Establecimiento de un In vitro Sistema para estudiar el comportamiento intracelular de Candida glabrata En humanos THP-1 macrófagos

El objetivo general de este procedimiento es establecer un sistema modelo de cultivo in vitro para estudiar el comportamiento intracelular de un patógeno fúngico oportunista humano. Canida lab ratta en macrófagos derivados de la línea celular monocítica humana TP one. Para lograr esta THP, primero se tratan los monocitos con cuatro ésteres para diferenciarlos en macrófagos.

A continuación, los macrófagos THP uno se infectan con células GTA canida dos horas después de la infección. Las células GTA de la cánida no fagocitosa se eliminan mediante lavadores PBS y las células e intracelulares se recuperan para estudios posteriores mediante ósmosis de macrófagos infectados. Este protocolo se puede utilizar para evaluar tanto el virus de las células GTA de canida en macrófagos, como la maduración de faiz Ross y la respuesta de citocinas en THP en macro FIDS tras la infección por GTA por candida.

Además, este protocolo se puede ampliar para examinar la biblioteca de mutantes colaboradores de Candida en busca de perfiles de supervivencia alterados en macrófagos TSP one de una manera de rendimiento semi alto. La principal ventaja de este protocolo es que es relativamente barato, altamente reproducible y fácilmente adaptable a diferentes células inmunitarias, así como a patógenos fúngicos. Para comenzar el procedimiento dos días antes de la infección, lleve THP y células monocíticas al 80% de CO el primer día, elimine el riesgo de cultivo y lenta y suavemente ponga en suspensión todas las células sutiles.

Transfiera la suspensión de una célula de monocitos DHP a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrífuga La célula suspensión a temperatura ambiente Durante cuatro minutos A 1000 RPM Deccan el medio en un contenedor de residuos a cinco ml de medio pre API en el tubo y reus. Suspenda el pellet de una celda de THV pipeteando suavemente el medio tres cuatro veces.

Tome 10 microlitros de la suspensión celular para determinar la densidad celular usando un hemocitómetro y ajuste la densidad celular a 1 millón de células por ml. Agregue un microlitro de una solución madre de PMA de 60 micromolares a la suspensión celular para que la concentración final sea de 16 ano molar y mezcle bien. Dispense un ml de suspensión celular correspondiente a 1 millón de células en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos y transfiéralo a una incubadora configurada a 37 grados centígrados y 5% de CO2.

Después de 12 horas de incubación, deseche el medio viejo. Agregue un ml de medio pre RPI a cada pocillo e incube la placa durante otras 12 horas. Estas células se utilizarán para la infección canadiense, que se mostrará más adelante.

Utilizando las prácticas microbiológicas adecuadas, inocule una sola colonia de EA en un medio que contenga ML YPD. Incubar el frasco durante 14 a 16 horas en una incubadora configurada a 30 grados centígrados después de la centrífuga de incubación. Un cultivo ML a 4.000 rpm durante cinco minutos.

Deseche la sup natin y lave las cáscaras tres veces con PBS estéril. Después de desechar el tampón de lavado, suspenda la paleta de células en un ml de PBS estéril mediante un pipeteo suave. A continuación, mida la absorbancia de la suspensión celular en un fotómetro espectrométrico a 600 nanómetros y ajuste la densidad celular a 2 millones de celdas por ml con PBS.

Tome 50 microlitros de la suspensión celular y diluya cien veces en la placa de propagación PBS un cultivo de cien microlitros en medio YPD AGA. Incubar la placa a 30 grados centígrados y contar el número de colonias que aparecieron en la placa YPD después de uno o dos días, multiplique este número por el factor de dilución apropiado para calcular las unidades formadoras de colonias de cero horas. Estas numerosas unidades formadoras de colonias de Canada Reta se utilizarán para infectar DHE en macrófagos.

En el siguiente paso, agregue 50 macrolitros de suspensión de células de clater de Canadá a la capa mono de macrófagos en una placa de cultivo de 24 ballenas. Entierra la placa para distribuir uniformemente cada celda e incuba a 37 grados centígrados después de dos horas de incubación. Deseche el medio invirtiendo la placa de cultivo en un recipiente en cada pocillo de la placa de cultivo en ml PBS en serie con cuidado a lo largo del costado de los pocillos a fondo y deseche el tampón.

Repite este paso dos veces más. A continuación, a excepción del primer pocillo, agregue un medio ML RPI a todos los demás pocillos, que se puede usar para monitorear la replicación intracelular de las células cándidas a las 4, 6, 12 y 24 horas después de la infección para recuperar las células E intracelulares después de dos horas de infección por macrófagos, agregue un ML de agua de cereal al fósforo. Bueno, después de dos minutos, raspe el pozo suavemente con la punta de un ML para eliminar los restos de macrófagos del pozo.

Enjuague el pocillo y recoja el ly en un tubo de pescado macro centri. Prepare una dilución cien veces mayor de lisado celular microFIT en PBS y coloque cien microlitros en medio YPD AGA. Incubar la placa a 30 grados centígrados durante uno o dos días y contar el número de unidades formadoras de colonias.

Multiplique este número por el factor de dilución apropiado para enumerar el número de células canidatorias que son fagocitadas por T dos y macrófagos después de dos horas de infección. Del mismo modo, el número de células canidatorias intracelulares se puede determinar en diferentes puntos temporales. La postinfección y la replicación intracelular se pueden representar como un aumento en las 24 horas en comparación con las UFC internalizadas a las dos horas que se muestran aquí.

Otros resultados de un experimento típico en el que el número total de células de cocodrilo infectadas con macrófagos TV uno es seis veces 10, dos por cuatro. El número de células recuperadas a las dos horas es 3,7, seis veces 10,4. Esto ilustra que las células e se fagocitan a una tasa del 62,66% durante el período de coincubación de 24 horas.

El número de células intracelulares aumentó de 3,76 veces 10,4 a 1,96 veces 10,5. En este experimento, la replicación intracelular de las células TER de cánidos también se puede evaluar utilizando células E que expresan GFP mientras se microscopía confocal para esto. Prepare e infecte el THV y los macrófagos en un portaobjetos de cuatro cámaras utilizando el protocolo descrito anteriormente para la placa de cultivo de 24 pocillos.

Dos horas después de la infección. Deseche el medio invirtiendo el portaobjetos en un contenedor de residuos a 500 microlitros de PBS en cada cámara del portaobjetos. Enjuague bien y deseche el PBS.

Repita este paso dos veces más a 500 microlitros de 3.7% de altura formal para fijar las celdas. Incubar el portaobjetos a temperatura ambiente durante 20 minutos y desechar el portaobjetos formal. Lave el precio de cada pozo con PBS de 500 microlitros para movilizar los macrófagos a 500 microlitros de tritón X después de cinco minutos de incubación, retire Triton X lave el pozo con PBS.

Desmonte con cuidado la corredera de la cámara mediante la extracción de la cámara y la corredera del jinete de aire. Coloque una gota de medio de montaje vectorial Shield que contenga DPI en cada sector de la montura deslizante, un cubreobjetos y selle los bordes con celdas visualizadas de pintura de uñas bajo un microscopio confocal. Aquí se muestran las imágenes confocales representativas de macrófagos TP one infectados con GFE que expresan células de laboratorio canida de tipo salvaje Un aumento de aproximadamente seis veces en el número de células E intracelulares de dos a 24 horas es indicativo de la replicación de laboratorio de canida en el enfoque de mutagénesis de etiquetas de firma de macrófagos TP One es ampliamente utilizado para identificar factores de ulencia en patógenos microbianos en los que un gran número de mutantes se examinan simultáneamente para detectar defectos de crecimiento a través de oligonucleótidos únicos etiqueta de secuencia.

Aquí describimos nuestro protocolo para la pantalla STM de la Biblioteca de Canadá y la biblioteca mutante, que consiste en seguir tres pasos. Primeros 96 plásmidos. Cada uno de los cuales alberga una pila de secuencia de oligonucleótidos única se inmoviliza en una membrana de nailon.

En el segundo paso, se examina un grupo de 96 mutantes CANIDA ator para detectar perfiles de supervivencia alterados en macrófagos THV one, seguido de la recuperación de células e mutantes YPD, cultivadas y macrófagos internalizadas, que se denominarán muestras de entrada y salida, respectivamente. Por último, las etiquetas de firma de ADN se amplifican por PCI y se etiquetan por radio a partir de muestras de ADN genómico de entrada y salida. El producto de PCR se hibrida en etiquetas únicas y se cuantifican y analizan las señales radiactivas en la membrana.

Para ensamblar el aparato de tablero de puntos 96 12, coloque una membrana de nailon húmeda encima de un papel de árbol de viento de intercambio húmedo y apriete los tornillos de la unidad. Lave la membrana con agua estéril, seguido de un lavado con hidróxido de sodio de 0,4 mu. Transfiera 200 nanogramos de solución de PLA BDNA del bloque 96 12 a los pocillos correspondientes de la aplicación de sangre de puntos Después de un lavado de hidróxido de sodio de 0,4 molares.

Retire la membrana del aparato sanguíneo de puntos después de una consulta en dos XXSC que cruzan el BDNA plasmático transferido a la membrana en un reticulante UV. Incubar las membranas en pre hibridación antenal, tampón e insumo y botellas UNE durante dos horas a 42 grados centígrados. Prepare sondas de nivel de radio por PCR utilizando ADN genómico extraído de paletas de células de entrada y salida y cebadores contra la región flanqueante invertida de etiquetas únicas.

Desnaturalice las sondas de la etiqueta de radio a 99 grados centígrados durante cinco minutos y coloque el gel en hielo. Transfiera las sondas a los frascos de entrada y salida e incube durante 14 a 16 horas a 42 grados centígrados. Post hibridación.

Lave las membranas de entrada y salida como se describe en el protocolo. Saque las membranas de las botellas, séquelas al aire y expóngalas a una pantalla de imágenes de fosfo. Después de dos o tres horas, escanee la pantalla de fósforo y adquiera imágenes.

En este ejemplo, se muestran dos filtros de membrana hibridados, que representan el cribado de un grupo de 96 mutantes de Gatory para una supervivencia alterada. En el caso de los macrófagos, la cuantificación y la determinación de la relación entre la intensidad de la señal de cada punto de la salida y la membrana de entrada revelaron que los números de etiqueta 13, 26, 75 y 85 están infrarrepresentados en la salida. Estas pilas están rodeadas de rojo y reflejan el crecimiento de cuatro mutantes diferentes.

Por el contrario, la pila de mutantes con las secuencias únicas 11 y 81 resaltadas en verde están sobrerrepresentadas en la muestra de salida. En otras palabras, desde esta pantalla, el grupo de 96 mutantes, dos mutantes deberían aumentar la supervivencia, mientras que cuatro mutantes muestran un crecimiento en los macrófagos. Los fenotipos de supervivencia alterados identificados en un cribado de este tipo deben verificarse en ensayos de infección únicos.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo promulgar un sistema oral in vitro para estudiar el perfil de crecimiento intra del patógeno fúngico de su interés. Además, ahora debería poder realizar un cribado de grupos de mutantes a gran escala utilizando el sistema.