Promoción de la supervivencia y la diferenciación de células madre neurales con fibrina y factor de crecimiento cócteles después de la médula espinal severa lesión

El objetivo general de este procedimiento es mejorar la supervivencia y la diferenciación de las células madre neurales trasplantadas en lesiones de médula espinal gravemente lesionadas en ratas. Esto se logra haciendo primero una lesión de la médula espinal, como una transección en T tres, con la mayor parte de la duramadre intacta, excepto una pequeña abertura para retener las células injertadas. El segundo paso del procedimiento es recolectar células madre neurales recién disociadas de feto de rata embrionario de día 14.

El tercer paso es la suspensión de células madre neurales por parte de Resus en cada componente de matrices de fibrina que contienen cócteles de factores de crecimiento. El paso final es trasplantar células madre neurales en matrices de fibrina y factores de crecimiento en el centro de la lesión subaguda, microscopía de inmunofluorescencia de médula espinal transfectada e injertada. A las siete semanas después del injerto puede mostrar una excelente supervivencia de las células madre neurales y su diferenciación en neuronas maduras, que extienden un número notable de axones al huésped.

La principal ventaja de esta técnica sobre el método existente como el injerto de células en el medio de cultivo celular o PBS, es que el gel de fibrina puede retener la célula en el centro de la lesión y el cóctel de grasa bruta puede apoyar su supervivencia. Aunque este método puede proporcionar información sobre cómo crecen y funcionan las células madre neurales en la médula espinal lesionada en adultos, también se puede aplicar a otros sistemas, como las lesiones cerebrales traumáticas. Comience el procedimiento de transacción anestesiando a una pescadora adulta de 150 a 200 gramos, 3 ratas de 44 o ratas desnudas atímicas de 180 a 220 gramos utilizando métodos aceptables.

Espere para continuar hasta que los animales estén profundamente anestesiados y no muestren respuestas a los pellizcos de la cola y las patas. A continuación, aplicar pomada para los ojos, afeitar la zona torácica superior y limpiar la piel con Betadine. Comience la cirugía cortando la piel y el músculo con una cuchilla número 15 exponiendo una vértebra T tres usando un retractor quirúrgico, y luego usando un Realice una laminectomía en la vértebra T tres para exponer la médula espinal T tres cuatro.

A continuación, haga una incisión longitudinal de dos milímetros de largo en la línea media del DRA con una cuchilla número 11. Ahora coloque las tijeras de iridectomía debajo de la Dora y corte lateralmente a través de todo el hemicord derecho. Realice otro corte en el mismo lado, 1,5 milímetros más y ahora aspire el tejido de la médula espinal entre los dos segmentos cortados con una aguja roma de calibre 23 conectada a un vacío de intensidad moderada.

Asegúrese de que la transección esté completa tanto ventral como lateralmente. Esto completa la sección lateral del HEMI para extender la lesión a una médula espinal de ancho completo. La transección coloca incisiones en espejo en el hemicordón izquierdo.

Intente mantener la duramadre aún intacta, de modo que conserve una matriz firme de fibrina del injerto. Cuando se injerta dos semanas después, ahora sutura el músculo, aplique antibiótico en polvo y estabilice la piel. Inmediatamente después de la operación.

Inyectar tres mililitros de ringers lactato que contengan dosis de ina y ampicilina. Luego, mantenga a las ratas en una incubadora caliente hasta que se restablezca la regulación térmica. Durante las próximas dos semanas, dos veces al día, vacíe la vejiga e inyecte los ringers y la solución de ampicilina.

Esto se puede detener cuando regresa el reflejo de vaciado de la vejiga. Preparar GFPF 3 44 ratas hembras con una inyección de DESI para sincronizar la recolección de embriones y hacerlos madurar con machos que expresan GFP el día de la recolección de embriones y el injerto. Haya preparado los cócteles de factor de crecimiento que contienen fibrinógeno y trombina y guárdelos en hielo hasta que se mezclen con las células.

Recoja los embriones a los 13.5 a 14.5 días después del coto en tampón HBSS frío. Examine los embriones para determinar la expresión de GFP con una linterna nocturna de mar y gafas de filtro, o con un microscopio fluorescente. Ahora, de forma aséptica, diseccione la médula espinal de cada feto GFP positivo.

Retire las meninges suprayacentes y fije los ganglios espinales con tijeras de iridectomía y pinzas de joyería fina. A continuación, recoja la médula espinal disecada en dos mililitros de tampón HBSS frío en un tubo cónico de 15 mililitros. Manténgalos en hielo.

A continuación, disocia la médula espinal. Una vez completado, cuente las células con un hemocitómetro y divídalas en partes iguales en dos tubos de microcentrífuga. Centrifugar las celdas y eliminar completamente el snat con una punta de vacío bajo durante un período de uno a dos minutos.

Los cócteles de factores de crecimiento no deben ser diluidos por el sobrenadante restante después del resus. Ahora suspenda cada mitad de las células en la solución de trabajo de fibrinógeno o trombina que contiene los factores de crecimiento a una concentración de 250.000 células por microlitro. Almacene las células en hielo antes del trasplante.

Comenzar el trasplante abriendo la lesión a la médula espinal T tres cuatro dos semanas después de la transacción de la médula espinal. Para evitar la ululación prematura, mezcle las células con fibrinógeno. A continuación, utilizando pipetas de vidrio estirado conectadas a un pico spritzer.

Por separado, inyecte aproximadamente cinco microlitros de células de fibrinógeno y cinco microlitros de células de trombina, y en nueve puntos del sitio de la lesión a través del tejido cicatricial sellado y Dora intacto sin volver a abrir el sitio de la lesión para realizar una inyección directa de células sin volver a abrir el sitio de la lesión, use una aguja de calibre 27 para crear nueve pequeños orificios en la superficie del tejido cicatricial y Dora intacta una semana después de la lesión, luego inyectar medio volumen de las soluciones mixtas de fibrinógeno y trombina en los tres puntos medios del sitio de la lesión y un cuarto de volumen en los tres puntos en la interfaz rostral y la interfaz coddle injertó NSCS de rata resuspendida en PBS sin una matriz de fibrina y factores de crecimiento que sobrevivieron mal en el sitio de transección T tres. Estas células marcadas con GFP solo se adhieren al margen del huésped de la lesión y dejan la mayor parte del sitio de la lesión vacío cuando las células se injertaron solo con NSC de matriz de fibrina. La supervivencia mejoró, pero el injerto no llenó las cavidades grandes de la lesión. Sin embargo, la inclusión de nscs de rata en matrices de fibrina con un cóctel de factores de crecimiento mejoró consistentemente su supervivencia, les permitió llenar grandes cavidades de lesiones y les permitió diferenciarse en neuronas y glía.

Después de la transección de la médula espinal 15 a 17, se encontró el mismo resultado con las nscs humanas, que también llenaron completamente la cavidad de la lesión. Cuando se evaluó siete semanas después del injerto, un estudio de curso temporal reveló que el NSCS que expresaba GFP sobrevivió 24 horas después del trasplante, el NSCS injertado se volvió gradualmente más denso y llenó completamente la cavidad de la lesión seccionada en la primera semana después del trasplante, probablemente debido a la proliferación. Además, el NSCS injertado se integró bien en la interfaz de la lesión del huésped y parece reducir las regiones de inmunorreactividad de GFAP en los márgenes de la cavidad de la lesión.

Una parte del NSCS injertado se diferenció en neuronas nuevas y expresivas siete semanas después del trasplante. Además, las neuronas de la médula espinal derivadas del injerto extendieron un gran número de axones en la médula espinal del huésped, roy y mimosamente a largas distancias. Los aumentos más altos revelan que los axones derivados del injerto se extendieron a través de la sustancia blanca y la materia gris en la médula espinal del huésped.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos como la electrofisiología y el análisis del comportamiento para aprender sobre la conectividad funcional de las neuronas injertadas.