Modelos y métodos para evaluar el transporte de Drug Delivery Systems a través de barreras celulares

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el transporte de un sistema de administración de fármacos o del agente terapéutico que transporta a través de una barrera celular, como un modelo del epitelio gastrointestinal relevante para la administración oral de fármacos. Esto se logra primero cultivando células caco dos en insertos transwell para permitir la diferenciación celular y la formación de una monocapa celular.

El segundo paso consiste en validar que este modelo representa una barrera de permeabilidad mediante la medición de la resistencia eléctrica transepitelial, la tinción inmunológica de las uniones celulares y la evaluación de la permeabilidad pasiva de una molécula trazadora detectable. El siguiente paso es preparar el sistema de administración de fármacos; en este ejemplo se utilizan nanocarriers poliméricos dirigidos. Los nanocarriers pueden contener o no una carga de fármaco, y deben incluirse controles como nanocarriers no dirigidos o un fármaco libre.

Estos elementos están marcados con radioisótopos para permitir su detección. Luego, los vehículos se añaden a la cámara apical por encima de la monocapa celular tras la incubación. En diferentes puntos temporales, se recogen muestras de los vehículos de la cámara apical, la cámara basolateral y la monocapa celular, y se analizan para detectar la posible degradación del componente marcado.

A continuación, se calcula finalmente el transporte de nanocarros a través de la monocapa celular para investigar el mecanismo de transporte. Deben realizarse experimentos similares en presencia de inhibidores farmacológicos de la transcitosis a través de las células o con indicadores del transporte paracelular entre células. La técnica que describimos aquí es una adaptación de métodos bien establecidos utilizados para evaluar la velocidad y el mecanismo de transporte de fármacos y nanocarriers de fármacos a través de monocapas celulares en cultivo, que representan barreras celulares en el organismo.

Aunque el ejemplo en el que nos hemos centrado aquí valida el transporte de nanopartículas poliméricas dirigidas a través de un modelo de epitelio gastrointestinal, se pueden aplicar métodos similares para examinar el paso de diferentes sistemas de administración de fármacos a través de estos o de otros monocapas celulares, como las células endoteliales que normalmente forman una barrera entre la sangre y los tejidos u órganos. Por ejemplo, en el caso de la barrera hematoencefálica, generalmente las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la complejidad de seleccionar etiquetas adecuadas para rastrear correctamente los sistemas de administr游戏副本

Para este aspecto, utilizaremos radioisótopos para marcar los sistemas de administración de fármacos en nuestros estudios; otra preocupación importante es validar la integridad de la barrera celular del modelo y utilizar los controles adecuados para verificarla durante los experimentos. Este procedimiento se realiza en una campana de cultivo celular estéril de nivel de bioseguridad dos, y todos los materiales que ingresen a la campana deben esterilizarse con etanol utilizando pinzas para colocar insertos transbien de policarbonato de 0,8 micrómetros de poro en una placa de 24 pocillos, a fin de obtener resultados estadísticamente significativos.

Cada condición experimental requiere un mínimo de cuatro repeticiones. Diluya células de adenocarcinoma epitelial colorectal humano o células Caco-2 en medio celular previamente preparado. Coloque de 200 a 400 microlitros de la solución celular en la cámara superior o apical del transwell.

Siembre con una densidad de 1,5 veces 10 a la cinco células por centímetro cuadrado. Complete la cámara inferior o basolateral con 700 a 900 microlitros de medio celular y cultive las células a 37 grados Celsius, 5 % de dióxido de carbono y 95 % de humedad durante 16 a 21 días, reemplazando el medio cada tres o cuatro días en las cámaras superior e inferior.

Sustituya el medio en el siguiente orden para mantener la presión por encima de la monocapa celular: aspire el medio de la cámara inferior, luego aspire el medio de la cámara superior. Llene la cámara superior con 200 a 400 microlitros de medio fresco y llene la cámara inferior con 700 a 900 microlitros de medio fresco para validar la barrera de permeabilidad epitelial por niveles. Configure el voltímetro en la modalidad de resistencia y coloque verticalmente los electrodos en un pocillo que contenga el inserto transwell.

El electrodo corto debe estar en la cámara superior y el electrodo largo en la cámara inferior, tocando el fondo del pocillo. Una vez que la lectura del voltímetro se estabilice, registre el valor de la resistencia en ohmios para cada uno. Repita las mediciones cada uno o dos días hasta que los valores aumenten hasta un máximo y se mantengan estables, lo que indica la formación de una barrera de permeabilidad, lo cual generalmente tarda de dos a tres semanas a partir del momento del siembra celular.

Para verificar la presencia de uniones estrechas en monocapas celulares con alto grado de polaridad, primero fije las células, aspire el medio de ambos compartimentos y lave las células tres veces con DMEM tibio; incube con paraformaldehído frío al 2% durante 15 minutos. Después de 15 minutos, retire el paraformaldehído y lave las células tres veces con PBS. A continuación, añada un microgramo por mililitro de anticuerpo anti-occludin a cada uno.

Se utilizarán pozos con baja permeabilidad como control negativo para la formación de barrera. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, lavar las células nuevamente con PBS y luego añadir 7,5 microgramos por mililitro de anticuerpos secundarios marcados a cada pozo, e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Finalmente, lavar las células con PBS y excisar cuidadosamente la membrana de filtro sobre la cual se encuentra la monocapa fijada, montarla sobre portaobjetos para su observación mediante microscopía epifluorescente, de fluorescencia o confocal.

Este procedimiento comienza con la marcación del anticuerpo dirigido con yodo 125 y el cálculo de la actividad específica del anticuerpo marcado en cuentas por minuto por microgramo, utilizando protocolos publicados previamente. En este ejemplo, el anticuerpo dirigido es un anticuerpo monoclonal de ratón contra la molécula de adhesión intercelular humana, uno o anti-ICAM uno, para controlar la especificidad. Se utilizará IgG de ratón marcada con yodo 125 para preparar nanovehículos recubiertos no dirigidos con el fin de estudiar el transporte de una carga terapéutica.

La carga también está marcada con yodo 125. En este ejemplo, la carga es alfa-galactosidasa o alfa G, una enzima terapéutica utilizada para el tratamiento de la enfermedad de Fabry, un trastorno genético de almacenamiento lisosomal. Uno de los aspectos más difíciles de este procedimiento es garantizar una detección adecuada de los materiales transportados.

Para garantizar el éxito, los componentes de los nanocarriers deben marcarse con una cantidad suficiente de isótopos a alta actividad específica. El siguiente paso consiste en acoplar el anti ICAM marcado a la superficie de los nanocarriers. En este caso, simplemente mezclamos el anti ICAM marcado con yodo 1 25 con nanoesferas de poliestireno de 100 nanómetros de diámetro como modelo para el control no específico.

Utilice IgG marcada con yodo 125 y para rastrear el transporte de una carga, use una combinación de anti-ICAM y alfa G marcada con yodo 125. Incube las mezclas durante una hora a temperatura ambiente para permitir la absorción en la superficie; después de una hora, centrifugue a 13.000 ×g durante tres minutos y luego elimine los contrapartes no recubiertos en el sobrenadante mediante pipeteo por aspiración. Suspenda el sedimento que contiene los nanovehículos recubiertos en albúmina sérica bovina al 1 % en PBS, y posteriormente someta a sonicación a baja potencia para interrumpir posibles agregados de partículas. Añada los nanovehículos de anti-ICAM marcados con yodo 125 a la cámara superior por encima de monocapas confluentes de Caco-2 con alta resistencia. Repita el procedimiento para los contrapartes no específicos y terapéuticos tras medir la permeabilidad.

Incubar a 37 grados Celsius durante uno o más intervalos de tiempo deseados. Volver a medir el desgarro después de la incubación. Las mediciones del desgarro sirven para evaluar los efectos de los nanocarriers en la barrera de permeabilidad.

Recolecte el medio de las cámaras superior e inferior. Lave la cámara superior con 0,5 mililitros de DMEM a 37 grados Celsius y la cámara inferior con un mililitro de agua desionizada. Recolecte los lavados para la medición del contenido total de radioisótopos utilizando un contador gamma para la medición de la fracción celular.

Excise el filtro permeable utilizando una cuchilla de afeitar para cortar alrededor de los bordes. Incube en un tubo de contador gamma con 1 % de Triton X-100 durante 10 minutos para liberar el contenido celular antes de medir la radioactividad total asociada a las células, con el fin de cuantificar el yodo 125 liberado de los nanovehículos durante el transporte o debido a una posible degradación. Primero, mezcle 300 microlitros de cada muestra con 700 microlitros de BSA al 3 % en PBS y 200 microlitros de ácido tricloroacético o TCA, e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Durante esta incubación de 15 minutos, mida la radiactividad total de las muestras en un contador gamma. Centrifugue las muestras de ácido tricloroacético (TCA) a 3000 GS durante cinco minutos para separar la proteína intacta de la proteína degradada o la fracción de yodo 1 25. Cuantifique la radiactividad de la fracción libre de yodo 1 25 y reste este valor de la radiactividad total medida antes de la centrifugación. Esto proporcionará la cantidad de proteína marcada frente a la fracción de radiotrazador que se separó de ella, para evaluar el transporte paracelular utilizando albúmina. Cultive monocapas de células KCO dos con fugas paracelulares en insertos transbienales, como se demostró anteriormente, añadiendo al compartimento superior, por encima de la monocapa celular, medio con albúmina marcada con yodo 1 25 sola como control negativo que muestra el nivel basal de fuga, o yodo.

1 25 albúmina marcada y anticuerpo no marcado con radioisótopos. Incube los nanocarriers dirigidos a 37 grados Celsius durante los intervalos de tiempo seleccionados, que deben coincidir con los examinados al probar nz.Transport. Mida la lágrima como se demostró anteriormente, antes, durante y después de la incubación.

Recolecte todas las fracciones tras la incubación para las mediciones de yodo total 1 25 y yodo libre 1 25 como control positivo para la apertura de uniones intercelulares. Añada medio celular que contenga peróxido de hidrógeno cinco milimolar a las cámaras superior e inferior del transwell. Inserte e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos.

Mida la filtración y agregue albúmina de yodo 1 25 al compartimento superior durante los intervalos de tiempo seleccionados. Mida la filtración en varios puntos temporales durante la incubación para identificar la disminución del valor de filtración causada por la apertura de las uniones celulares inducida por peróxido de hidrógeno. En experimentos paralelos, evalúe el transporte transcelular o transcitosis de nanovehículos dirigidos con yodo 1 25 incubando monocapas confluente de Caco dos con cada uno de estos inhibidores.

50 micromolar MDC, un inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina. Un microgramo por mililitro de filipina, un inhibidor de la endocitosis mediada por caveolas. 0,5 micromolar de wortmannina, un inhibidor de la fosfatidilinositol tres quinasa, que participa en la macropinocitosis, y 20 micromolar de EIPA.

Un inhibidor de la macropinocitosis y la endocitosis mediada por quimioatrayentes mide la resistencia eléctrica transepitelial antes, durante y después de la incubación de las células con inhibidores y materiales marcados con radioisótopos como un control adicional del efecto de los inhibidores sobre la permeabilidad de la monocapa para validar las monocapas CACO-2 como modelo de transporte transepitelial de nanocarriers dirigidos. Las células CACO-2 se cultivaron sobre inserts transbien a una densidad de 1,5 × 10⁵ células por centímetro cuadrado y se midió la resistencia eléctrica transepitelial o TER para evaluar la integridad de la monocapa. Como se muestra en esta gráfica, la monocapa alcanzó la confluencia al día 12 y mantuvo la integridad de la monocapa hasta el día 18. Este resultado fue validado adicionalmente por la presencia de uniones estrechas positivas para ocludina en monocapas con un valor alto de 380 ohmios por centímetro cuadrado al día 14, en comparación con la marcación débil de uniones estrechas en monocapas con un valor bajo de 17 ohmios por centímetro cuadrado. Al día 5, para evaluar el transporte de nanocarriers anti-ICAM a través de monocapas de células CACO-2, se incubaron monocapas confluentes de CACO-2 cultivadas sobre inserts transbien con nanocarriers anti-ICAM marcados con yodo-125 añadidos a la cámara apical.

Se midió el contenido de yodo 125 en la cámara basolateral en los puntos de tiempo indicados para calcular la cantidad de nanovehículos transportados por célula, como se muestra en el panel superior. En el panel inferior, el porcentaje de nanovehículos transportados se calculó como la relación entre los vehículos encontrados en la fracción basolateral y el total en las fracciones basolateral y celular combinadas. Estos parámetros estimados en este ejemplo para los nanovehículos anti-ICAM marcados con yodo 125 también se compararon con los de control, los nanovehículos IgG marcados con yodo 125, con el fin de demostrar la eficiencia de transporte en relación con un contraparte no dirigida, y los resultados se muestran en el panel superior.

Los coeficientes aparentes de permeabilidad también se calcularon para reflejar las tasas de transporte de nanovehículos con yodo 125 anti-ICAM o nanovehículos con yodo 125 IgG, como se muestra en el panel inferior, cuando la marca radiactiva se incorpora al cargo del nanovehículo. Los parámetros descritos reflejan el transporte del cargo, que en este ejemplo es la enzima alfa-GA utilizada para tratar un trastorno genético de almacenamiento lisosomal conocido como enfermedad de Fabry. Se midió el contenido de radioisótopo en las fracciones apical, basolateral y celular a las tres horas y a las 24 horas, y se convirtió en diversos valores relevantes para el transporte, como se muestra en esta tabla.

Además de calcular el transporte de nanocarriers mediante el seguimiento del fármaco, la entrega transepitelial de esta enzima terapéutica se puede estimar expresándola como moléculas o picogramos de Alpha-gal transportados por célula. También se investigó el mecanismo de transporte de nanocarriers anti-ICAM a través de monocapas de Caco. El transporte transcelular de nanocarriers anti-ICAM marcados con yodo 125 a través de monocapas confluentes de Caco-2 se evaluó a las 24 horas en ausencia o presencia de los siguientes inhibidores: EIPA, Philippine MDC o Wirt manin. El EIPA es un inhibidor de la macropinocitosis y la endocitosis mediada por canales. Philippine, MDC y WT menin son inhibidores de la endocitosis mediada por clatrina, la endocitosis mediada por clatrina y la macropinocitosis, respectivamente.

Como se indica en esta gráfica, la EIPA redujo el transporte de nanoportadores de yodo 125 anti-IAM a través de monocapas celulares CACO-2, mientras que la Filipina MDC y la Wirt Menin no redujeron los niveles de transporte con respecto a la condición control. Esto sugiere que los nanoportadores anti-ICAM utilizan la endocitosis mediada por caveolas para el transporte transcelular, pero no la transcitosis relacionada con clatrina o macropinocitosis.

Para evaluar el transporte paracelular, se midió la resistencia transepitelial durante el transporte de nanocarriers de yodo 1 25 anti-ICAM a través de Caco-2. Se muestran dos valores de resistencia en monocapas en ausencia de nanocarriers como controles, y el intervalo discontinuo marca el error estándar de la media (SEM) de la incubación con cinco milimolares. El peróxido de hidrógeno fue un control positivo para la apertura de las uniones intercelulares, tal como se refleja en la disminución de la resistencia hasta niveles basales.

Además, se midió la fuga proteica paracelular determinada como el coeficiente de permeabilidad aparente del yodo 1 25, albúmina que atraviesa la monocapa celular en ausencia o presencia de peróxido de hidrógeno cinco milimolar, nanovectores de IgG o nanovectores anti-ICAM, y se calculó que el peróxido de hidrógeno incrementó notablemente la fuga de albúmina marcada con yodo 1 25 hacia la cámara basal lateral y sirvió como control positivo, como se muestra en estos gráficos. La incubación con nanovectores anti-ICAM no alteró la fuga paracelular de la lágrima ni de la albúmina marcada con yodo 1 25 durante un período de 48 horas, de forma similar a los nanovectores de control IgG que no son transportados.

Estos resultados descartan el transporte paracelular y son coherentes con hallazgos previos que sugieren que los nanotransportadores anti-ICAM utilizan la endocitosis mediada por cam para el transporte transcelular. Al realizar este procedimiento, es importante seleccionar uno o más tipos celulares adecuados, así como un filtro permeable con tamaño de poro, material, diámetro, entre otros, apropiados para el modelo Transwell, y técnicas de marcado para la cuantificación eficaz de su sistema de administración de fármacos tras seguir este procedimiento. Otros métodos, como la fluorescencia o la microscopía electrónica de transmisión, pueden utilizarse para determinar la ubicación de los materiales transportados y, adicionalmente, para verificar el estado de dichos materiales.

El blot de Western puede utilizarse para medir la degradación de proteínas. La EISA puede emplearse para determinar la capacidad de targeting de los portadores transportados, y la actividad de la carga del fármaco puede medirse mediante ensayos espectrofotométr游戏副本s o otras técnicas adecuadas.