Análisis de contenido de ácido graso y Composición en microalgas

El objetivo general de este procedimiento es medir el contenido total y la composición de ácidos grasos en microalgas. Esto se logra primero preparando una muestra que contiene una cantidad conocida de biomasa de algas liofilizadas. El segundo paso consiste en romper la biomasa microalgal.

A continuación, se extraen y aíslan los componentes lipofílicos. El paso final consiste en la transesterificación de los lípidos de ACell en ésteres metílicos de ácidos grasos. Finalmente, se utiliza cromatografía de gases para cuantificar los ácidos grasos.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como las determinaciones de tric, es que este método es muy preciso y mide específicamente todos los ácidos grasos y todos los demás componentes lipofílicos. Quien demostrará el procedimiento será NDI Afer, un técnico de nuestro laboratorio. Antes de comenzar este procedimiento, determine la concentración de peso seco de algas en gramos por litro en el caldo de cultivo, según se detalla en la referencia indicada. Transfiera un volumen de caldo de cultivo que contenga entre cinco y 10 miligramos de peso seco de algas a un tubo de centrífuga de vidrio.

Calcule la cantidad exacta de biomasa transferida utilizando la concentración de biomasa determinada previamente; centrifugue la muestra durante cinco minutos a 1200 G. Deseche parte del sobrenadante, dejando aproximadamente 0,25 mililitros en el tubo. A continuación, resuspenda. Suspenda las algas en el sobrenadante restante pipeteando suavemente el precipitado hacia arriba y hacia abajo, y transfiera la mezcla celular a un tubo para homogeneizador de cuentas.

Utilizando una pipeta de 200 microlitros, enjuague el tubo de centrífuga y la punta de pipeta con aproximadamente 0,15 mililitros de agua milicúbica y transfiera el líquido al tubo del homogeneizador de cuentas. Centrifugue el tubo del homogeneizador de cuentas durante un minuto a velocidad máxima de RPM para asegurarse de que no queden burbujas de aire en el fondo del tubo. Una vez finalizado, liofilice el material en el tubo siguiendo este procedimiento.

Prepare una solución de 50 miligramos por litro de trip Penta Deano en una proporción de volumen fortificada de cloroformo a metanol. Utilizando una pipeta de desplazamiento positivo, agregue un mililitro de la solución de tripod, no al tubo de perlas. Verifique que no queden perlas dentro de la tapa del tubo del homogeneizador de perlas, ya que esto provocará fugas de la perla del tubo.

Golpee el tubo del agitador de cuentas ocho veces a 2.500 RPM durante 60 segundos cada vez, con un intervalo de 1/122 entre cada golpe. A continuación, transfiera la solución con cuentas del tubo del agitador de cuentas a un tubo de centrífuga de vidrio limpio y resistente al calor de 15 mililitros con tapón roscado de politetrafluoroetileno (Teflon). Lave el tubo del agitador de cuentas con un mililitro de la solución de trípode y transfiera el lavado al tubo de centrífuga de vidrio.

Repita dos veces más. Vortexee la muestra durante cinco segundos y luego sométala a sonicación durante 10 minutos. Tras la sonicación, agregue 2,5 mililitros de una solución acuosa de pH 7 que contiene 50 milimolar de tris y un molar de cloruro de sodio al tubo de centrífuga.

Una vez que la muestra haya sido agitada en vórtex y sonicada por segunda vez, centrifúguela durante cinco minutos a 1200 ×g. Al finalizar, transfiera cuidadosamente la fase inferior de cloroformo a un tubo de vidrio limpio utilizando una pipeta Pasteur de vidrio y repita la extracción con un mililitro de cloroformo. Al finalizar, recoja la fase de cloroformo utilizando una pipeta Pasteur de vidrio y combínela con la primera fracción de cloroformo.

Evapore el cloroformo utilizando una corriente de gas nitrógeno para obtener los lípidos extraídos secos. A continuación, agregue tres mililitros de metanol que contenga ácido sulfúrico al 5% al tubo que contiene los lípidos extraídos secos y ciérrelo herméticamente. Vortexee la muestra durante cinco segundos.

Incube las muestras durante tres horas a 70 grados Celsius en un calentador de bloque. Periódicamente, asegúrese de que las muestras no hiervan y vortexee el tubo después de cada revisión. Una vez que la muestra se enfríe a temperatura ambiente, agregue tres mililitros de agua milicúbica y tres mililitros de n-heptano al tubo, seguido de mezcla por vortex.

Agregite la muestra durante 15 minutos con un rotador de tubos de ensayo. Después de retirar las muestras del rotador de tubos de ensayo, centrifúgelos durante cinco minutos a 1200 G. Mediante una pipeta Pasteur de vidrio, recoja dos mililitros de la fase superior de hexano y transfiera a un tubo de vidrio limpio. Para lavar la fase de hexano recolectada, agregue dos mililitros de agua milli Q al tubo de vidrio.

Luego, agite la muestra en vórtex durante cinco segundos y centrifúguela durante cinco minutos. A 1200 G, transfiera la fase de hexano desde el tubo de vidrio a un vial de GC utilizando una pipeta Pasteur de vidrio. Luego, coloque una tapa en el vial de GC y ajústela bien para evitar la evaporación del disolvente.

Coloque el vial de la muestra en el muestreador automático del instrumento de GC. Finalmente, analice la muestra en el instrumento con una columna nueva utilizando un caudal total de 20 mililitros por minuto y un volumen de inyección de un microlitro. Consulte el protocolo escrito para las especificaciones de la columna y las condiciones cromatográficas.

Se muestra aquí un cromatograma típico que se obtiene mediante este proceso. Los ésteres metílicos de ácidos grasos se separan por tamaño y grado de saturación mediante la columna de GC, y en el protocolo utilizado los ácidos grasos de cadena más corta y los más saturados presentan tiempos de retención más cortos. La columna de GC y el protocolo utilizados no pretenden separar isómeros de ácidos grasos, aunque esto podría lograrse utilizando una columna de GC y un protocolo diferentes.

El contenido y la composición de ácidos grasos de C Desus UEX 3 93 bajo condiciones con suficiencia y carencia de nitrógeno se muestran aquí. Los contenidos totales de ácidos grasos fueron 8,6 ± 0,5 % y 44,7 ± 1,7 % bajo condiciones de cultivo con nitrógeno suficiente y con carencia de nitrógeno, respectivamente. Estos valores demuestran que la composición y el contenido de ácidos grasos se ven altamente afectados por la carencia de nitrógeno.

En ESBL, el ácido palmítico y el ácido oleico son los dos ácidos grasos más abundantes. Consulte el protocolo escrito para obtener detalles sobre el cálculo del contenido y la composición de ácidos grasos. Aquí se muestra el contenido y la composición de ácidos grasos de Odum Trico UEX 6 4 0 bajo condiciones de suficiencia y carencia de nitrógeno.

De forma similar a las UUs oblicuas, el contenido y la composición de ácidos grasos se ven altamente afectados por la carencia de nitrógeno. En condiciones de nitrógeno suficiente y deficiente, los contenidos totales de ácidos grasos fueron de 11,7 ± 0,9 % y 30,5 ± 1,1 %, respectivamente. P. trium también produce cantidades considerables de ácidos grasos altamente insaturados, como el I csap y el ácido penta IC.

Además, ácidos grasos de cadena muy larga, como el ácido lignocérico, también pueden detectarse mediante este método. Este procedimiento puede ampliarse incluyendo un paso de separación de coágulos lipídicos entre la extracción de lípidos y un paso de transesterificación para obtener información adicional sobre la composición de clases lipídicas de micro LG, tal como se describe en las referencias del texto del protocolo.