Matrix asistida por láser de desorción / ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas Análisis de las proteínas intactas de más de 100 kDa

El objetivo general de este procedimiento es analizar proteínas intactas de más de 100 kilodaltons de una manera sensible mediante espectrometría de masas maldi. Esto se logra preparando primero las soluciones matriciales. El segundo paso es depositar la solución de capa delgada en el objetivo.

A continuación, la muestra y la mezcla de matrices se depositan en el objetivo. El paso final es observar las manchas de muestra bajo el microscopio. En última instancia, se utiliza un espectrómetro múltiple a de masas para analizar proteínas intactas y registrar espectros de masas.

La principal ventaja de la espectrometría de masas maldi sobre otros enfoques analíticos, como la ionización por electropulverización, es que es más tolerante a la sal, los contaminantes y los detergentes. Otra ventaja del maldi es que genera iones con menos cargas en comparación con el electro spray. Por lo tanto, adquirir e interpretar datos MDI es bastante sencillo.

Para comenzar la cristalización de la resina, vierta 10 mililitros de etanol al 40% en un Pyrex que. Luego a 600 miligramos de una matriz usando un baño de agua y un calentador de resistencia. Calentar la solución de matriz y agitarla hasta que la matriz se disuelva por completo.

Repita los pasos anteriores hasta que la solución esté saturada. Deje que la solución se enfríe lentamente a temperatura ambiente durante varias horas y luego guárdela a cuatro grados centígrados durante la noche. Si no se forman cristales, rasque el interior del vaso de precipitados justo debajo de la superficie de la solución, utilizando una varilla de vidrio para inducir la cristalización.

Por último, recoger los cristales de la matriz por filtración. Enjuague los cristales residuales en el matraz con una cantidad mínima de solvente helado y filtre. Una vez completada la filtración, deje que los cristales se sequen para limpiar la placa objetivo maldi.

Enjuágalo con metanol y límpialo suavemente con una toallita kim. A continuación, enjuágalo con agua y límpialo con una toallita kim. Inserte el objetivo maldi en un vaso de precipitados de 600 mililitros y cúbralo con etanol al 50%.

A continuación, sonicar el objetivo en la solución de etanol durante 10 minutos en un baño ultrasónico. Si quedan residuos en el plato, repita los pasos anteriores. Enjuague el objetivo con metanol o agua, el solvente utilizado, determina cuánto se esparce la muestra.

A continuación, incline el objetivo para que todo el líquido se recoja en una toallita Kim. Seque el objetivo utilizando un flujo de gas nitrógeno. En el siguiente paso, disuelva alfa CHCA en acetona.

Para hacer una solución saturada, sumerja una punta de pipeta de 10 microlitros en la solución saturada de alfa CHCA de modo que una pequeña cantidad de la solución fluya en la punta. Toque rápidamente el objetivo maldi con la punta de la pipeta para depositar la solución alfa CHCA en el objetivo maldi utilizando un tubo de plástico de 1,5 mililitros. Prepare una solución de 20 miligramos por mililitro de alfa CHCA disolviendo alfa CHCA en una proporción de volumen de siete a tres de acetonitrilo a 5% de ácido fórmico, etiquetada como solución de alfa CHCA.

Después de esto, prepare una solución de DHB de 20 miligramos por mililitro disolviendo DHB en una proporción de siete a tres volúmenes de nitrilo de acetilo a 0,1% de ácido trifluoroacético, etiquetada como solución de DHB. Mezcle la solución alfa CHCA y la solución DHB en una proporción de volumen de uno a uno. Para obtener la solución C-H-C-A-D-H-B antes de comenzar este procedimiento, un paso opcional es purificar las muestras de proteínas mediante el intercambio de tampones que se muestra en la referencia enumerada.

De lo contrario, deposite una muestra de proteína no purificada en el objetivo MALDI. A continuación, deposite 0,5 microlitros de la muestra de proteína en la capa delgada de alfa CHCA preparada. Inmediatamente después de esto, agregue 0,5 microlitros de la solución C-H-C-A-D-H-B.

Deposite 0,5 microlitros del patrón Caín en la placa MALDI y luego agregue 0,5 microlitros de la solución de matriz. Una vez que las muestras y la caína se hayan secado, puede observar las manchas bajo un microscopio, insertar el objetivo en el instrumento y elegir la configuración adecuada del instrumento. A continuación, elija el rango de relación masa/carga adecuado.

Adquiera los espectros de la ca y calibre el instrumento utilizando la intensidad láser adecuada. Adquirir los espectros de las muestras de proteínas. Aquí se muestra el análisis de MALDI toff de la región cromosómica intacta Mantenimiento de una proteína.

La mezcla C-H-C-A-D-H-B produjo espectros de masas de mayor calidad en términos de relación señal/ruido y sensibilidad. En particular, se pudieron detectar 0,5 picomoles de proteína depositados en el objetivo MALDI, mientras que la misma cantidad de proteína fue apenas detectable. Utilizando el ácido NIC SINO utilizando la mezcla C-H-C-A-D-H-B, se observaron iones cargados múltiples de la proteína, lo que permitió la determinación de la masa con mayor precisión porque la resolución máxima es inversamente proporcional a la relación de carga maestra en el caso de un instrumento axial multi toff. Además, utilizando la mezcla C-H-C-A-D-H-B, nuestro método de elección para la deposición de la matriz fue el enfoque de capa fina.

Utilizando el método de gota seca no se detectaron proteínas con una masa superior a 100 kilodaltons. La proteína aasa monomérica beta recolectada también se analizó mediante TOF múltiple. Los espectros C-H-C-A-D-H-B fueron mejores que los espectros de ácido SINO NIC en términos de sensibilidad y resolución.

Además, la presencia de iones cargados múltiples permitió confirmar la masa de la proteína con mayor precisión. Aquí se muestra MALDI para el análisis de una inmunoglobulina intacta. Los espectros obtenidos utilizando la mezcla C-H-C-A-D-H-B fueron mucho más intensos que los espectros SA y alfa CHCA.

Más específicamente, las señales de las proteínas fueron más altas y tuvieron mejor resolución en los espectros C-H-C-A-D-H-B. El uso de la mezcla C-H-C-A-D-H-B y el método de deposición en capa fina demostraron mejoras significativas en la calidad de la proteína intacta de gran tamaño. Espectros de masas adquiridos usando un MALDI para instrumentar.

El protocolo presentado ilustra cómo adquirir espectros de masas de alta calidad de proteínas de alto peso molecular utilizando un instrumento múltiple. Al llevar a cabo este tipo de análisis, hay tres cosas que son importantes. En primer lugar, utilizar una solución de métricas recién preparada.

En segundo lugar, depositar correctamente la muestra en el objetivo de Malí. Y tercero, utilizar la configuración instrumental adecuada, como la intensidad del láser.