Name: Establecimiento de un In vitro Sistema para estudiar el comportamiento intracelular de Candida glabrata En humanos THP-1 macrófagos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T20:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Aprende a establecer un modelo in vitro para estudiar el comportamiento intracelular de Candida glabrata en macrófagos THP-1 humanos. Este protocolo permite evaluar mecanismos de virulencia y respuestas inmunitarias.

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Este trabajo fue apoyado por el innovador Biotechnologist Premio Joven BT/BI/12/040/2005 y concesión BT/PR13289/BRB/10/745/2009 del Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India y los fondos centrales del Centro de impronta genética y Diagnóstico, Hyderabad. MNR y GB son los destinatarios de tercer y cuarto año de becas de investigación del Consejo de Investigación Científica e Industrial hacia la búsqueda de un título de doctorado de la Universidad Manipal. SB es el destinatario de Junior y Senior Research Fellowship del Departamento de Biotecnología hacia la búsqueda de un título de doctorado de la Universidad Manipal.

Se recomienda llevar a cabo C. glabrata infección experimentos en un laboratorio con nivel de contención de bioseguridad 2 (BSL-2). <ol><li> Preparación de células THP-1 macrófagos monocapa. </li><li> Preparación de C. suspensión de células glabrata. </li><li> La infección de las células THP-1 macrófagos con C. células glabrata. </li><li> Medición de la tasa de fagocitosis y la replicación intracelular a través de la formación de colonias de ensayo unidad. </li><li> Monitoreo de la replicación intracelular usando microscopía confocal de barrido láser. </li></ol> 1. Preparación de células THP-1 de macrófagos de la capa monomolecular <ol><li> THP-1 es una línea celular de monocitos humanos derivados de la sangre periférica de un hijo varón de 1 año de edad, que sufre de leucemia monocítica aguda 14. THP-1, una línea de células en suspensión, se mantiene habitualmente a 37 ° C en humidificado 5% de CO 2 en medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS (suero fetal bovino). El tratamiento con forbol 12-myristaTE 13-acetato (PMA, un éster de forbol) resulta en la diferenciación terminal de células THP-1 células monocíticas en macrófagos. Es importante destacar que, PMA tratamiento no afecta a la viabilidad celular y las células diferenciadas no se dividen. </li><li> Semilla de aproximadamente 1,5 x 10 6 monocitos THP-1 en placas de 100 mm de cultivo en medio RPMI-1640 medio completo (medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero, glutamina 2 mM y 1x antibióticos; 10 ml / placa) y dejar que las células crezcan a 37 ° C en 5% de CO 2 durante 2 días. </li><li> Una vez que las células THP-1 han alcanzado una densidad de 8 x 10 5 células / ml, transvasar la placa de cultivo a la campana de flujo laminar cultivo celular y mezcle suavemente para resuspender las células asentadas. </li><li> Pipetear la suspensión celular, coloque en un tubo estéril de 15 ml y centrifugar a 1000 rpm (130 xg) durante 4 min. Desechar el sobrenadante y suspender THP-1 pellet de células en 5 ml precalentado, medio completo fresco, RPMI-1640. </li><li> Enumerar las células con un hemocitómetro y se diluye la cell de suspensión a una densidad final de 10 6 células / ml con medio RPMI completo precalentado-1640 </li><li> Añadir 1 l de 160 mM de stock de PMA (forbol solución de 13-acetato de 12-miristato preparado en sulfóxido de dimetilo) a 10 ml de THP-1 suspensión de células (concentración final 16 nM) y mezclar bien. Dispensar 1 ml de suspensión celular en cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos y se incuba la placa en la incubadora se mantiene a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 12 horas. </li><li> Retire el medio viejo, añadir 1 ml precalentado RPMI-1640 completo y permiten que las células se recuperen durante 12 horas a 37 ° C en 5% de CO 2. </li><li> Observar las células bajo un microscopio invertido para asegurar que las células THP-1 monocitos de forma ovalada en suspensión se han diferenciado en aplanados, macrófagos en forma de huso y adherentes. Estas células diferenciadas están ahora listos para llevar a cabo C. estudios de infección glabrata. </li></ol> 2. Preparación de C. glabrata &amp; #Suspensión celular; 160 C. glabrata cepa de tipo salvaje Bg2 será utilizado para infectar macrófagos THP-1. C. glabrata células son cultivadas rutinariamente en líquido YPD (extracto de levadura (1%)-peptona (2%)-dextrosa (2%)) medio. Medio YPD sólido se prepara mediante la adición de 2% de agar antes de medio de tratamiento en autoclave. <ol><li> Para preparar un cultivo de C. glabrata, escoja una sola colonia a partir de la placa de agar con un asa estéril, desechable e inocular en medio líquido 10 ml de YPD e incubar durante 14-16 horas con agitación (200 rpm) a 30 ° C. </li><li> Centrífuga de esta cultura (1 ml) a 4000 rpm (1800 xg) durante 5 minutos en una microcentrífuga de mesa, lavar las células tres veces con PBS (solución salina tamponada con fosfato, pH 7.4) estéril y suspender sedimento celular en 1 ml de PBS. </li><li> Mida OD 600 de C. suspensión de células glabrata y diluir con un volumen apropiado de PBS estéril para obtener una densidad de 2 x 10 6 células / ml (OD 600= 0,1). Alternativamente, la densidad celular deseada se puede lograr mediante el recuento de células de levadura usando un hemocitómetro. </li></ol> 3. La infección de las células THP-1 macrófagos con C. Las células glabrata <ol><li> Añadir 50 l C. glabrata suspensión de células de macrófagos THP-1 (10 6 células sembradas por pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos) para obtener una MOI (multiplicidad de infección) de 0,1 y se incuba la placa a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Para determinar el recuento de levaduras viables, diluir 50 l C. glabrata de células en suspensión de 100 veces en PBS estéril y la placa 100 l en medio sólido YPD. Incubar las placas a 30 ° C y contar manualmente el número de colonias de levadura que aparecen después de 1-2 días. Estos números, en adelante, se denominarán como 0 hr C. glabrata UFC (unidades formadoras de colonia). </li><li> Después de 2 horas de cocultivo THP-1 células con C. células glabrata, medio de cultivo de los descartes mediante la inversión de 24 pocillos placa de cultivo de tejidos ina depósito y lavar suavemente tres veces con PBS estéril precalentada para eliminar nonphagocytosed extracelular C. células glabrata. Lavados suaves con PBS son absolutamente esenciales para lograr la eliminación completa de toda la levadura extracelular sin causar ningún daño a la THP-1 macrófagos monocapa. </li></ol> 4. Medición de la fagocitosis tarifas y replicación intracelular a través de formación de colonias de ensayo Unidad <ol><li> Lyse C. glabrata infecta macrófagos THP-1 en 1 ml de H 2 O estéril durante 2 minutos, raspar suavemente para eliminar los restos de los macrófagos del pozo y recoger lisado celular en un tubo de microcentrífuga. Verificación microscópica de la lisis de los macrófagos completa es fundamental para la recuperación de toda la levadura interiorizado. </li><li> Prepare una dilución de 100 veces de lisado en PBS estéril, placa 100 l en medio sólido YPD y se incuban las placas a 30 ° C. </li><li> Después de 1-2 días, contar manualmente el número de C. glabrata colonias que appeared en medio YPD, se multiplican con factor de dilución (2 hr UFC) y calcular la tasa de fagocitosis, que se refiere al porcentaje de C. células glabrata que son ingeridos por THP-1 macrófagos después de la coincubación 2 h utilizando la siguiente fórmula. % De fagocitosis = [(CFU a las 2 h) / (UFC en 0 h)] X 100 </li><li> Para medir la tasa de replicación intracelular de C. células glabrata en THP-1 macrófagos, recogen levaduras intracelulares en diferentes puntos de tiempo después de la infección, es decir. 4, 6, 8, 10, 12, y 24 horas, por pasos 3.3 a 4.3 repetir. </li><li> Calcular veces la supervivencia / replicación de C. células glabrata en THP-1 macrófagos dividiendo las UFC totales en cualquier punto de tiempo dado con los de 2 horas (levadura fagocitados). </li></ol> 5. Seguimiento de intracelular replicación mediante confocal LasER Scanning Microscopy <ol><li> Si sigue los pasos descritos en la sección 1, las semillas tratadas con PMA 5 x 10 5 células THP-1 en cada pocillo de dos portaobjetos de cámara de cuatro pocillos y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 12 horas. </li><li> Sustituya el medio viejo con RPMI-1640 completo precalentado y permiten que las células se recuperen de PMA tratamiento durante 12 horas. </li><li> Preparar GFP (proteína fluorescente verde)-etiquetados C. suspensión celular glabrata como se describe en la Sección 2 e infectar a los macrófagos THP-1 a una MOI de 1. Si C. glabrata cepas que expresan GFP no están disponibles, células de levadura etiquetadas con FITC (isotiocianato de fluoresceína) se pueden utilizar para supervisar los eventos tempranos después de la infección a saber. tasa de fagocitosis y la maduración fagolisosómico a las 2 horas. </li><li> Incubar los portaobjetos durante 2 horas a 37 ° C con 5% de CO 2, invierta cuidadosamente para descartar medio y lavar 3 veces con estéril precalentado PBS. </li><li> Añadir 500 l precalentado RPMI-1640 medi completaum a cada cámara de un porta y se incuba que a 37 º C con CO2 al 5% durante 22 horas. </li><li> Para solucionar 2 hr C. infectados por glabrata THP-1 macrófagos, añadir 500 l de 3,7% de formaldehído (preparado en PBS) a cada cámara del otro porta y se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad. </li><li> Lave deslice tres veces con PBS, añadir 500 l de Triton-X (0,7%), y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min en la oscuridad. </li><li> Lave 3x diapositivas con PBS, retire la cámara de diapositivas cultura y el aire seco durante 3-5 minutos en la oscuridad. </li><li> Monte cuidadosamente un cubreobjetos utilizando medio de montaje Vectashield que contiene DAPI (4 &#39;,6-diamino-2-fenilindol) en la diapositiva evitando la formación de burbujas. Retire suavemente el exceso de líquido con Kimwipe y sellar los bordes cubreobjetos con esmalte de uñas. Diapositiva tienda en la oscuridad a 4 ° C hasta su uso. </li><li> Repita los pasos 5.4 y 5.6 a 5.9 para procesar las células THP-1 24 horas después de la infección. </li><li> Células de imagen mediante una confo escaneo láserCal microscopio (60X objetivo de inmersión en aceite, excitación a 405 nm y 488 nm para DAPI y las manchas de GFP, respectivamente). </li></ol>

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<li>Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+leukemia+cell+line%2C+THP-1%3A+a+multifacetted+model+for+the+study+of+monocyte-macrophage+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation.</a> Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).</li>
<li>Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+maturation+in+cultured+human+monocytic+leukemia+cells+by+a+phorbol+diester%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester.</a> Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).</li>
<li>Castaño, I., Kaur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn7-based+genome-wide+random+insertional+mutagenesis+of+Candida+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata.</a> Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Sistema inmune innato desempeña un papel importante en el control de las infecciones fúngicas oportunistas. Los macrófagos contribuyen a antifúngica defensa por ingestión y destrucción del hongo patógeno. Por lo tanto, la elucidación de los factores que se requieren para la supervivencia y / o contrarrestar las funciones antimicrobianas de macrófagos avanzará nuestra comprensión de las estrategias de virulencia de hongos. En este contexto, hemos establecido un sistema in vitro modelo de cultivo celular en e...

Las especies de Candida son la causa principal de las infecciones fúngicas invasivas potencialmente mortales en pacientes inmunodeprimidos 1. Candida glabrata, un patógeno nosocomial emergente, es la segunda o tercera especie más frecuentemente aislada de Candida procedentes de pacientes de la Unidad de Cuidado Intensivo, dependiendo de la ubicación geográfica 1-3. Filogenéticamente, C. glabrata, una incipiente levadura haploides, está más estrechamente relacionado con los Saccharomyces no modelo de la levadura patógena cerevisiae que al patógeno Candida spp. incluyendo C. albicans 4. Consistente con esto, C. glabrata carece de algunos rasgos de virulencia fúngicas clave, incluyendo el apareamiento, la actividad proteolítica secretada y plasticidad morfológica 4-5. Aunque C. glabrata no forma hifas, puede sobrevivir y replicarse en macrófagos murinos y humanos 6-8 lo que sugiere que se ha desarrollado mecanismos de la patogénesis únicas. Hay poca información acerca de las estrategias que C. glabrata emplea para sobrevivir intracelular entorno macrófagos pobre en nutrientes y contrarrestar oxidativo y respuestas de acogida no oxidativos montados por las células inmunes del huésped 5. Un modelo de sistema de macrófagos pertinente es un requisito previo para delimitar la interacción de C. glabrata con células fagocíticas de acogida a través de enfoques de genómica y proteómica funcionales. Células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y los macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) de origen humano y murino, respectivamente, han sido utilizados anteriormente para estudiar la interacción de C. glabrata con las células inmunitarias del huésped 7,9. Sin embargo, la dificultad en la obtención de PBMC y BMDMs, su tiempo de vida limitado y la variación intrínseca entre las diferentes donantes de mamíferos restringen la utilización de estas células como sistemas de modelos versátiles. Aquí se describe un método para la creación de un sistema in vitro para estudiar el intracellulcomportamiento ar de C. células glabrata en los macrófagos derivados de monocitos humanos línea celular THP-1. El objetivo general de este protocolo fue promulgar un sistema modelo de cultivo celular simple, barata, rápida y reproducible que puede ser fácilmente manipulado para estudiar diferentes aspectos de la interacción patógeno-huésped fúngica. Las células THP-1 se han utilizado previamente para descifrar la respuesta inmune del huésped contra una amplia gama de patógenos, incluyendo bacterias, virus, y hongos 10-12. Células monocitos THP-1 son fáciles de mantener y pueden ser diferenciados, tratamiento previo de éster de forbol, a los macrófagos que imitan los macrófagos derivados de los monocitos de humano y expresan marcadores de macrófagos apropiados 13. Las principales ventajas de la THP-1 sistema de modelo de macrófagos son la facilidad de uso y la falta de equipo sofisticado requisito. El protocolo que se presenta aquí es fácilmente adaptable para estudiar la interacción de otros hongos patógenos humanos con hoscélulas T inmunes. El procedimiento actual también se puede emplear para identificar los factores de virulencia para el patógeno de interés utilizando pantallas de mutantes de alto rendimiento. Esta prueba de concepto fue ejemplificado por el uso exitoso de THP-1 sistema de modelo de cultivo para identificar un conjunto de 56 genes que son necesarios para la supervivencia de C. glabrata en los macrófagos humanos 8.

<table><tbody><tr><td>THP-1 Colección de</td><td>cultivos tipo americano</td><td>TIB 202</td><td>Línea celular de leucemia monocítica aguda humana</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td>Para el mantenimiento de células THP-1</td></tr><tr><td>Forbol 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 8139</td><td>Precaución: Peligroso</td></tr><tr><td>YPD&nbsp;</td><td>BD-Difco</td><td>242710</td><td>Para el cultivo de células Candida glabrata</td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Para la fijación de macrófagos THP-1 infectados con C. glabrata</td></tr><tr>Tampón salino<td>tamponado con fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td>Tampón (137 mM de NaCl, 10 mM de fosfato, 2,7 mM de KCl, pH 7,4) para lavados</td></tr><tr><td>Citrato salino-sódico (SSC)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tampón (3 M de NaCl, 0,3 M de citrato de sodio para una concentración de 20x) para lavados</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de prehibridación <td>Tampón (50% de formamida, 5x Denhardt' s, 5x SSC, 1% SDS) para hibridación</td></tr><tr><td>VECTASHIELD</td><td>medio de montaje Vector Labs</td><td>H-1200</td><td>Para el montaje de portaobjetos para microscopía confocal</td></tr><tr><td>32P-marcado &alpha;-dCTP</td><td>JONAKI-BARC</td><td>LCP-102</td><td>Para el radiomarcaje de etiquetas de firma Placas de cultivo de</td></tr><tr><td>tejidos de 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Para cultivar células THP-1 Placa de</td></tr><tr><td>cultivo de tejidos de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>3527</td><td>Para realizar estudios de infección por C. glabrata en macrófagos THP-1</td></tr><tr><td>portaobjetos de vidrio tratado con cultivo de tejidos de 4 cámaras</td><td>BD Falcon</td><td>REF354104</td><td>Ir a la imagen C. glabrata macrófagos THP-1 infectados</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Rohem India</td><td></td><td>Para la enumeración de células</td></tr><tr><td>Microcentrífuga de mesa</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 18</td><td>Para el centrifugado de células en microtubos</td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Remi</td><td>R-8C</td><td>Para el centrifugado de células en tubos de 15 ml</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Amersham Biosciences</td><td>Ultraspec 10</td><td>Para controlar la absorbancia de las células de levadura</td></tr><tr><td>Incubadora de placas</td><td>Labtech</td><td>Refrigerada</td><td>Para cultivar células C. glabrata Incubadora</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>New Brunswick</td><td>Innova 43</td><td>Para cultivar células C. glabrata Incubadora</td></tr> de <tr><td>CO2&nbsp;</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>Forma serie 2</td><td>Para cultivar células THP-1</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Carl Ziess</td><td>Ziess LSM 510 meta</td><td>Para observar macrófagos THP-1 infectados con C. glabrata microscopio compuesto</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>CKX 41</td><td>Para observar macrófagos C. glabrata y THP-1</td></tr><tr><td>Máquina de PCR</td> Motor de <td>ADN</td><td>BioRad</td><td>Para amplificar etiquetas únicas de entrada y salida de ADN genómico</td></tr><tr><td>Horno de hibridación</td><td>Labnet</td><td>Problot 12S</td><td>Para hibridación&nbsp;</td></tr><tr><td>PhosphorImager</td><td>Fujifilm</td><td>FLA-9000</td><td>Para el escaneo de membranas hibridadas</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td>Para la desnaturalización de etiquetas de firma radiomarcadas Unidad de documentación de</td></tr><tr><td>gel</td><td>Alphainnontech Alphaimager</td><td></td><td>Para visualizar el ADN teñido con bromuro de etidio en geles de agarosa</td></tr></tbody></table>

establecimiento de un<em&gt; in vitro</em&gt; sistema para estudiar el comportamiento intracelular de<em&gt; candida glabrata</em&gt; en humanos thp-1 macrófagos

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Un sistema de modelo de cultivo celular, si un cierre sinóptico de las condiciones ambientales de acogida, puede servir como una alternativa económica, reproducible y fácilmente manipulable para sistemas de modelos animales para el estudio de un paso específico de la infección por patógenos microbianos. Una línea celular de monocitos humanos THP-1 que, tras el tratamiento del éster de forbol, se diferencia en macrófagos, que anteriormente se ha utilizado para estudiar las estrategias de virulencia de muchos patógenos intracelulares, incluyendo Mycobacterium tuberculosis. Caso, hablamos de un protocolo para promulgar un modelo in vitro de cultivo celular en sistema utilizando macrófagos THP-1 para delinear la interacción de un patógeno oportunista humano levadura Candida glabrata con células fagocíticas anfitrión. Este modelo de sistema es simple, rápido, susceptible de mutante pantallas de alto rendimiento, y no requiere de equipo sofisticado. Un típico THP-1 macrófagos infección experimento tarda aproximadamente 24 horas con un 24 a 48 horas más para permitir intracelular recuperadolevadura para crecer en medio rico para formación de colonias análisis de viabilidad basado en unidades. Al igual que otros sistemas de modelos in vitro en, una posible limitación de este enfoque es la dificultad en la extrapolación de los resultados obtenidos a un complejo altamente circuitos de célula inmune existente en el huésped humano. Sin embargo, a pesar de esto, el protocolo actual es muy útil para dilucidar las estrategias que un hongo patógeno puede emplear para evadir / anula la respuesta a los antimicrobianos y sobrevivir, adaptarse y proliferar en el ambiente pobre en nutrientes de las células inmunitarias del huésped.

Analiza Infección del PMA tratados THP-1 macrófagos con C. células de tipo salvaje glabrata (en peso) revelaron que las células wt fueron fagocitados por los macrófagos a una velocidad de 55-65% después de 2 horas coincubación. Además, C. células glabrata podían resistir a la destrucción por macrófagos THP-1 y se les realizó un moderado 5 - al aumento de 7 veces en el UFC después de 24 h de cocultivo con macrófagos THP-1 8. La replicación intracelular de las célula...

El presente artículo describe un protocolo para establecer un sistema modelo de cultivo celular in vitro para estudiar la interacción de un hongo patógeno intracelular facultativo humano Candida glabrata con macrófagos humanos que será una herramienta útil para avanzar en el conocimiento de los mecanismos de virulencia de hongos.

Establecimiento de un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudiar el comportamiento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En humanos THP-1 macrófagos

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

El objetivo general de este procedimiento es establecer un sistema de cultivo in vitro para estudiar el comportamiento intracelular de un patógeno fúngico oportunista humano. Candida labratta en macrófagos derivados de la línea celular monocítica humana TP one. Para lograrlo, primero se trata a los monocitos THP one con cuatro éster para diferenciarlos en macrófagos.A continuación, los macrófagos THP-1 se infectan con células de Candida GTA dos horas postinfección. Las células de Candida GTA no fagocitadas se eliminan mediante lavados con PBS y las células intracelulares se recuperan para estudios posteriores por osmótisis de los macrófagos infectados. Este protocolo puede utilizarse para evaluar tanto la entrada viral de células de Candida GTA en macrófagos como la maduración del faismo y la respuesta de citocinas en macrófagos THP-1 tras la infección por Candida GTA.Además, este protocolo puede ampliarse para analizar la biblioteca de mutantes del colaborador Candida en busca de perfiles de supervivencia alterados en macrófagos TSP1 de manera semicuantitativa de alto rendimiento. La principal ventaja de este protocolo es que es relativamente económico, altamente reproducible y fá

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

En este video, realizamos el ensayo de fagocitosis microglial para el neuroblastoma utilizando células madre pluripotentes inducidas. El ensayo ayuda a evaluar el deterioro de la función microglial en enfermedades neurodegenerativas.

Ensayo de fagocitosis microglial: un ensayo in vitro para establecer un modelo de fagocitosis microglial para células de neuroblastoma utilizando macrófagos iPSC

En este video, demostramos el ensayo de eferocitosis para estudiar el aclaramiento de células apoptóticas utilizando microscopía confocal. La eferocitosis es un proceso de varios pasos en el que las células apoptóticas son engullidas por fagocitos y degradadas dentro de vesículas llamadas eferosomas. Este protocolo proporciona un método para visualizar porciones internalizadas y no internalizadas de células apoptóticas individuales y cuantificar la eferocitosis.

Ensayo de eferocitosis de células fijas: un método para estudiar la absorción eferocítica de células apoptóticas por macrófagos mediante microscopía de fluorescencia

Este video muestra un ensayo para cuantificar el crecimiento intracelular de parásitos en macrófagos derivados de la médula ósea (BMM). Las células macrófagas están infectadas con los estadios invasivos móviles y no móviles de Leishmania, promastigotes metacíclicos y amastigotes, respectivamente. Los parásitos invaden los macrófagos, se internalizan en una vacuola parasitófora y se multiplican en su interior. El crecimiento intracelular del parásito se cuantifica utilizando un microscopio tras...

Un ensayo in vitro para cuantificar el crecimiento intracelular de parásitos en macrófagos

Se describen métodos para la microscopia de vídeo en vivo de células...

Vídeo en vivo de células Microscopía de fagocitosis hongo patógeno

Efferocytosis, la eliminación fagocítica de células apoptóticas, es necesaria para mantener la homeostasis y es facilitada por receptores y vías de señalización que permiten el reconocimiento, la inmersión y la internalización de células apoptóticas. Adjunto, presentamos un protocolo de microscopía de fluorescencia para la cuantificación de efferocytosis y la actividad de vías de señalización de efferocytic.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Aquí se presenta un protocolo para detectar la producción de trampaextracelular de macrófagos (MET) en el cultivo de células vivas mediante microscopía y tinción de fluorescencia. Este protocolo se puede ampliar aún más para examinar marcadores específicos de proteína MET mediante la tinción de inmunofluorescencia.

Estimulación in Vitro y visualización de la liberación de trampas extracelulares en macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados

El mecanismo asociado con la fagocitosis en la infección por Leishmania sigue siendo poco conocido. Aquí, describimos métodos para evaluar los eventos tempranos que ocurren durante la interacción de Leishmania con las células huésped.

Investigación de la fagocitosis de Leishmania mediante microscopía confocal

La técnica que implica la fagocitosis de conidios fúngicos por macrófagos es ampliamente utilizada para estudios que evalúan la modulación de las respuestas inmunes contra hongos. El propósito de este manuscrito es presentar un método para evaluar la fagocitosis y la capacidad de depuración de macrófagos mononucleares de sangre periférica humana estimulados con conidios de Trichoderma stromaticum .

Ensayo de viabilidad de conidios de Trichoderma stromaticum dentro de macrófagos mononucleares derivados de sangre periférica humana

Los monocitos y macrófagos son células inmunitarias muy plásticas y reprogramables cruciales para la salud y la enfermedad. Perciben y responden a una amplia gama de estímulos mediante la adopción de programas de diferenciación y fenotipos específicos. Hemos estandarizado un modelo in vitro para estudiar la polarización y reprogramación de los macrófagos, proporcionando una herramienta valiosa para la investigación.

Modelo de reprogramación de macrófagos derivados de monocitos humanos para ensayos in vitro

Aprende a establecer un modelo in vitro para estudiar el comportamiento intracelular de Candida glabrata en macrófagos THP-1 humanos. Este protocolo permite evaluar mecanismos de virulencia y respuestas inmunitarias.

Establecimiento de un In vitro Sistema para estudiar el comportamiento intracelular de Candida glabrata En humanos THP-1 macrófagos (Video) | JoVE Journal

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