Name: La potenciación a largo plazo de la Vía Perforante-giro dentado sinapsis en comportarse libremente Ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprende a registrar la potenciación a largo plazo en ratones de comportamiento libre mediante microelectrodos implantados en la vía perforante y el giro dentado. Este método permite estudiar neurofisiología en modelos de enfermedades neurológicas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer a las siguientes: Dr. Joseph Bronzino, Dr. Khamis Abu-Hassaballah, Sr. RJ Austin-LaFrance, y la Sra. Jessica Koranda.

Este protocolo es adecuado para ratones de 3 y 18 meses de edad y el peso corporal aproximado de 30-50 g). Los ratones se pueden obtener de El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME). Todos los protocolos quirúrgicos y experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo Trinity College y estaban de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. 1. Preparación de los animales y Procedimientos Quirúrgicos <ol><li> Preparar cóctel que contiene la anestesia de ketamina (25 mg / ml), xilazina (2,5 mg / ml) y acepromacina (0,5 mg / ml). Inyectar 1 ml / kg de peso corporal en el cuadrante inferior derecho del abdomen, complementado por inyecciones de 0,2 ml / kg cada 45 minutos a partir de entonces para mantener una profundidad estable de anestesia usando el reflejo de retirada pedal. </li><li> Preparar ratón anestesiado para la cirugía por el afeitado el pelo de su cráneo usando una máquina de afeitar eléctrica. El área afeitada debe incluir el centro de los ojos a la mitad de los oídos. Asegúrese de no afeitarse la whiskers, ya que forman parte del sistema sensorial del barril del ratón. </li><li> Use hisopos de algodón para aplicar alcohol isopropílico seguido de Betadine a la zona de afeitado en la cabeza. Entonces, también el uso de bastoncillos de algodón, se aplica una pequeña cantidad de aceite mineral en los ojos para evitar que los globos oculares de secado. </li><li> Utilice manguitos del oído de ratas lactantes en lugar de barras de oreja regulares para montar la cabeza del animal en el aparato marco estereotáxico. Para ello, primero montar la oreja izquierda en el puño del oído izquierdo. Entonces aliviar un poco la oreja derecha en el puño derecho, apoyando suavemente la cabeza del animal con una mano y el avance del manguito del oído con la otra mano. Luego, coloque un cojín eléctrico bajo el cuerpo del animal y ponerlo a 86 ° C para mantener la temperatura corporal. </li><li> A continuación, compruebe si hay rigidez bilateral al intentar mover la cabeza de lado a lado. El animal está montado correctamente en el marco estereotáxico cuando la cabeza es rígida y no se puede mover de lado a lado, pero puede girar fácilmente hacia arriba y abajo. </li><li> Descansar suavemente lahocico del ratón sobre la barra de la nariz / diente de montaje asegurándose de que los incisivos están descansando suavemente pero con seguridad dentro de la abertura de los dientes de la barra de la nariz / diente. </li><li> Con un bisturí estéril practicar una incisión en la línea media a partir de la mitad de los ojos hasta la mitad de las orejas. Asegúrese de que el bisturí se llevará a cabo en un ángulo de 45 ° y aplicar suficiente presión para cortar a través de la fascia subyacente, pero no a través del cráneo ya que esto causará sangrado excesivo. </li><li> Use hisopos de algodón para separar la fascia y exponer el cráneo. Cráneo hitos bregma y lambda debe ser claramente visible (fig. 1A). Asegúrese de que el animal está en la posición cráneo plano mediante el ajuste de la barra de la nariz / diente de tal manera que bregma y lambda puntos de referencia están en la misma posición dorsoventral (DV) (+ 0,1 mm). </li><li> Aplique una pequeña cantidad de solución salina estéril al área expuesta y usar hisopos de algodón para limpiar suavemente el cráneo. Luego, esperar 2-3 minutos para que el cráneo se sequen completamente al aireantes de proceder. </li><li> Montar una aguja en el brazo estereotáxica izquierda para medir la posición de DV bregma y lambda. El posicionamiento de DV de estos dos puntos de referencia debe estar dentro de 0,1 mm el uno del otro. Si no, la barra de la nariz del marco estereotáxico se puede ajustar hacia arriba y hacia abajo para lograr esto. </li><li> Coloque la aguja en bregma para grabar su anterior-posterior (AP), lateral (LAT) y (DV) mediciones dorsoventral. Asegúrese de que la aguja toque el cráneo y no penetra en ella. </li><li> Utilice un ratón atlas del cerebro, tales como &quot;el cerebro del ratón en estereotáxica Coordenadas&quot; 1, para determinar las coordenadas de las estructuras de destino: vía medial perforante (MPP) en el haz angular y giro dentado (GD) del hipocampo, en relación con lambda y bregma, respectivamente (véase también el cuadro 1). A continuación, utilice un bolígrafo de punta fina o un lápiz para marcar estos puntos en el cráneo. </li><li> También, marque dos puntos más en el lado contralateral del cráneo. Estos puntos which servirá como la masa (GND) y de referencia (REF) debe ser de aproximadamente 3 mm de la línea media y colocado longitudinalmente con relación a cada otra (Figura 1A, también la Tabla 1). </li><li> Quite el marcador de la aguja del brazo estereotáxica izquierda y reemplazarlo con un taladro dental eléctrico equipado con un montaje estereotáxica. Coloque el taladro sobre cada punto marcado y hacer pequeños agujeros de trépano de aproximadamente 0,5 mm de diámetro. Al taladrar, use un movimiento hacia arriba y hacia abajo repetitivo y comprobar con frecuencia si el simulacro ha penetrado en el cráneo para exponer la superficie del cerebro. </li><li> Con suavidad pero con firmeza conducir un electrodo de tornillo (# 0-80 1/8 de los tornillos de máquina de acero inoxidable, ranurado fillister cabeza) en cada uno de los agujeros contralateral (GND y REF) de tal manera que sólo tocan la superficie cortical sin penetrar en él (Figura 1A ). Estos dos electrodos de tornillo sirven de suelo y de referencia. </li><li> Mount estimulantes y grabación electrodos en electroDe los titulares en los brazos estereotáxica izquierdo y derecho, respectivamente. </li><li> Conectar los terminales de electrodo de estimulación a un estimulador electrofisiológico con el aislamiento de corriente y el terminal de electrodo de registro a un amplificador electrofisiológico diferencial (ganancia = 1,000, filtro de paso de banda = 1 Hz-3 kHz) y luego a un osciloscopio digital para la inspección visual de las respuestas evocadas. Además, conecte GND y terminales de los electrodos REF al amplificador diferencial. </li><li> Suave y lentamente baja estimulante y electrodos de grabación en incrementos de 0,5 mm, mientras que el seguimiento de la respuesta evocada visualmente a un choque de estímulo de 600 a 800 uA. Continúe bajando cada electrodo hasta que llegan a su respectiva posición DV meta y se observa una señal estereotipada en el osciloscopio (Figura 1B). </li><li> Después, utilizar el cemento acrílico dental para hacer una tapa para mantener los terminales de los electrodos en su lugar, cualquier cemento dental que toca la piel debe limpiarseinmediatamente. Una vez que el cemento dental está completamente curado transferir al animal del marco estereotáxico a una jaula de roedores limpia. Utilice una lámpara de calor o una almohadilla para mantener la temperatura central. </li><li> Monitorear el animal cada hora hasta que se recupere la conciencia. Una inyección de flunixina se puede administrar como un analgésico. </li></ol> 2. La inducción de LTP <ol><li> Deje que los animales de 5-7 días para recuperarse de la cirugía. Colocar el animal en el entorno de grabación que consiste en una jaula de Faraday (122 cm x 43 cm x 43 cm) equipado con material de insonorización y un conmutador giratorio 5-canal que conecta el electrodo conduce a la configuración de estimulante / grabación. </li><li> Permita que el animal se aclimate durante 1-2 horas en el entorno de grabación antes de conectar los electrodos a los instrumentos de estimulación y registro (consulte el paso 1.17). </li><li> Ajuste los controles del estimulador de la producción de 400 uA y registrar la amplitud de un promedio de 10 respuestas evocadas asegurándose ªen al menos 10 segundos transcurrido entre los estímulos. Utilice el método que se muestra en la Figura 1C para cuantificar la respuesta evocada. Repita este procedimiento para 600, 800, 1.000, 1.200, y 1.400 uA. </li><li> Construir una curva de entrada / salida por el trazado de la amplitud media de la respuesta evocada frente a la intensidad del estímulo. De esta figura determinar la intensidad del estímulo que corresponde a 50% de la amplitud máxima medida. Utilice la intensidad de 50% para el resto del experimento. </li><li> Entonces, usando la intensidad del estímulo 50%, obtener una línea de base mediante el registro de la amplitud media de 5 respuestas evocadas cada minuto durante 15 minutos. Una vez más asegurarse de que al menos 10 segundos transcurrido entre estímulos. </li><li> Posteriormente entregar la estimulación tetánica que consiste de 10 ráfagas de 10 pulsos suministrados a 400 Hz con una velocidad de ráfaga de 5 Hz a la vía perforante medial. Monitorear el animal para detectar signos de convulsiones, incluyendo sacudidas de perro mojado. Si el animal tiene una convulsión del experiment debe ser terminada y todos los datos de ese animal debe ser excluido de los resultados del estudio. </li><li> Luego, continuará grabando la amplitud promedio de 5 respuestas evocadas cada minuto durante 30 minutos posttetanization. Después de eso, comparar esta amplitud a la amplitud de línea de base obtenida en la etapa 2.5 mediante el cálculo del porcentaje de cambio desde la línea base (Figura 2). </li><li> Tras la conclusión de los experimentos, el animal es sacrificado por medio de la inhalación de isoflurano-un método que sea consistente con las Directrices sobre la eutanasia de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria. </li></ol>

<ol><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Compact 2nd edn, Elsevier Academic Press. (2004).</li>
<li>Bliss, T. V. P., Lomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+potentiation+of+synaptic+transmission+in+the+dentate+area+of+the+anesthetized+rabbit+following+stimulation+of+the+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anesthetized rabbit following stimulation of the perforant path.</a> J. Physiol. 232, 331-356 (1973).</li>
<li>Blaise, J. H., Bronzino, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+stimulus+frequency+and+age+on+bidirectional+synaptic+plasticity+in+the+dentate+gyrus+of+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effects of stimulus frequency and age on bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of freely moving rats.</a> Exp. Neurol. 182, 497-506 (2003).</li>
<li>Blaise, J. H., Koranda, J. L., Chow, U., Haines, K. E., Dorward, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+isolation+stress+alters+bidirectional+long-term+synaptic+plasticity+in+amygdalo-hippocampal+synapses+in+freely+behaving+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Neonatal isolation stress alters bidirectional long-term synaptic plasticity in amygdalo-hippocampal synapses in freely behaving adult rats.</a> Brain Res. 1193, 25-33 (2008).</li>
<li>Koranda, J. L., Masino, S. A., Blaise, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+synaptic+plasticity+in+the+dentate+gyrus+of+the+awake+freely+behaving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of the awake freely behaving mouse.</a> J. Neurosci. Methods. 167, 160-166 (2008).</li>
<li>Cooke, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophosphorylation+of+alphaCaMKII+is+not+a+general+requirement+for+NMDA+receptor-dependent+LTP+in+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Autophosphorylation of alphaCaMKII is not a general requirement for NMDA receptor-dependent LTP in the adult mouse.</a> J. Physiol. 574, 805-818 (2006).</li>
<li>Davis, S., Bliss, T. V., Dutrieux, G., Laroche, S., Errington, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+duration+of+long-term+potentiation+in+the+hippocampus+of+the+freely+moving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Induction and duration of long-term potentiation in the hippocampus of the freely moving mouse.</a> J. Neurosci. Methods. 75, 75-80 (1997).</li>
<li>Jones, M. W., Peckham, H. M., Errington, M. L., Bliss, T. V., Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+in+the+hippocampus+of+awake+C57BL%2F6+and+DBA%2F2+mice%3A+interstrain+differences+and+parallels+with+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity in the hippocampus of awake C57BL/6 and DBA/2 mice: interstrain differences and parallels with behavior.</a> Hippocampus. 11, 391-396 (2001).</li>
<li>Zhang, T. A., Tang, J., Pidoplichko, V. I., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addictive+nicotine+alters+local+circuit+inhibition+during+the+induction+of+in+vivo+hippocampal+synaptic+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Addictive nicotine alters local circuit inhibition during the induction of in vivo hippocampal synaptic potentiation.</a> J. Neurosci. 30, 6443-6453 (2010).</li>
<li>Tang, J., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+enables+in+vivo+synaptic+plasticity+associated+with+the+addictive+drug+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dopamine enables in vivo synaptic plasticity associated with the addictive drug nicotine.</a> Neuron. 63, 673-682 (2009).</li>
</ol>

Los autores tienen nada que revelar.

En este protocolo, hemos demostrado un método fiable y sencillo para el estudio de LTP en la Dirección General en ratones comportarse libremente. Mientras que muchos estudios de LTP en ratas despiertas se han realizado 3,4, muy pocos se han realizado en ratones despiertos todo debido a la complejidad técnica que supone la inmobiliaria craneal limitada en ratones y el peso de Headstages electrodos en relación con el peso medio de 5 ratones. Los pocos estudios que han demostrado la PLP en la Direcció...

El desarrollo de la tecnología para manipular genes ha producido transgénicos y knock-out modelos de ratón de casi todas las enfermedades neurodegenerativas y neurológicas. Esto ha requerido traducción de técnicas de investigación electrofisiológicos utilizados previamente en especies de roedores más grandes en el modelo animal de ratón. Una de tales técnicas de investigación neurofisiológica es el uso de la potenciación a largo plazo (LTP) para probar la eficacia de las conexiones sinápticas dentro de las redes neuronales implicados en diversos trastornos neuropatológicos. Este protocolo describe las técnicas para la investigación electrofisiológica fiable de LTP en comportarse libremente ratones. La ventaja de este protocolo sobre otros es que es simple y fácil de implementar, sino que también es bastante menos costoso, ya que no requiere ni el uso de costosos sistemas de microdrive controlados por el ordenador ni Headstages transistor de efecto de campo, y, a nuestro conocimiento, es el primer protocolo de video de grabaciones electrofisiológicas crónicas to estudiar la LTP en comportarse libremente ratones. Con este fin, se describe en este artículo metodologías sencillas para estudiar la potenciación a largo plazo en ratones comportarse libremente. Estas metodologías pueden ser fácilmente traducidos a modelos transgénicos y knockout de ratón de trastornos neuropatológicos.

<table><tbody><tr><td>Ketamina (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina (20 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>33197</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazina (10 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>2177</td><td></td></tr><tr><td>Polvo acrílico dental</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>1330CLR</td><td></td></tr><tr><td>Líquido acrílico dental</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>1306CLR</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de tungsteno (0,127 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>TGW0515</td><td></td></tr><tr><td>Tubo hipodérmico de acero inoxidable (0,286 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>832400</td><td></td></tr><tr><td>Flunixin (50 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>14165</td><td></td></tr><tr><td>Epoxilyte</td><td>Superior Essex</td><td>EP 6001-M</td><td></td></tr><tr><td>Inserto de alambre de acero inoxidable (0,2 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>792900</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de marco estereotáxico</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modelo 902</td><td></td></tr><tr><td>Ear cuffs (auriculares)</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modelo 921</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador electrofisiológico</td><td>Astro-Med, Inc.</td>Osciloscopio digital <td>S88</td><td></td></tr><tr><td></td><td>B K Precision Corp.</td><td>2542</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de aislamiento de corriente</td><td>Astro-Med, Inc.</td><td>PSIU-6</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador diferencial</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>DAM-50</td><td></td></tr><tr><td>Conmutador</td><td>Plastics One</td><td>SLC6</td><td></td></tr><tr><td>Taladro dental</td><td>Stoelting</td><td>58650</td><td></td></tr></tbody></table>

la potenciación a largo plazo de la vía perforante-giro dentado sinapsis en comportarse libremente ratones

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Estudios de la potenciación a largo plazo de la eficacia sináptica, un fenómeno sináptica dependiente de la actividad que tiene propiedades que lo hacen atractivo como un potencial mecanismo celular de almacenamiento de aprendizaje y la información subyacente, han sido durante mucho tiempo utilizado para elucidar la fisiología de varios circuitos neuronales en el hipocampo, la amígdala , y otras estructuras límbicas y corticales. Con esto en mente, los modelos de ratones transgénicos de enfermedades neurológicas representan plataformas útiles para llevar a cabo la potenciación a largo plazo (LTP) estudios para desarrollar una mayor comprensión de la función de los genes en la comunicación sináptica normal y anormal en las redes neuronales implicadas en el aprendizaje, la emoción y la información procesamiento. En este artículo se describen las metodologías para la inducción de LTP en forma confiable el ratón libremente comportarse. Estas metodologías se pueden utilizar en estudios de transgénicos y Knockout comportarse libremente modelos de ratón de enfermedades neurodegenerativas.

La Tabla 1 muestra las coordenadas de la DG y mPP empleado en el presente protocolo Figura 1A muestra las marcas de las estructuras diana en el cráneo;.. También se muestran la ubicación de los electrodos de tierra y de referencia Figura 1B ilustra representante respuesta evocada traza tanto pre- y posttetanization en el mismo animal. Tenga en cuenta que la posttetanization respuesta evocada es mayor que la respuesta pretetanization que es indicativo de la inducción de ...

Transgénicos y knockout modelos de ratón de enfermedades neurológicas son útiles para estudiar el papel de los genes en la neurofisiología normal y anormal. Este artículo describe metodologías que pueden utilizarse para estudiar la potenciación a largo plazo, un mecanismo celular que puede ser la base de aprendizaje y la memoria, en transgénicos y knockout libremente comportarse modelos de ratón de la neuropatología.

La potenciación a largo plazo de la Vía Perforante-giro dentado sinapsis en comportarse libremente Ratones

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la grabación de la PTL en un modelo de ratón libre de movimiento. Esto se logra primero mediante la implantación quirúrgica de microelectrodos en la vía perforante y el giro dentado. El segundo paso consiste en registrar las respuestas evocadas basales en el giro dentado en respuesta a la estimulación con un solo pulso de la vía perforante.A continuación, se induce la potenciación a largo plazo (LTP) tras un protocolo de estimulación tetanizante. El paso final consiste en registrar las respuestas postsinápticas y compararlas con los valores basales. Finalmente, se observa un aumento en la amplitud del potencial de espiga poblacional.Las medidas de la respuesta evocada se utilizan para mostrar la inducción sucesiva de la PTP. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la preparación de cortes en vitro es que el modelo del ratón libremente comportante proporciona la plataforma fisiológicamente más relevante para evaluar los efectos de fármacos neurofarmacológicos o de manipulaciones genéticas en modelos animales de enfermedades neurológicas humanas. Comience este procedimiento afeitando el vello de la parte superior de la cabeza del ratón desde la zona justo por encima de los ojos hasta un poco delante de las orejas, teniendo cuidado de no afeitar los bigotes, ya que forman parte del sistema sensorial somatosensorial del ratón.A continuación, limpie el área afeitada primero con alcohol isopropílico, luego con Betadine y luego aplique una pequeña cantidad de aceite mineral con bastoncillos de algodón sobre los ojos para evitar que se sequen. Transfiera el ratón al aparato estereotáxico. Utilice protectores para orejas de rata lactante en lugar de barras auriculares regulares para sujetar la cabeza del animal, colocando primero la oreja izquierda en el protector auricular izquierdo.Luego, coloque suavemente la oreja derecha sobre el manguito derecho, sosteniendo la cabeza del animal con una mano y avanzando el manguito de la oreja con la otra mano. A continuación, coloque una almohadilla calefactora debajo del cuerpo del animal y ajústela a 86 grados Fahrenheit para mantener la temperatura corporal. Luego, verifique la rigidez bilateral intentando mover la cabeza de lado a lado; el animal está correctamente colocado en el marco estereotáxico cuando la cabeza está rígida y no puede moverse de lado a lado, pero puede girar fácilmente hacia arriba y hacia abajo.Posteriormente, coloque el hocico del ratón sobre el ensamblaje de la barra dental y asegúrese de que los incisivos descansen suavemente pero firmemente dentro de la abertura dental de la barra. Con un escalpelo estéril, realice una incisión media comenzando desde el punto medio entre los ojos hasta el centro de las orejas. Asegúrese de que el escalpelo se mantenga en un ángulo de 45 grados y de aplicar suficiente presión para cortar la fascia subyacente, pero sin atravesar el cráneo, ya que esto provocaría una hemorragia excesiva.Luego, use hisopos de algodón para separar la fascia y hemostatos curvos para exponer el cráneo. Los puntos de referencia del cráneo, bgma y lambda, deben ser claramente visibles. Asegúrese de que el cráneo del animal esté nivelado ajustando la barra dental de manera que bgma y lambda se encuentren en la misma posición DV.A continuación, limpie el cráneo expuesto con una pequeña cantidad de solución salina estéril y espere de dos a tres minutos para que el cráneo se seque completamente al aire antes de continuar. Después de eso, monte una aguja en el brazo estereotáxico izquierdo. Para medir las posiciones DV de bgma y lambda.Asegúrese de que estén dentro de 0,1 milímetro uno del otro. Si no es así, ajuste la barra nasal del marco estereotáxico hacia arriba y hacia abajo para lograrlo. Luego, coloque la aguja sobre B bgma y registre sus mediciones AP L-A-T-N-D-V.Asegúrese de que la aguja toque apenas el cráneo y no lo penetre. Utilice un atlas cerebral de ratón para determinar las coordenadas de las estructuras diana en relación con lambda y bgma. En nuestro caso, son la vía perent medial en el haz angular y el giro dentado del hipocampo.Luego, use un bolígrafo o lápiz de punta fina para marcar estos puntos en el cráneo. A continuación, marque dos puntos más en el lado contralateral del cráneo. Estos puntos, que servirán como tierra, deben estar a unos tres milímetros de la línea media y colocados longitudinalmente uno respecto al otro.A continuación, retire el marcador de aguja del brazo estereotáxico izquierdo y sustitúyalo por un taladro dental eléctrico equipado con un soporte estereotáxico. Coloque el taladro sobre cada punto marcado y realice pequeñas perforaciones de aproximadamente 0,5 milímetros de diámetro. Durante la perforación, utilice un movimiento repetitivo hacia arriba y hacia abajo, verificando frecuentemente si el taladro ha penetrado el cráneo para exponer suavemente pero firmemente la superficie cerebral; luego, introduzca un electrodo de tornillo en cada uno de los orificios contralaterales de manera que apenas toque la superficie cortical sin penetrarla.Estos dos electrodos de tornillo sirven como tierra y referencia. A continuación, monte los electrodos de estimulación y registro en los porta-electrodos situados en los brazos estereotáxicos izquierdo y derecho, respectivamente. Posteriormente, conecte los terminales del electrodo de estimulación a un estimulador electrofisiológico con aislamiento de corriente y el terminal del electrodo de registro a un amplificador diferencial electrofisiológico, y luego a un osciloscopio digital para la inspección visual de las respuestas evocadas.A continuación, conecte los terminales del electrodo de tierra y del electrodo de referencia al amplificador diferencial, y baje lentamente el electrodo estimulante hacia la vía medial perran y el electrodo de registro hacia el giro dentado en incrementos de 0,5 milímetros. Utilice el osciloscopio para monitorear la respuesta evocada a un estímulo de pulso único. Con cada descenso progresivo de los electrodos, siga bajándolos hasta que alcancen sus posiciones DV objetivo respectivas y se observe una señal típica en el osciloscopio. Use cemento acrílico dental para fabricar una capucha que mantenga los terminales de los electrodos en su lugar.Cualquier cemento dental que entre en contacto con la piel debe eliminarse inmediatamente. Una vez que el cemento dental esté completamente curado, traslade al animal desde el marco estereotáxico a una jaula limpia para roedores y utilice una lámpara o almohadilla calefactora para mantener la temperatura central. Monitoree al animal cada hora hasta que recupere la conciencia.Se puede administrar una inyección de fuxin como analgésico después de permitir que el animal se recupere de la cirugía durante cinco a siete días. Colóquelo en el entorno de grabación, que consiste en una jaula de Faraday equipada con material insonorizante y un conmutador rotatorio de cinco canales que conecta el electrodo con el sistema de estimulación y grabación. Permita que el animal se aclimate durante una a dos horas en el entorno de grabación antes de conectar los electrodos a los instrumentos de estimulación y grabación.A continuación, ajuste los controles del estimulador para emitir 400 microamperios. Registre la amplitud de un promedio de 10 respuestas evocadas, dejando transcurrir al menos 10 segundos entre cada estímulo, y repita este procedimiento para 600, 800, 1000, 1200 y 1400 microamperios. Luego, utilice el método mostrado en esta figura para cuantificar la amplitud de las respuestas evocadas.Construya una curva entrada-salida graficando la amplitud promedio de la respuesta evocada frente a la intensidad del estímulo. Luego, determine la intensidad del estímulo que corresponde al 50 % de la amplitud máxima medida, y utilice esta intensidad para el resto del experimento. Ahora, obtenga una línea base registrando la amplitud promedio de cinco respuestas evocadas cada minuto durante 15 minutos, con al menos 10 segundos transcurridos entre estímulos.Posteriormente, administre la estimulación Titanic a la vía medial perent. Mientras tanto, supervise estrechamente al animal en busca de signos de convulsión, incluyendo temblores similares a los de un perro mojado. Si el animal sufre una convulsión, el experimento debe interrumpirse y todos los datos obtenidos de ese animal deben excluirse de los resultados del estudio.Luego, continúe registrando la amplitud promedio de cinco respuestas evocadas cada minuto durante 30 minutos. Después de la postimpresionación, compare esta amplitud con la amplitud basal obtenida previamente calculando el porcentaje de cambio respecto a la línea basal. Aquí se muestra la ilustración esquemática de la ubicación relativa de los electrodos sobre el cráneo del ratón, y estas son las trazas típicas de las respuestas evocadas, tanto antes como después de la postimpresionación.Esta figura muestra la inducción de la PTL en la sinapsis del giro dentado de la vía periférica medial de un ratón libremente consciente. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar frecuentemente al animal para asegurar que se mantenga la profundidad de la anestesia.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una cirugía estereotáxica para implantar crónicamente microelectrodos, que se utilizan posteriormente para registrar la potenciación a largo plazo (LTP) en un ratón libre de movimiento.

long-term-potentiation-perforant-pathway-dentate-gyrus-synapse-freely

Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

En este artículo se describen los procedimientos para la preparación de rodajas de hipocampo de ratas y ratones transgénicos para el estudio de las alteraciones sinápticas del cerebro asociadas con el envejecimiento y relacionadas con la edad las enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Alzheimer.

Preparación de la aguda rodajas de hipocampo de ratas y ratones transgénicos para el estudio de las alteraciones sinápticas durante el envejecimiento y la patología amiloide

Fuente: Zhao, Z. et al. Un método invasivo para la activación de la circunvolución dentada del ratón mediante estimulación de alta frecuencia. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra el protocolo para administrar estimulación cerebral profunda de alta frecuencia a una circunvolución dentada del hipocampo de ratón, detallando sus efectos sobre la activación neuronal, la plasticidad sináptica y la neurogénesis.

Estimulación de alta frecuencia para mejorar la activación neuronal y la neurogénesis en la circunvolución dentada del ratón

En este trabajo se presenta una metodología completa para preparar y...

Mejora de la preparación y conservación de las rebanadas de hipocampo de un ratón de grabación muy estable y reproducible de la potenciación a largo plazo

La técnica de abrazadera del remiendo de rebanada es un método eficaz para el análisis de los cambios inducidos por el aprendizaje en las propiedades intrínsecas y la plasticidad de las sinapsis excitatorias o inhibitorias.

Slice Patch Clamp técnica para analizar la plasticidad inducida por el aprendizaje

Este protocolo muestra cómo establecer un método confiable de HFS en ratones. Las neuronas en el hipocampo giro dentado son estimuladas eléctricamente por HFS directamente e indirectamente en vivo. La actividad neuronal y señalización molecular son examinados por c-fos y coloración inmunofluorescente de Notch1, respectivamente; la neurogénesis se cuantifica por bromodeoxiuridina etiquetado ensayo.

Un método invasivo para la activación de la convolución del cerebro dentada de ratón por el estímulo de alta frecuencia

Este método describe una preparación crónica que permite el acceso óptico al hipocampo de ratones vivos. Esta preparación se puede utilizar para realizar imágenes ópticas longitudinales de plasticidad estructural neuronal y plasticidad celular evocada por la actividad durante un período de varias semanas.

Imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos

Utilizamos electrodos de grabación y estimulación en rodajas longitudinales del cerebro del hipocampo y electrodos de registro y estimulación posicionados longitudinalmente en el hipocampo dorsal in vivo para evocar potenciales postsinápticos extracelulares y demostrar plasticidad sináptica a largo plazo a lo largo del interlamellar longitudinal CA1.

Investigación de la plasticidad sináptica a largo plazo en Interlamellar Hippocampus CA1 por grabación de campo electrofisiológica

Este artículo tiene como objetivo describir un protocolo sistemático para obtener rebanadas cerebrales hipocampales horizontales en ratones. El objetivo de esta metodología es preservar la integridad de las vías de fibra del hipocampo, como la trayectoria perforante y el tracto de fibra musgo para evaluar los procesos neurológicos relacionados con el giro desánido.

Rebanadas hipocampales horizontales del cerebro del ratón

Aquí, describimos un protocolo para inducir la plasticidad a largo plazo de la excitabilidad intrínseca neuronal en neuronas de relevo del núcleo geniculado lateral dorsal mantenido en cortes de cerebro ex vivo.

Inducción de plasticidad a largo plazo de la excitabilidad neuronal intrínseca en neuronas del núcleo geniculado lateral dorsal

La actividad locomotora (LMA) es una medición simple y de fácil realización de comportamiento en ratones. Acoplamiento de software de seguimiento de vídeo (VTS) y LMA permite la mejora de la especificidad y la sensibilidad, especialmente cuando se compara con el manual, el método de cruce de línea de análisis LMA. Además VTS permite el seguimiento a largo plazo de ratón LMA.

Ratón de corto y largo plazo la actividad locomotriz analizados por el software de seguimiento de vídeo

Aprende a registrar la potenciación a largo plazo en ratones de comportamiento libre mediante microelectrodos implantados en la vía perforante y el giro dentado. Este método permite estudiar neurofisiología en modelos de enfermedades neurológicas.

La potenciación a largo plazo de la Vía Perforante-giro dentado sinapsis en comportarse libremente Ratones

Explorar más videos