Biosensores radiométricos que miden el estado redox mitocondrial y ATP en las células vivas de levadura

El objetivo general de este procedimiento es medir la función mitocondrial en células de levadura vivas utilizando dos variantes de proteína verde fluorescente o GFP. La GFP de detección redox contiene cistinas expuestas en la superficie, que experimentan una oxidación y reducción reversibles y dependientes del entorno, alterando el espectro de excitación de la fila reducida en proteínas. La GFP tiene un máximo de excitación a 470 nanómetros, mientras que la GFP oxidada tiene una mayor deficiencia de excitación a 365 nanómetros.

El estado redoc se mide como la emisión de RO GFP a 470 nanómetros de excitación sobre la emisión de RO GFP a 365 nanómetros de excitación go Un equipo es una sonda de trastes en la que la subunidad épsilon de la F zero F1 A TP sintasa se intercala entre un donante de trastes GFP y un aceptor de trastes La unión de una TP a la subunidad épsilon da como resultado cambios de confirmación en la proteína que traen el donante y el aceptor del traste en estrecha proximidad, lo que permite la transferencia de energía del donante al aceptor. A continuación, se miden los niveles de TP como la emisión de OFP tras la excitación a 488 nanómetros sobre la emisión de GFP tras la excitación a 488 nanómetros. Se obtienen resultados que monitorizan los cambios en el estado redox o en los niveles de TP que se producen en condiciones fisiológicas.

La principal ventaja de estos métodos sobre los métodos existentes es que la carretera GFP y go. Un equipo está codificado genéticamente y puede ser introducido y mantenido de manera estable en células vivas. Como resultado, se pueden utilizar para medir el estado redox mitocondrial y un TP en células vivas sin afectar la aptitud de las células o los orgánulos.

Ambas sondas monitorean los cambios en el estado redox o los niveles de TP en condiciones fisiológicas. Como resultado, ambas sondas también son métricas de relación. Las mediciones realizadas con estas sondas no se ven afectadas por cambios en la concentración del biosensor o en la iluminación o el grosor de la muestra.

Ambos biosensores proporcionan resolución a nivel de orgánulos individuales. De hecho, las variantes de RO GFP se han dirigido a las mitocondrias, ER, endosomas y peroxisomas, donde han detectado cambios en el estado redox, en gran medida independientes del pH. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en los campos relacionados con el control de calidad mitocondrial y cómo las mitocondrias cambian con la edad.

La demostración visual de este método es útil, ya que los pasos de umbral y proporción durante el análisis de imágenes son difíciles y deben llevarse a cabo utilizando pautas definidas consistentes para comenzar este procedimiento. Realice la transformación de la levadura con biosensores como se describe en el protocolo de texto. Cultive células hasta la fase logarítmica media en cinco mililitros de medio de abandono completo selectivo en un tubo de fondo cónico de 15 mililitros.

Utilice el mismo lote de medios para todos los experimentos. Después de concentrar un mililitro de cultivo en 20 microlitros, aplique dos microlitros de las células resuspendidas a un portaobjetos y cubra las células con un cubreobjetos. A continuación, derrita una pequeña cantidad de VAP en una espátula de metal y extiéndala a lo largo de los bordes deslizantes de la cubierta para sellar.

Alternativamente, se puede usar esmalte de uñas transparente para la obtención de imágenes mito RO GFP one en un microscopio fluorescente de campo amplio. Utilice un objetivo con la apertura numérica más alta posible que transmita luz a 365 nanómetros, como el plano NA EEC de 100 x 1,3. Lente de objetivo Neo Fluor.

Configure el microscopio para excitar a 365 y 470 nanómetros para detectar GFP oxidado y reducido de la fila de ingletes respectivamente. Utilice LED para cambiar la longitud de onda de excitación y un cubo de filtro de emisión adecuado para GFP. Una vez retirado el filtro de excitación, configure la cámara en flexión una por una para obtener una resolución espacial óptima.

A continuación, configure el software para adquirir un Zack que consta de 11 rebanadas con un espaciado de 0,5 micrómetros, recogiendo ambos canales en cada posición Z. Localice el plano focal de las células utilizando luz transmitida para minimizar el blanqueo de la sonda fluorescente. A continuación, recopile una serie Z a través de toda la profundidad de una célula típica utilizando un tamaño de paso de 0,5 micrómetros para configurarla para la obtención de imágenes.

Podría ir un equipo de dos en un microscopio confocal espectral. Utilice el objetivo de apertura numérica más alto disponible aquí. Se utiliza una lente de césped APO de 100 x 1,49.

Configure el microscopio para excitar a un equipo de dos a 488 nanómetros y recoger la emisión de 500 a 520 nanómetros para un enlace TP y de 550 a 580 nanómetros. Para un TP formularios sin enlazar. Los valores óptimos reales pueden variar según las características del sistema de imágenes.

Establezca el agujero de alfiler en 1,0 unidades de área y, a continuación, configúrelo. Zoom de escaneo para acercarse al límite de muestreo de Nyquist. Para aumentar la velocidad de la imagen, recorte el campo a 512 x 256 píxeles.

Utilice el promedio de escaneo si es necesario para reducir el ruido. Utilice la menor potencia láser posible sin dejar de producir una imagen interpretable. Utilice un medidor de potencia interno o externo para monitorear los cambios en la potencia del láser que ocurren normalmente con el tiempo en cualquier sistema óptico.

Ajuste la ganancia del detector y la intensidad de la iluminación para maximizar el rango dinámico. Pero evita la saturación. No analice ninguna celda que contenga más del 1 % de píxeles saturados.

Localice el plano focal de las células utilizando la luz transmitida antes de recoger una serie Z a través de la profundidad de retención de una célula típica utilizando un tamaño de paso de 0,5 micrómetros Visualice todas las muestras utilizando el mismo objetivo Escaneo de potencia láser, zoom, tamaño de píxel, ganancia y desplazamiento. Abra las imágenes adquiridas y cambie el tipo a 32 bits para determinar el fondo. Dibuje una región de interés o ROI en un área donde no haya celdas.

Elija, analice, mida para agregar la intensidad media en este ROI a la ventana de resultados. Para restar este valor de la pila, elija Matemáticas de proceso y restar. A continuación, introduzca la intensidad media de fondo y elija Vista previa.

Está bien y sí, el umbral es el aspecto más difícil del procedimiento. Para garantizar el éxito, defina los parámetros de umbral de modo que la imagen resultante mantenga el tamaño real del objeto fluorescente en la imagen original. El uso de exactamente las mismas condiciones de exposición para cada experimento ayudará a producir umbrales consistentes en todo el procesamiento de imágenes.

Un umbral demasiado bajo incluirá píxeles de fondo. Un umbral demasiado alto eliminará partes de las mitocondrias del análisis utilizando el Zack restado, encontrará el corte del medio y seleccionará el ajuste de imagen y el umbral y, a continuación, el umbral de las mitocondrias después de encontrar un valor de umbral adecuado. Haga clic en Aplicar para aplicar este umbral a todos los sectores de la pila.

A continuación, marque establecer píxeles de fondo en NAN o no en un número y haga clic en Aceptar y sí, repita este proceso para la otra imagen. Cree la pila Z de proporción haciendo clic en procesar y luego en calculadora de imágenes. Divida la pila reducida por la pila C oxidada para el análisis MIT O-R-G-F-P one.

El mismo protocolo se utiliza para el análisis migo AAM dos. En ese caso, divida la imagen de 560 nanómetros ligada a A TP por la imagen de 510 nanómetros no enlazada a A TP. Dibuja un ROI alrededor del área de interés.

Elija las herramientas de análisis. Administrador de ROI y haga clic en agregar para registrar el ROI, luego elija más medida múltiple y listo. Finalmente, copie el área y la media del número de corte y exporte los datos a una hoja de cálculo para su análisis, use la hoja de cálculo para calcular el área multiplicada por la media de la suma ponderada y el promedio ponderado de las células que expresan la GFP dirigida a las mitocondrias y la GFP de la fila uno crece a tasas normales.

La tasa máxima de crecimiento es similar en las células que expresan mito GFP y MIT row GFP uno. Además, las mitocondrias y levaduras que expresan MIT RO GF P one están alineadas tubularmente a lo largo del eje de la yema madre y se acumulan en las puntas de las células madre e hija. Esta morfología normal indica que MIT RO GF P one no altera la función mitocondrial.

Para evaluar el rango dinámico de mitg FP, se trataron células de levadura de tipo salvaje en una fase midlock con peróxido de hidrógeno y dihi tres etol, y se midió la proporción mitocondrial media reducida a oxidada para evaluar la titulación del estado redox mitocondrial con peróxido de hidrógeno o DTT de cero a 10 milimolares, lo que da como resultado un cambio dependiente de la dosis. En la relación mitocondrial media reducida a oxidada con un rango medido de 0,6 en condiciones de oxidación a 1,23 en condiciones reductoras. Por lo tanto, mitg FP one es un biosensor eficaz para el análisis de la redada mitocondrial en células vivas.

Mito RO GFP one también ofrece resolución subcelular del estado redox mitocondrial. Esta resolución subcelular revela que las mitocondrias dentro de las células de levadura individuales difieren en el estado redox relativo: la luz puede inducir cambios en el cromo cuatro de GFP al exponerse a una fila de luz de alta intensidad de 400 nanómetros; GFP uno se somete a una fotoconversión a una especie con un espectro de emisión diferente utilizando excitación de baja intensidad. No hay conversión fotográfica significativa durante el período analizado.

La forma preferida de reducir la fotoconversión es excitar la forma oxidada de GFP de la fila a 365 nanómetros: MIGO AAM dos co se localiza con ADN mitocondrial teñido con DAPI en levadura y se encuentra en estructuras tubulares típicas de las mitocondrias de levadura de tipo salvaje. Además, la tasa de crecimiento de las células que expresan MIGO AAM dos es similar a la de las células que expresan GFP dirigida a las mitocondrias tanto en medios de glucosa como de glicerol. Por lo tanto, la expresión de migo A dos no parece deletérea para la célula o las mitocondrias para probar si migo A dos responde a los cambios en los niveles de TP mitocondrial A, las células fueron tratadas con antimicina A, un agente que inhibe la producción de TP mitocondrial A.

La proporción mediana de trastes disminuye en las células tratadas con antimicina. Curiosamente, los datos preliminares indican que puede haber diferencias en los niveles de TP en diferentes mitocondrias dentro de la misma célula. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en varias horas.

Además, al intentar este procedimiento, es importante mantener constantes los parámetros de imagen mientras se monitorea la fragmentación mitocondrial de las células y otros signos de fototoxicidad. Evite el fotoblanqueo y desarrolle criterios coherentes para los umbrales. Estos biosensores se pueden utilizar para monitorear los cambios mitocondriales en hongos de plantas vivas y células de mamíferos.

También se pueden utilizar para controlar los cambios mitocondriales en la neurodegeneración, las enfermedades metabólicas y otras enfermedades asociadas con defectos en las funciones mitocondriales. Después de ver este video, debería poder usar tintes fluorescentes métricos de proporción dirigida a mitocondrias para monitorear el estado redox mitocondrial y un TP en células vivas.