Establecimiento de un

El objetivo general de este procedimiento es establecer un sistema de cultivo in vitro para estudiar el comportamiento intracelular de un patógeno fúngico oportunista humano. Candida labratta en macrófagos derivados de la línea celular monocítica humana TP one. Para lograrlo, primero se trata a los monocitos THP one con cuatro éster para diferenciarlos en macrófagos.

A continuación, los macrófagos THP-1 se infectan con células de Candida GTA dos horas postinfección. Las células de Candida GTA no fagocitadas se eliminan mediante lavados con PBS y las células intracelulares se recuperan para estudios posteriores por osmótisis de los macrófagos infectados. Este protocolo puede utilizarse para evaluar tanto la entrada viral de células de Candida GTA en macrófagos como la maduración del faismo y la respuesta de citocinas en macrófagos THP-1 tras la infección por Candida GTA.

Además, este protocolo puede ampliarse para analizar la biblioteca de mutantes del colaborador Candida en busca de perfiles de supervivencia alterados en macrófagos TSP1 de manera semicuantitativa de alto rendimiento. La principal ventaja de este protocolo es que es relativamente económico, altamente reproducible y fácilmente adaptable a diferentes células inmunitarias, así como a patógenos fúngicos. Para iniciar el procedimiento, dos días antes de la infección, lleve las células monocíticas THP-1 al 80 % de confluencia el día uno, retire el medio de cultivo y agregue lentamente, con suavidad, medio fresco para poner todas las células adherentes en suspensión.

Transfiera la suspensión de células mononucleares de DHP a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugue la suspensión celular a temperatura ambiente durante cuatro minutos a 1000 RPM. Deseche el medio en un recipiente para desechos, añada cinco ml de medio pre API al tubo y reuspenda. Reuspenda el sedimento celular de THV mediante pipeteo suave del medio tres o cuatro veces.

Tome 10 microlitros de la suspensión celular para determinar la densidad celular utilizando un hemocitómetro y ajuste la densidad celular a un millón de células por ml. Añada un microlitro de una solución stock de PMA de 60 micromolar a la suspensión celular para obtener una concentración final de 16 nanomolar y mezcle bien. Distribuya un ml de la suspensión celular, correspondiente a un millón de células, en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos y colóquela en un incubador ajustado a 37 grados Celsius y 5 %CO2.

Después de 12 horas de incubación, deseche el medio antiguo. Añada un ml de medio pre RPI a cada pocillo e incube la placa durante otras 12 horas. Estas células se utilizarán para la Infección en Canada atory, que se mostrará más adelante.

Utilizando prácticas microbiológicas adecuadas, inocule una colonia única de EA en un matraz que contenga medio YPD ML. Incube el matraz durante 14 a 16 horas en un incubador ajustado a 30 grados Celsius. Tras la incubación, centrifugue un mL de cultivo a 4.000 RPM durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante y lave las conchas tres veces con PBS estéril. Después de desechar el tampón de lavado, suspenda la paleta de células en un ml de PBS estéril mediante pipeteo suave. A continuación, mida la absorbancia de la suspensión celular en un espectrofotómetro a 600 nanómetros y ajuste la densidad celular a 2 millones de células por ml con PBS.

Tome 50 microlitros de la suspensión celular y diluya cien veces en PBS. Siembre por extensión 100 microlitros de cultivo en medio YPD AGA. Incube la placa a 30 grados Celsius y cuente el número de colonias que aparecieron en la placa YPD después de uno o dos días; multiplique este número por el factor de dilución correspondiente para calcular las unidades formadoras de colonias a la hora cero. Esta cantidad de unidades formadoras de colonias de Canada Reta se utilizará para infectar DHE en macrófagos.

En el siguiente paso, agregue 50 µL de suspensión de células Canada clater a la monocapa de macrófagos en una placa de cultivo de 24 pocillos. Agite suavemente la placa para distribuir uniformemente las células y luego incube a 37 °C durante dos horas. Deseche el medio invirtiendo la placa de cultivo sobre un recipiente. A continuación, agregue cuidadosamente 1 ml de PBS tamponado a cada pocillo de la placa de cultivo, lavando los pocillos exhaustivamente, y deseche luego el tampón.

Repita este paso otras dos veces. A continuación, excepto en el primer pocillo, agregue un mL de medio RPI a todos los demás pocillos, lo cual puede utilizarse para monitorear la replicación intracelular de las células de candida atory a las 4, 6, 12 y 24 horas posteriores a la infección. Para recuperar las células intracelulares después de dos horas de infección de macrófagos, agregue un mL de agua de cereal al pocillo fos. Después de dos minutos, raspe suavemente el pocillo con la punta de pipeta de un mL para eliminar los restos de macrófagos del pocillo.

Lave el pocillo y recoja el lisado en un tubo de centrífuga macro. Prepare una dilución cien veces mayor del lisado de células microFIT en PBS y siembre cien microlitros en medio YPD AGA. Incube la placa a 30 grados Celsius durante uno o dos días y cuente el número de unidades formadoras de colonias.

Multiplicar este número por el factor de dilución apropiado para enumerar la cantidad de células de canida ator fagocitadas por T dos y macrófagos tras dos horas de infección. De manera similar, la cantidad de células de canida ator intracelulares puede determinarse en diferentes puntos de tiempo. La postinfección y la replicación intracelular pueden representarse como un aumento en las 24 horas en comparación con las UFC internalizadas a las dos horas, mostradas aquí.

Otros resultados de un experimento típico en el que el número total de células de canida gator infectadas a macrófagos TV uno es seis veces 10, dos por cuatro. El número de células recuperadas a las dos horas es 3,7, seis veces 10,4. Esto demuestra que las células e son fagocitadas a una tasa del 62,66 % durante el período de coincubación de 24 horas.

Pueden replicarse células al distintas de una multiplicación por 5,2 cuando el número de células e intracelulares aumentó de 3,76 veces 10,4 a 1,96 veces 10,5. En este experimento, la replicación intracelular de células canida TER también puede evaluarse utilizando células E que expresan GFP mediante microscopía confocal para ello. Prepare e infecte células THV y macrófagos en una placa de cuatro cámaras utilizando el protocolo descrito anteriormente para la placa de cultivo de 24 pocillos.

Dos horas después de la infección. Deseche el medio invirtiendo la laminilla en un recipiente de desecho y agregue 500 microlitros de PBS a cada cámara de la laminilla. Enjuague bien y deseche el PBS.

Repita este paso dos veces más con 500 microlitros de formaldehído al 3,7 % para fijar las células. Incube la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos y deseche el formaldehído. Lave cada pocillo con 500 microlitros de PBS para permeabilizar los macrófagos; tras una incubación de cinco minutos con 500 microlitros de Triton X, retire el Triton X y lave el pocillo con PBS.

Desensamble cuidadosamente la cámara de la portaobjetos utilizando una herramienta de remoción de cámaras y una portaobjetos con corredor de aire. Coloque una gota de medio de montaje Vector Shield que contenga DPI en cada sector de la portaobjetos, coloque una cubreobjetos y selle los bordes con esmalte de uñas. Visualice las células bajo un microscopio confocal. Aquí se muestran imágenes confocales representativas de macrófagos TP uno infectados con GFE que expresan el tipo silvestre de canida. Células de laboratorio: un aumento de seis veces en el número de células intracelulares entre las 2 y las 24 horas indica la replicación de canida en macrófagos TP uno. El enfoque de mutagénesis con etiqueta de firma se utiliza ampliamente para identificar factores de virulencia en patógenos microbianos, en el cual un gran número de mutantes se criban simultáneamente en busca de defectos de crecimiento mediante una etiqueta de secuencia de oligonucleótidos única.

Aquí describimos nuestro protocolo para la pantalla STM de la Biblioteca Canadá y la biblioteca de mutantes, que consta de los tres pasos siguientes. Primero, 96 plásmidos, cada uno portando una secuencia única de oligonucleótidos, se inmovilizan sobre una membrana de nailon.

En el segundo paso, se analiza un grupo de 96 mutantes de CANIDA ator en busca de perfiles de supervivencia alterados en macrófagos THV uno, seguido por la recuperación de células mutantes e internalizadas en macrófagos cultivadas en YPD, que se denominarán muestras de entrada y salida, respectivamente. Por último, las etiquetas de ADN marcadoras se amplifican mediante PCR y se radiomarcan a partir de las muestras de ADN genómico de entrada y salida. El producto de PCR se hibrida con etiquetas únicas y las señales radiactivas en la membrana se cuantifican y analizan.

Para ensamblar el aparato de placa de 96 x 12 puntos, coloque una membrana de nailon húmeda encima de un papel absorbente humedecido y apriete los tornillos de la unidad. Lave la membrana con agua estéril, seguido de un lavado con hidróxido de sodio 0,4 µ. Transfiera 200 nanogramos de solución de ADNp PLA desde la placa de 96 x 12 a los pozos correspondientes del aparato de puntos, tras un lavado con hidróxido de sodio 0,4 molar.

Retire la membrana del aparato de sangre en punto después de una diferencia en dos XXSC que cruzan el ADNb transferido al plasma hacia la membrana en un cruzador de UV. Incube las membranas en tampón de prehibridación antenal y en botellas UNE durante dos horas a 42 grados Celsius. Prepare sondas radiomarcadas mediante PCR utilizando ADN genómico extraído de paletas de células de entrada y salida y cebadores frente a la región flanqueante invertida de las etiquetas únicas.

Deshacer las sondas marcadas con radioisótopos a 99 grados Celsius durante cinco minutos y enfriar rápidamente en hielo. Transferir las sondas desnaturalizadas a los frascos de entrada y salida e incubar de 14 a 16 horas a 42 grados Celsius. Posthibridación.

Lave las membranas de entrada y salida según lo descrito en el protocolo. Saque las membranas de los frascos, déjelas secar al aire y expóngalas a una pantalla de imágenes fosfo. Después de dos a tres horas, escanee la pantalla de fósforo y adquiera las imágenes.

En este ejemplo, se muestran dos filtros de membrana hibridados, lo que representa el cribado de un grupo de 96 mutantes de Canida Gatory para detectar una supervivencia alterada. En el caso de los macrófagos, la cuantificación y la determinación de la relación de intensidad de señal de cada punto en la membrana de salida respecto a la de entrada revelaron que los números de etiqueta 13, 26, 75 y 85 están subrepresentados en la salida. Estas colonias están circundadas en rojo y reflejan el crecimiento de cuatro mutantes diferentes.

En contraste, los mutantes con secuencias únicas 11 y 81 resaltadas en verde están sobrerrepresentados en la muestra de salida. En otras palabras, a partir de esta pantalla, en un grupo de 96 mutantes, dos mutantes deberían aumentar la supervivencia, mientras que cuatro mutantes muestran crecimiento en macrófagos. Los fenotipos de supervivencia alterados identificados en una pantalla de este tipo deben verificarse mediante ensayos de infección individual.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo implementar un sistema oral in vitro para estudiar el perfil de crecimiento intra del patógeno fúngico de su interés. Además, debería ser capaz de realizar cribados a gran escala de bancos de mutantes utilizando ahora este sistema.