Aislamiento y Caracterización química del lípido A de bacterias gram-negativas

El objetivo general del siguiente experimento es aislar el lipopolisacárido de la superficie externa de bacterias gramnegativas y caracterizar estructuralmente la porción de lípido A mediante el uso de protocolos de espectrometría de masas en tándem. Esto se logra mediante la extracción química del lipopolisacárido desde la superficie celular bacteriana y una posterior hidrólisis ácida suave para liberar el lípido A de la porción polisacarídica del lipopolisacárido. Como segundo paso, se analiza una solución de lípido A mediante espectrometría de masas en tándem con ionización por electrospray.

En nuestro procedimiento, el lípido A se analiza mediante disociación inducida por colisión o disociación fotoinducida por ultravioleta basada en MS/MS para la caracterización estructural. Los resultados muestran diferencias en los patrones de fragmentación en los espectros de masas obtenidos a partir de protocolos de MS/MS basados en disociación inducida por colisión o disociación fotoinducida por ultravioleta, donde UVPD produce un patrón de fragmentación más informativo. La ventaja principal de esta técnica frente a los métodos existentes es que la espectrometría de masas en tándem permite la elucidación de analitos objetivo basándose en la interpretación de patrones diagnósticos de fragmentación.

Las fotos ultravioleta, en particular la disociación, son un método de MS/MS de alta energía que produce iones fragmento más diversos que las técnicas existentes, como la disociación inducida por colisión. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el método de espectrometría de masas por PUV no está comercializado aún. Además, el método utiliza un láser que se ha integrado a un espectrómetro de masas mediante una modificación personalizada antes de comenzar este procedimiento.

Recoger las células de un cultivo bacteriano de 250 ml, centrifugar las células a 10,000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Luego, desechar el sobrenadante del medio, lavar el botón celular con 50 ml de PBS 1X. Después de centrifugar para reponer el botón celular, desechar el sobrenadante.

A continuación, resuspenda las células en 40 mil de un XPBS y divídalas entre 2 tubos de centrífuga de teflón de 250 mil. Añada 25 mil de cloroformo y 50 M de metanol a cada tubo para obtener una mezcla homogénea de una sola fase. Mezcle mediante inversión e incube a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos.

Para asegurar una lisis celular completa, centrifugue la mezcla a 2000 veces G durante 20 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante. Lave el precipitado de LPS con aproximadamente 100 mil de una mezcla monofásica de Bly dire. Centrifugue a 2000 veces G durante 20 minutos y deseche el sobrenadante.

Añada 27 ml de tampón de hidrólisis ácida suave al precipitado de LPS y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta que solo queden partículas pequeñas; sonique con una punta de sonda para resuspender homogéneamente. Suspenda el precipitado de LPS en solución a un ciclo de trabajo constante durante 20 segundos al 50 % de potencia. Repita la sonicación de la muestra dos veces, con 20 segundos por impulso y aproximadamente cinco segundos entre impulsos.

Luego, hierva las muestras en un baño de agua durante 30 minutos. Retire los tubos del baño de agua y deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente. Antes de proceder a extraer el lípido A tras la hidrólisis, convierta la solución de SDS en una mezcla bifásica BLY dire añadiendo 30 mil de cloroformo y 30 mil de metanol para obtener una mezcla tampón de cloroformo-metanol con hidrólisis ácida suave, mezcle por inversión y centrifugue.

Centrifugue la muestra S durante 10 minutos a 2000 veces G. Mediante una pipeta de vidrio, extraiga la fase inferior en un tubo de centrífuga limpio de teflón. A continuación, realice una segunda extracción añadiendo 30 ml de la fase inferior de una mezcla bifásica de bly dire previamente equilibrada a la fase superior en el tubo de muestra, mezcle por inversión y centrifugue a 2000 veces G durante 10 minutos. Extraiga la fase inferior con una pipeta de vidrio y reúna con la fase inferior extraída previamente.

Lave las fases inferiores reunidas añadiendo 114 ml de la fase superior de bly dire previamente equilibrada para crear una mezcla bifásica de bly dire, mezcle por inversión y centrifugue a 2000 × g durante 10 minutos con una pipeta de transferencia de vidrio. Transfiera la fase inferior a un matraz limpio de evaporador rotatorio de vidrio y seque la muestra mediante evaporación rotatoria.

A continuación, agregue cinco mililitros de una mezcla de cloroformo-metanol al matraz rotatorio y sométalo a sonicación en baño durante al menos 30 segundos para ayudar a la suspensión del lípido A desde las paredes del matraz. Utilice una pipeta de transferencia de vidrio para transferir el lípido a un tubo de vidrio limpio con tapón roscado fenólico revestido de P-T-F-E.

Seque la muestra bajo una corriente de nitrógeno utilizando un secador de nitrógeno. Re_suspenda el lípido seco en un mililitro de una mezcla de cloroformo-metanol. Después de añadir el disolvente, agite la mezcla en vórtex para asegurar una resuspensión completa.

Transferir a un vial de vidrio pequeño y secar utilizando un secador de nitrógeno. Almacenar la muestra seca a menos 20 grados Celsius hasta su posterior análisis por TLC o MS. La muestra puede almacenarse a menos 20 grados Celsius hasta su posterior análisis.

Una vez que la muestra ha sido preparada, mezcle 200 microlitros de metanol grado HPLC con 200 microlitros de cloroformo grado HPLC en un vial de vidrio pequeño vacío; transfiera 200 microlitros de la mezcla de disolvente cloroformo-metanol al vial con el lípido A y someta el contenido del vial a sonicación durante cinco minutos o hasta que todo el material se haya disuelto. A continuación, prepare el espectrómetro de masas para ionización por electrospray en modo negativo y llene una jeringa de 250 microlitros con la solución de lípido A.

Introduzca la jeringa en una bomba de jeringa e infunda directamente el lípido diluido. Una muestra a un caudal de 2,0 a 3,5 microlitros por minuto. Optimice y mejore la señal iónica del lípido ajustando la óptica de iones.

Recolecte el espectro de masas del lípido. Aísle y active el lípido A diana seleccionando CID como método de MS/MS. A continuación, aumente el voltaje CID o la energía de colisión normalizada hasta el lípido precursor.

Una especie tiene una abundancia relativa de aproximadamente el 10 % en comparación con el ion producto más abundante; adquiera y promedie los espectros hasta alcanzar una relación señal-ruido suficiente. Para los iones producto, prepare la muestra y el espectrómetro de masas como se describió en la sección anterior. Encienda el láser conectado al espectrómetro de masas.

Véase el protocolo escrito para los detalles de MS; configure el software del instrumento de modo que el láser active el láser de excímero cuando los iones entren en la celda HCD. A continuación, encienda el generador de pulsos para que el láser emita una pulsación cada dos milisegundos. Isole el ión precursor de lípido A seleccionando HCD como método de MS/MS y ajuste la energía de colisión al 1 % de energía de colisión normalizada. Active el ión de lípido aislado aumentando la energía del láser y ajustando el número de pulsos láser, lo cual normalmente corresponde a diez pulsos de seis milijulios. Finalmente, adquiera y promedie los espectros hasta alcanzar una relación señal-ruido suficiente.

Para los iones producto de la UVPD. El espectro de masas en modo MALDI TOF de iones negativos de lípido A procedente de la cepa E Coli K 12 W 3 110 produce la especie desprotonada sencilla a una relación masa a carga de 1796,2 como la especie mayoritaria observada. Los detalles del análisis MALDI TOF se discuten en el protocolo del texto.

Alternativamente, la misma muestra de lípido sometida a ESI en modo negativo produce predominantemente iones lipídicos doblemente desprotonados con una relación masa/carga principal de 898,1; los iones lipídicos desprotonados simples con una relación masa/carga principal de 1796,20 son observables, pero con menor abundancia relativa respecto a las especies doblemente desprotonadas. La fragmentación por CID o UVPD a 193 nanómetros se realizó sobre el ion lipídico simple desprotonado. Estas técnicas pueden utilizarse para asignar mejor las estructuras químicas, particularmente de lípidos.

Una especie que contiene combinaciones complejas de modificaciones o modificaciones químicas previamente no caracterizadas. Los perfiles de fragmentación se muestran con líneas discontinuas que representan los sitios de escisión y se comparan con los valores de relación de carga principal indicados debajo de cada estructura proporcionada. Los valores de relación de carga principal y los sitios de escisión resaltados en fuente roja representan iones producto únicos asociados con el lípido marcado con 32 P por UVPD.

Se analizó mediante TLC un A aislado de dos cepas diferentes de E. coli K-12. El protocolo para este procedimiento se detalla en el protocolo de texto. La cepa K-12 W3110 contiene principalmente lípido A bis y tris fosforilado, o se observa un patrón de TLC más complejo con lípido 32P.

A aislada de la cepa de E. coli WD 1 0 1. WD 1 0 1 produce lípidos. A fuertemente modificada con rabino y fosfoetanolamina.

Dado que tanto el fosfato en posición uno como el en posición cuatro están disponibles para su modificación, el lípido A de WD 1 0 1 puede describirse como modificados de forma simple, conteniendo únicamente un aminoarabinosa o fosfoetanolamina en uno de los fosfatos, o como doblemente modificados, donde ambos fosfatos están modificados de manera combinatoria. Además de las modificaciones en los fosfatos en posición uno y cuatro, también se observa la adición de palmitato, lo que aumenta el valor de RF de las especies de lípido A en este sistema de disolvente. Este protocolo ha allanado de forma única el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología exploren más a fondo las relaciones entre estructura y función respecto a cómo las modificaciones del lípido A afectan la biología de las bacterias gramnegativas.

También estamos muy interesados y hemos demostrado la potencia de la MS basada en UVPD para caracterizar las estructuras de moléculas biológicamente importantes, como glicanos, proteínas, ácidos nucleicos y otros lípidos complejos. No olvide que trabajar con disolventes orgánicos, materiales biológicamente peligrosos y láseres puede ser extremadamente peligroso. Es importante destacar que los disolventes deben manipularse en campanas extractoras químicas ventiladas.

Siempre se debe usar equipo de protección adecuado, como guantes y gafas, y el láser utilizado para la UVPD debe estar debidamente protegido.