El dominio lípido A es el único componente esencial para la supervivencia celular bacteriana. Después de su síntesis, el lípido A se modifica químicamente en respuesta a las tensiones ambientales tales como el pH o la temperatura, para promover la resistencia a compuestos antibióticos, y para evitar el reconocimiento por los mediadores de la respuesta inmune innata de acogida. El siguiente protocolo se detalla el aislamiento escala pequeña y gran del lípido A de bacterias gram-negativas. Material aislado después se caracteriza químicamente por cromatografía en capa fina (TLC) o la espectrometría de masa (MS). Además de láser asistida por matriz de desorción / ionización de tiempo de fluz (MALDI-TOF) de MS, también describe los protocolos MS en tándem para el análisis de los lípidos una especie molecular usando ionización por electrospray (ESI) acoplado a disociación inducida por colisión (CID) y recién empleados fotodisociación ultravioleta métodos (UVPD). Nuestros protocolos MS permiten la determinación inequívoca de la estructura química, de suma importancia para la caracterización de moléculas de lípido A que contienen las modificaciones químicas únicas o nuevas. También describimos el marcaje con radionúclidos, y el posterior aislamiento, del lípido A de las células bacterianas para el análisis por TLC. Relativa a los protocolos basados ​​en MS, la TLC proporciona un método de caracterización más económica y rápida, pero no se puede utilizar para asignar de forma inequívoca lípido A las estructuras químicas sin el uso de normas de estructura química conocida. En las últimas dos décadas el aislamiento y caracterización de lípido A ha dado lugar a numerosos descubrimientos interesantes que han mejorado nuestra comprensión de la fisiología de las bacterias gram-negativas, los mecanismos de resistencia a los antibióticoscia, la respuesta inmune innata humana, y han proporcionado a muchos nuevos objetivos en el desarrollo de compuestos antibacterianos.

Lípido A de E. canónica coli y Salmonella enterica serovar Typhimurium es un disacárido hexa-acilada de glucosamina con grupos fosfato en las posiciones 1 - y 4 &#39;posiciones. Durante el crecimiento en medios ricos (por ejemplo, caldo de Luria) una porción del lípido A contiene un grupo pirofosfato en la posición 1 produciendo una especie-tris fosforilada 36 (Figura 1). Kdo (-D-manno-octulosonic 3-desoxi ácido), está unido en la 6&#39;-h...

Aislamiento y caracterización del dominio lípido A del lipopolisacárido (LPS) de las bacterias gram-negativas proporciona información sobre los mecanismos de la superficie celular a base de resistencia a los antibióticos, la supervivencia bacteriana y la forma física, y cómo químicamente diversa lípido A las especies moleculares modulan diferencialmente acogida la respuesta inmune innata.

Aislamiento y Caracterización química del lípido A de bacterias gram-negativas

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

El objetivo general del siguiente experimento es aislar el lipopolisacárido de la superficie externa de bacterias gramnegativas y caracterizar estructuralmente la porción de lípido A mediante el uso de protocolos de espectrometría de masas en tándem. Esto se logra mediante la extracción química del lipopolisacárido desde la superficie celular bacteriana y una posterior hidrólisis ácida suave para liberar el lípido A de la porción polisacarídica del lipopolisacárido. Como segundo paso, se analiza una solución de lípido A mediante espectrometría de masas en tándem con ionización por electrospray.En nuestro procedimiento, el lípido A se analiza mediante disociación inducida por colisión o disociación fotoinducida por ultravioleta basada en MS/MS para la caracterización estructural. Los resultados muestran diferencias en los patrones de fragmentación en los espectros de masas obtenidos a partir de protocolos de MS/MS basados en disociación inducida por colisión o disociación fotoinducida por ultravioleta, donde UVPD produce un patrón de fragmentación más informativo. La ventaja principal de esta técnica frente a los métodos existentes es que la espectrometría de masas en tándem permite

isolation-chemical-characterization-lipid-from-gram-negative

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Se describe una modificación acuosa caliente-fenol método de extracción para la purificación de lipopolisacárido (LPS) de bacterias Gram-negativas. Una vez extraído, el LPS puede ser seguidamente analizadas por SDS-PAGE y se visualizaron mediante tinción directa o inmunotransferencia Western.

La purificación y la visualización de lipopolisacárido de bacterias Gram-negativas por Hot acuosa de fenol-Extracción

Este video muestra la separación de ácidos micólicos basada en cromatografía de capa fina. Esta técnica separa los diferentes ácidos micólicos (lípidos de cadena larga presentes en la pared celular de las micobacterias) en función de su polaridad.

Separación de variantes de ácido micólico basada en cromatografía de capa fina: un método para separar los lípidos de la pared celular micobacteriana en función de la polaridad

La pared celular bacteriana está compuesta de peptidoglicano, una red macromolecular de hebras de azúcar reticuladas por péptidos. La cromatografía líquida de ultra rendimiento proporciona alta resolución y rendimiento para nuevos descubrimientos de la composición de peptidoglicanos. Presentamos un procedimiento para el aislamiento de las paredes celulares (sacculi) y su posterior preparación para su análisis a través de UPLC.

Aislamiento Y Preparación De Paredes Celulares Bacterianas Para El Análisis Compositiva Por Cromatografía Líquida De Ultra Rendimiento

El enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas con una fase de tensioactivo no iónico, método de partición se describe para su uso directo en los ensayos de TLR u otras aplicaciones. Otras medidas se detallan para preparar N-terminal tríptico lipopéptidos caracterización estructural por espectrometría de masas.

Enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas y preparación de lipopéptidos N-terminal para la determinación estructural por espectrometría de masas

Este método proporciona un marco para el estudio de la incorporación de ácidos grasos exógenos de fuentes huésped complejas en membranas bacterianas, particularmente Staphylococcus aureus. Para lograrlo, se describen los protocolos para el enriquecimiento de partículas de lipoproteínas a partir de la yema de huevo de pollo y el posterior perfilado de ácidos grasos de fosfolípidos bacterianos utilizando espectrometría de masas.

Aislamiento de partículas de lipoproteínas de yema de huevo de pollo para el estudio de la incorporación de ácidos grasos patógenos bacterianos en fosfolípidos de membrana

Las bacterias gramnegativas producen dos membranas segregadas espacialmente. La membrana externa se divide a partir de la membrana interna por una periplasma y una capa de peptidogglicano. La capacidad de aislar las bicapas duales de estos microbios ha sido fundamental para entender su fisiología y patogénesis.

Separación del sobre celular para bacterias gramnegativas en fracciones de membrana interna y externa con ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii

Se presenta un protocolo para extraer el contenido total de lípidos de la pared celular de una amplia gama de micobacterias. Además, se muestran protocolos de extracción y análisis de los diferentes tipos de ácidos micólicos. También se proporciona un protocolo cromatográfico de capa delgada para monitorear estos compuestos micobacterianos.

Análisis de la composición lipídica de micobacterias por cromatografía de capa delgada

Radical basado en la química biomimética ha sido aplicada a bibliotecas de hasta edificio-necesarias para el desarrollo de biomarcadores.

Radicales Libres en Biología Química: del comportamiento químico al desarrollo de biomarcadores

origami de ADN es un poderoso método para fabricar objetos precisos a nanoescala mediante la programación del autoensamblaje de moléculas de ADN. Aquí describimos un protocolo para el plegamiento de un robot bio-sensible a partir de origami de ADN, su purificación y tinción negativa para la transmisión de imágenes microscópicas electrónicas (TEM).

Plegable y caracterización de un Robot Bio-sensible de ADN Origami

El protocolo descrito en el presente documento tiene como objetivo explicar y limite los numerosos obstáculos en el camino de la ruta intrincada que conduce a trifosfatos de nucleósidos modificados. En consecuencia, este protocolo facilita tanto la síntesis de estos bloques de construcción activados y su disponibilidad para las aplicaciones prácticas.

Nucleósidos Trifosfatos - De la síntesis a la Caracterización bioquímica

Aprende a aislar y caracterizar el lípido A de bacterias gram-negativas mediante espectrometría de masas en tándem. Este método avanza el conocimiento sobre resistencia antibiótica y respuestas inmunitarias del hospedador.

Aislamiento y Caracterización química del lípido A de bacterias gram-negativas

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