Enfoques Forward genéticos en

El objetivo general de este procedimiento es realizar un análisis genético de Chlamydia trachomatis mediante la realización de mutagénesis química y la determinación de asociaciones entre genotipo y fenotipo. Esto se logra primero generando cepas mutantes de Chlamydia trachomatis utilizando mutagénesis química. A continuación, todas las mutaciones generadas químicamente se identifican mediante secuenciación del genoma completo, seguida de ensamblaje del genoma guiado por una referencia.

Luego se identifican las asociaciones entre fenotipo y genotipo en las cepas mutantes. Finalmente, se confirman las asociaciones entre fenotipo y genotipo mediante la generación de cepas recombinantes y su análisis. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran que una mutación en un gen específico de Chlamydia conduce a un fenotipo de interés mediante una combinación de enfoques clásicos de mutagénesis química y secuenciación de nueva generación Singh.

Actualmente no existen métodos disponibles para el reemplazo génico en Chlamydia y las herramientas genéticas moleculares para su estudio se encuentran en sus inicios. Este método no requiere transformación con ADN recombinante ni el desarrollo de herramientas genéticas moleculares, pero logra el mismo objetivo: asignar funciones a productos génicos individuales.

Para preparar células cultivadas, siembre aproximadamente un por diez a la seis células por 25 centímetros cuadrados en tres mililitros de DMEM suplementado con 10 %FBS e incube a 37 grados Celsius con 5 %dióxido de carbono. Cuando las células alcancen confluencia, aproximadamente 24 horas después, aspire el medio e infecte las células con clamidia a una multiplicidad de infección de cinco. En un volumen total de tres mililitros de D-M-E-M-F-B-S que contenga 200 nanogramos por mililitro de cicloheximida, inicie la mutagénesis a 18 horas postinfección. Bajo una campana química, prepare 20 miligramos por mililitro de sulfonato de etilmetano o EMS en PBS con cloruro de calcio y cloruro de magnesio.

El EMS es un mutágeno y carcinógeno potente. Por lo tanto, consulte el protocolo escrito para su eliminación. Aspire el medio de las células Vero y lávelas una vez con tres mililitros de PBS con cloruro de magnesio y cloruro de calcio.

Luego, agregue tres mililitros de solución de EMS e incube durante una hora en la campana extractora a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire el EMS y colóquelo en un recipiente con hidróxido de sodio uno molar para inactivar el agente mutagénico antes de lavar las células tres veces para eliminar cualquier residuo de EMS. A continuación, agregue seis mililitros de DMEM con 10 % de FBS, 200 nanogramos por mililitro de cicloheximida y 25 microgramos por mililitro de gentamicina, e incube a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono durante 48 a 72 horas.

Las inclusiones aparecen desprovistas de bacterias aproximadamente 36 horas después de la mutagénesis a las 72 horas. Alrededor del 10 % de las inclusiones están llenas de bacterias, mientras que el resto permanece vacío para extraer cuerpos elementales o EB mediante lisis hipotónica; aspire completamente el medio. Añada un mililitro de agua y agite durante 10 minutos para desprender las células; lice las células pipeteando arriba y abajo al menos 10 veces.

Después de recolectar el lisado en un tubo microcentrífugo, añada 0,25 mililitros de tampón de sacarosa al cinco por ciento, fosfato y glutamato, o SPG, hasta una concentración final de uno por ciento y almacénelo a menos 80 grados Celsius. Prepare monocapas confluentes de células ves en placas de seis pocillos sembrando aproximadamente 0,4 veces 10 a la sexta células en tres mililitros de DMEM con 10 % de suero bovino fetal por pocillo, y permita que las células formen una monocapa homogénea durante las próximas 24 horas. A continuación, coloque en hielo una solución stock de clamidia mutágena.

Luego, prepare seis tubos con diluciones seriadas en factores de diez en un volumen total de 200 microlitros por dilución en DMEM con 10 % de FBS, y colóquelos en hielo. Use tres mililitros por pocillo de PBS para lavar las células Vero dos veces. A continuación, agregue tres mililitros de DMEM a cada pocillo de placas de seis pocillos y 100 microlitros de la dilución bacteriana por duplicado.

Agite la placa para asegurar una mezcla uniforme. Centrifugue las placas infectadas a 2.700 GS durante 30 minutos a 15 grados Celsius. Luego, incúbelas a 37 grados Celsius en un incubador con 5% de dióxido de carbono humedecido durante una a dos horas.

Mientras tanto, prepare AROS al 0,54 % en DMEM combinando primero los siguientes ingredientes y mezclándolos. Luego mezcle 18,9 mililitros de AROS estéril caliente al 1,2 % en agua, agitando para evitar grumos. Mantenga la mezcla tibia en un baño de agua a 55 grados Celsius.

Aspire la suspensión bacteriana de las placas y agregue seis mililitros de la solución tibia de aro. Deje que solidifique completamente a temperatura ambiente fuera de la campana. Luego, dentro de la campana de seguridad biológica con las tapas retiradas, seque las placas durante 15 minutos adicionales. Una vez que las placas estén secas, incúbelas a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono durante siete a 10 días.

Las placas deben ser visibles con la ayuda de un microscopio estereoscópico un día antes de aislar los mutantes. Ver uno por diez a la cuatro cero células en 100 microlitros por pocillo. En una placa de 96 pocillos, las células estarán confluentes dentro de 24 horas.

Bajo un microscopio de disección, marque las placas que se van a seleccionar y luego utilice una pipeta estéril de un mililitro con barrera para recoger trozos de las placas. Reuspenda las placas en 100 microlitros de DMEM suplementado con 10% de FBS, 400 nanogramos por mililitro de cicloheximida y 50 microgramos por mililitro de gentamicina para expandir las cepas mutantes. Incube la suspensión sobre monocapas confluentes de células Vero.

Centrifugar las placas a 2.700 GS y 15 grados Celsius durante 30 minutos antes de incubar las DBS cosechadas cuando más del 50 % de las células estén infectadas, lo cual puede ocurrir tan pronto como 48 horas después de la infección y hasta 14 días después. Esta cantidad de células infectadas permite almacenar suficientes bacterias viables para extraer EV mediante lisis hipotónica de las células infectadas. Después de aspirar el medio, añadir 160 microlitros de agua estéril e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Utilice puntas con barrera para romper las células pipeteando arriba y abajo varias veces para asegurar una lisis completa. Finalmente, transfiera 160 microlitros de cada lisado a tubos microfuga. Añada 40 microlitros de SPG 5X y almacene a menos 80 grados Celsius hasta que esté listo para realizar el ensayo y seleccionar mutantes con fenotipos de interés.

La exposición al agente mutagénico conduce a inclusiones que parecen carecer de bacterias, presumiblemente debido a la muerte celular bacteriana. Normalmente, el serovar LGVL dos lisa completamente las células infectadas dentro de las 48 horas posteriores a la infección, pero el tratamiento con agentes mutagénicos puede prolongar este ciclo a más de 90 horas, y se espera que aproximadamente el 10 % de las inclusiones se recupere en nuestros experimentos. Las células Vero infectadas tratadas con 20 miligramos por mililitro de EMS mostraron una disminución del 99 % en la recuperación de progenie infecciosa en comparación con los controles no tratados, como se observa en esta figura.

El tratamiento mutagénico también provocó la aparición de placas con morfologías alteradas, incluidas placas pequeñas. Otras morfologías incluyen placas que presentan aspecto granular, grumoso o con forma de panal, como se muestra aquí. Las dosis de EMS utilizadas en estos estudios pueden inducir entre tres y 30 mutaciones por genoma de KCL, según se evaluó experimentalmente mediante NGS.

Aunque los EBS purificados mediante gradiente están en gran parte libres de material de células huésped, también se detecta ADN del huésped y representa aproximadamente del 10 al 15 % de las preparaciones genómicas tras seguir este procedimiento. Pueden realizarse análisis para fenotipos como la replicación alterada en cultivos celulares, la pérdida de actividades bioquímicas o cambios en la morfología bacteriana, con el fin de responder preguntas adicionales, como qué factores bacterianos son necesarios para la formación y el mantenimiento de la clamidia, factores patógenos.