Name: Alta resolución todo el montaje de In Situ La hibridación en embriones de pez cebra para estudiar la expresión génica y la función (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-19T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Aprende hibridación in situ de montaje completo en embriones de Danio rerio para analizar expresión génica espaciotemporal. Este protocolo mejora la detección de transcritos de baja abundancia con alta resolución.

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<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Wolman, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genetics+in+larval+zebrafish%3A+learning+from+the+young%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young.</a> Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).</li>
<li>Lawson, N. D., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetic+approaches+for+the+analysis+of+vertebrate+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish.</a> Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).</li>
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<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+embryonic+expression+of+zebrafish+PCSK5+co-orthologues%3A+functional+assessment+during+lateral+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development.</a> Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).</li>
<li>Liao, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCL%2FTal-1+transcription+factor+acts+downstream+of+cloche+to+specify+hematopoietic+and+vascular+progenitors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish.</a> Genes Dev. 12, 621-626 (1998).</li>
<li>Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloche%2C+an+early+acting+zebrafish+gene%2C+is+required+by+both+the+endothelial+and+hematopoietic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages.</a> Development. 121, 3141-3150 (1995).</li>
<li>Detrich, H. W. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraembryonic+hematopoietic+cell+migration+during+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+gene+cloche+acts+upstream+of+a+flk-1+homologue+to+regulate+endothelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation.</a> Development. , 124-381 (1997).</li>
<li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li>
<li>Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+three+zebrafish+genes+related+to+distal-less%3A+part+of+a+homeobox+gene+code+for+the+head%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head.</a> J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).</li>
<li>Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((casanova+plays+an+early+and+essential+role+in+endoderm+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish.</a> Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).</li>
<li>Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+PDX-1+structure%2C+function%2C+and+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish.</a> Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).</li>
<li>Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+trout+insulin+promoter%3A+implications+for+fish+as+a+favorable+model+of+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development.</a> FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).</li>
<li>Biemar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+in+zebrafish%3A+early+dispersed+appearance+of+endocrine+hormone+expressing+cells+and+their+convergence+to+form+the+definitive+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet.</a> Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+zebrafish+snail1+gene+and+its+expression+in+wild-type%2C+spadetail+and+no+tail+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos.</a> Development. 119, 1203-1215 (1993).</li>
<li>Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+progranulin+gene+family+and+antisense+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts.</a> BMC Genomics. 6, 156(2005).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+zebrafish+and+knockdown+technology+to+define+proprotein+convertase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity.</a> Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Hemos desarrollado métodos mejorados para visualizar ARN con alta resolución. La hibridación in situ en los procedimientos se llevan a cabo utilizando simples cestos hechos a medida con fondos porosos (Figura 1). Los embriones se procesaron utilizando soluciones libres de RNasa en placas de 6 pocillos a temperatura ambiente en condiciones estériles. Para segregar embriones cestas están hechas de diferentes tubos Eppendorf de colores. Cestas con o sin un borde se uti...

El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo animal de gran alcance para el estudio de desarrollo de los vertebrados, la enfermedad, el comportamiento, y en la detección de drogas 1-3. Embriones de pez cebra se pueden obtener en grandes cantidades a partir de un solo cruce. La fertilización y el desarrollo se produce fuera del útero y los embriones ópticamente transparentes se desarrollan rápidamente. Eventos de desarrollo críticos se producen durante las primeras 48 horas después de la fecundación (HPF). Esto incluye la aparición de primordios de órganos y la iniciación de citodiferenciación. Desmontables o sobre-expresión de proteínas se puede lograr a través de la microinyección de embriones con antisentido morfolino (MO) oligonucleótidos o ARNm, respectivamente, a la una o dos etapas de células (0,75 HPF). El deseo de los embriones de pez cebra facilita el estudio de la expresión espacio-temporal de los genes de interés. Aplicación de la técnica DESEO después de la microinyección de embriones con ARNm o MO a la sobre-exprESS o los niveles de proteína específicos desmontables revela regulación diferencial de otros genes. Los cambios en los patrones de expresión de genes pueden ser correlacionados con los cambios fenotípicos y revelan la función de los genes diana durante la embriogénesis temprana. Dado que las sondas pueden prepararse y almacenarse de antemano, la técnica ISH se puede aplicar para revelar los patrones de expresión de genes por lo menos 20 genes a la vez el uso de placas de seis pocillos y las cestas hechas a medida.

<table><tbody>Kit de clonación <tr><td>Taq Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10342053</td><td></td></tr><tr><td>TopoTA - Promotor Dual pCRII-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K4650-01</td><td></td></tr><tr><td>HQ Mini Kit de Purificación de Pásmidos</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-01</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roche</td><td>11 685 660 001</td><td></td></tr><tr><td>Not1 y HindIII Enzimas de restricción</td><td>Invitrogen</td><td>15441-025, 15207-012</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Fenol saturado,</td><td>Invitrogen</td> ultrapuro <td>15513039</td><td>almacenar a 4 &deg;C. Irritante de ojos, piel y vías respiratorias y presunto carcinógeno. Se debe tener cuidado al manipularlo.</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fisher</td><td>C607-1</td><td>Tóxico y sospechoso de ser cancerígeno. Trabaje debajo de la campana extractora.</td></tr><tr><td>ADNasa libre de RNasa I</td><td>Roche 4716728001</td><td></td><td>Prepare pequeñas alícuotas y almacene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Mezcla de marcaje DIG-RNA con ARN polimerasa Sp6, T7 y T3</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la ARNasa</td><td>Roche</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M Acetato de sodio (pH 5.5)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7355</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Alcoholes comerciales Dietil</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pirocarbonato (DEPC)</td><td>Sigma</td><td>40718-25ML</td><td>El DEPC es un irritante para los ojos, la piel y las vías respiratorias. Evite el contacto con la piel y los ojos. Use gafas de seguridad, guantes y mascarilla.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M (pH 8.0)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7404</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de acuarios</td><td>instantáneos de sal oceánica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Fisher</td><td>FL-03-0900</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>Prepare y almacene a -20 ° C. C como alícuotas de 40 ml para su uso posterior. El PFA es tóxico. Use gafas de seguridad, guantes y mascarilla contra el polvo.</td></tr><tr><td>Feniltiocarbomide (PTC)</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTC es altamente tóxico. Use gafas de seguridad, guantes y mascarilla contra el polvo.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A947-4</td><td></td></tr><tr><td>Dumont (Relojero' s) Patrón de pinzas n.º 5</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cluster de cultivo celular de seis pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>Las cestas están hechas de malla de nailon y tubos Eppendorf Preparación</td><td></td><td></td> interna <td>Para hacer las cestas, corte tubos Eppendorf (1,5 ml) con o sin bordes para quitar el extremo cónico. Corte la malla de nailon en pedazos pequeños correspondientes al tamaño de&nbsp; los extremos cortados de los tubos Eppendorf. Coloque los tubos con la malla de nailon que cubre el extremo cortado en un ... placa caliente hasta que tanto el tubo como la malla de nylon se peguen (llevar en campana de gases). Corta el exceso de malla de las cestas y guárdalas en metanol 100% hasta que se utilicen.</td></tr><tr><td>Polioxietilenosmonolaurato orbital (Tween 20)</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Anhídrido Acético</td><td>Sigma</td><td>242845</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamina</td><td>Sigma</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formamida, grado de alta pureza</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>AG501-X8 Resina</td><td>Bio Rad</td><td>142-6424</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico monohidrato</td><td>Sigma</td><td>C0706-500G</td><td></td></tr><tr><td>Heparina Sal de Sodio</td><td>Sigma</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de citrato salino-sódico (SSC)</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>ARNt de levadura de panadería tipo X</td><td>Sigma</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>S25403</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de levamisol</td><td>Sigma</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformamida anhidro (DMF)</td><td>Sigma</td><td>227056</td><td>Irritante, tóxico, combustible y sospecha de teratógeno. Manéjelo con ropa de seguridad adecuada, incluidos guantes y gafas.</td></tr><tr><td>5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP)</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td>Proteja esta solución de la luz.</td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolio (NBT)</td><td>Sigma</td><td>840W</td><td>Protege esta solución de la luz.</td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino, fracción V purificada (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Ovejas Anti-digoxigenina-AP Fab Fragmentos Roche</td><td></td><td>1093274910</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de 96 pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>83.1835</td><td></td></tr><tr><td>Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2</td><td>ZIRC</td><td>Tg(mnx1:GFP)ml2</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de</td><td>acuarios</td> Instant Ocean N<td>/A</td><td></td></tr></tbody></table>

alta resolución todo el montaje de<em&gt; in situ</em&gt; la hibridación en embriones de pez cebra para estudiar la expresión génica y la función

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Este artículo se centra en todo el montaje hibridación in situ (deseo) de embriones de pez cebra. La tecnología DESEO facilita la evaluación de la expresión génica tanto en términos de distribución en los tejidos y la etapa de desarrollo. Los protocolos se describen para el uso de la voluntad de embriones de pez cebra utilizando sondas de ARN antisentido marcadas con digoxigenina. Las sondas se generan mediante la incorporación de nucleótidos unidos a digoxigenina mediante transcripción in vitro de plantillas de genes que han sido clonados y linealizado. Los chorions de embriones cosechados en etapas de desarrollo definidas se eliminan antes de la incubación con sondas específicas. Siguiendo un procedimiento de lavado para eliminar el exceso de sonda, los embriones se incuban con anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina. Mediante el empleo de un sustrato cromogénico para la fosfatasa alcalina, la expresión de genes específicos puede ser evaluada. Dependiendo del nivel de la expresión génica todo el procedimiento puede ser completado dentro de 2-3 días.

Utilizando el protocolo con 50 embriones por canasta (por gen / por condición experimental) el patrón de expresión de ese gen se puede lograr en un solo experimento. Casi todos los embriones muestran patrones similares de expresión para un gen particular. Los ejemplos representativos de la tinción en hibridación in situ se muestran en las Figuras 3-6. Tanto el sentido y anti-sentido ribosondas se sintetizan a partir de los ADNc correspondientes a PC5.1 PC5....

El pez cebra, un pequeño pez tropical, se ha convertido en un modelo popular para el estudio de la función de genes durante el desarrollo de vertebrados y la enfermedad. La expresión temporal y espacial de los genes diana se puede determinar mediante<em&gt; In situ</em&gt; Hibridación. Nuestro protocolo mejorado permite la detección de bajos abundantes transcripciones con baja señal de fondo no específica.

Alta resolución todo el montaje de<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en embriones de pez cebra para estudiar la expresión génica y la función

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la expresión espacio-temporal de genes específicos de interés dentro de embriones de pez cebra en etapas. Esto se logra generando primero sondas CD NA mediante la incorporación de oxígeno digo en nucleótidos enlazados mediante transcripción in vitro. A continuación, los embriones se cosechan en etapas de desarrollo definidas.Se extrae el corium y los embriones se almacenan en metanol a 20 grados centígrados negativos. Luego, después de la digestión y la postfijación, los embriones se hibridan con las sondas adecuadas. Finalmente, los embriones se tiñen con el gen antída y los anticuerpos y la señal se desarrolla con sustratos para la fosfatasa alcalina.En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la distribución tisular de la expresión génica en una etapa de desarrollo dada a través de hibridación e imágenes in situ de montaje completo. Aunque este método puede proporcionar una mayor comprensión de la expresión normal del gen diana, también se puede aplicar a otras afecciones, como la expresión del gen diana en el modelo de enfermedad y cuando otros genes están sobreexpresados o infraexpresados. Uso de la tecnología de microinyección Uso de CDNA para un gen de interés, configure una reacción de etiquetado de ARN para sintetizar oxígeno digo en sondas de ARN marcadas en un vial de reacción libre de ARN agregando de uno a cinco microgramos de ADN molde purificado a ARN estériles libres de agua destilada doble tratada hasta un volumen de 13 microlitros.Enfríe la reacción en hielo y agregue los siguientes reactivos después de mezclar suavemente la centrífuga 2000 RPM durante 30 segundos a temperatura ambiente antes de incubar la reacción durante dos horas a 37 grados centígrados después de la incubación, retire el ADN molde agregando dos microlitros de ARN libres. Los ADNs se incuban durante 30 minutos a 37 grados centígrados y detienen la reacción añadiendo dos microlitros de EDTA 0,2 molar, precipitan los productos de la reacción añadiendo 2,5 microlitros de cloruro de litio cuatro molares y 75 microlitros de etanol 100%. Mezcle la solución e incube a 20 grados centígrados bajo cero durante 45 minutos o toda la noche.Centrifugar la suspensión durante 30 minutos a 13.000 rpm y cuatro grados centígrados. Luego lave el pellet con etanol al 70% con agua fría después de girar durante 10 minutos. Secar el pellet durante dos minutos antes de resus, suspendiéndolo en 50 microlitros de nucleasa, agua bidestilada libre.Luego incubarlo durante 30 minutos. A 37 grados centígrados, haga funcionar uno o dos microlitros de la sonda en un gel de 1%aros durante unos 30 minutos para verificar su calidad e integridad. A continuación, utilice un espectrofotómetro para cuantificar la sonda y rehidratar embriones previamente fijados y congelados.Comience haciendo canastas cortando los extremos cónicos de microtubos de 1,5 mililitros. A continuación, retire las llantas superiores de la mitad de ellos. Corta pequeños trozos de malla de nailon para cubrir los extremos, y luego, en una capucha, calienta los extremos del tubo en una placa calefactora eléctrica y presiónalos en la malla después de que se hayan enfriado.Retire el exceso de malla de nailon y guarde las cestas en metanol al 100% a temperatura ambiente. Después de preparar la dilución sucesiva de metanol en PBS, de acuerdo con el protocolo de texto y agregar cuatro mililitros de cada uno en los pocillos de un plato de seis pocillos, colocar los embriones en cestas individuales para cada sonda e incubarlos en la serie de metanol PBS durante cinco minutos por pocillo, terminando con tres lavados en PBST. Perme los embriones con proteinasa K a temperatura ambiente, utilizando los siguientes tiempos de incubación por etapa de desarrollo.A continuación, fije los embriones en aldehído paraformado al 4% en PBS durante 20 minutos y lávelos en PBST tres veces durante cinco minutos cada uno. A continuación, prepare la mezcla de acetilación según el protocolo de texto e incube los embriones dos veces durante 10 minutos cada una. A continuación, lavar los embriones y el PBST dos veces durante 10 minutos cada uno.Transfiera los embriones a microtubos estériles e incube con 200 microlitros de mezcla de hibridación o HM, en un baño de agua a 70 grados centígrados durante dos a cuatro horas. Agregue de 100 a 200 nanogramos de sonda a la solución e incube durante la noche a 70 grados Celsius en un baño de agua. Reemplace la solución de la sonda con HM precalentado e incube las muestras a 70 grados Celsius durante 15 minutos.Después de someter las muestras a una serie H-M-S-S-C y bloquear los embriones de acuerdo con el protocolo de texto, incubar los embriones en una dilución de 1 a 5.000 de anticuerpo anti-D AP en tampón de bloqueo durante la noche a cuatro grados Celsius con una suave agitación al día siguiente. Lavar los embriones seis veces durante 15 minutos cada uno. Después de teñir previamente los embriones, incubarlos en BCIP y NBT.Agregue temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. Use un microscopio estereoscópico para monitorear la reacción de tinción cada 30 minutos para detener la reacción. Transfiera las cestas de embriones a los pocillos que contengan la solución de parada dos veces durante 10 minutos cada una con una agitación suave.Después de la fijación posterior de los embriones con 4% de formaldehído en PBS durante 20 minutos. Monte los embriones transfiriéndolos en la menor cantidad posible de PBS a seis placas de pocillos que contienen 100% glicerol. Mece suavemente los embriones en la oscuridad a temperatura ambiente, imagen nocturna en 100% glicerol bajo un microscopio estereoscópico.Aquí se muestran ejemplos representativos de tinción in situ a hibridación. La tinción púrpura observada después de la hibridación con ribosonda de interés representa tanto la abundancia como los sitios de expresión de un gen en particular. Por ejemplo, PC 5.1 muestra una expresión muy discreta dentro de la parte anterior y posterior de la vesícula ótica y la línea lateral primordial a las 24 horas después de la fertilización y está fuertemente localizada dentro de los mástiles neuromagnéticos de la línea lateral anterior y posterior a las 72 horas después de la fertilización.Por el contrario, PC 5.2 muestra una expresión ubicua dentro del SNC con una regionalización distinta dentro de la vesícula ótica de los somitos y el conducto frico propenso, y se expresa en gran medida en el hígado y el intestino a las 96 horas después de la fertilización. La ausencia de expresión génica cuando se utilizan las sondas Ribo de sentido respectivo sirve como un control negativo, como se ve aquí. Los análisis de expresión de los marcadores sanguíneos mostraron tinción de SCL T one dentro de las células craneales bilaterales y en la masa celular intermedia o ICM.Aunque la tinción para gata one también se observa dentro del ICM, el patrón de expresión es diferente. La expresión de F-L-K-K-D-R-L se observó dentro de los vasos principales e intersegmentarios del cerebro posterior, y en la tinción ICM para erizo sónico se observó en el cordón no. En estos ejemplos, la expresión de DLX dos a las 34 horas después de la fertilización se localiza en el hipotálamo Talon Cephalon y los arcos mesenquimales craneales y en el FK D seven Fox, una expresión de una a las 24 horas después de la fertilización se observa principalmente en la placa del piso y la expresión de HypoChlor.Los patrones de los marcadores pancreáticos mostraron tinción de insulina en el páncreas endocrino y tripsina en el páncreas exocrino. Los resultados que muestran patrones de expresión con alta resolución confirman el éxito del protocolo descrito para la detección de la expresión de genes de alta y baja abundancia mostrados. Estos son algunos ejemplos de experimentos realizados en condiciones óptimas.Por ejemplo, una señal de fondo alta con una pobre expresión sonora de erizo resultó de una hibridación inadecuada, permeable y de hibridación entre 55 y 60 grados centígrados. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la hibridación completa en dos embriones de pez cebra utilizando sondas de ARN marcadas en zanja, tinción posterior a la hibridación e imágenes.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Todo el montaje hibridación in situ es una de las técnicas más utilizadas en la biología del desarrollo. Aquí se presenta una alta resolución de doble fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para analizar el patrón de expresión precisa de un solo gen y para determinar la superposición de los dominios de expresión de dos genes. Se incluye un yoduro de propidio nuclear tinción de contraste para destacar la organización del tejido.

Pez cebra todo el montaje de alta resolución doble fluorescente In Situ La hibridación

Todo el montaje utilizando In situ La hibridación de Enlace de Organismos y Biología Molecular

Una forma rápida para llevar a cabo la inmunotinción del corazón embrionario del pez cebra se describe. En comparación con el enfoque de montaje inmunotinción todo, este método aumenta considerablemente la penetración de los anticuerpos, lo que permite obtener imágenes de alta resolución que revelan la estructura celular / subcelular en el corazón dentro de un tiempo de procesamiento muy reducida.

Inmunotinción de Disección del corazón embrionario de pez cebra

El embrión de pez cebra es un excelente modelo para la investigación de la biología del desarrollo. Durante la embriogénesis, el desarrollo de pez cebra con una masa de yema, que presenta retos en tres dimensiones para la observación de muestras y análisis. Este protocolo se describe cómo crear dos dimensiones planas montar preparaciones de todo el montaje in situ (WISH), teñidas muestras de embriones de pez cebra.

Preparativos Piso en observación y análisis de embrión de pez cebra muestras teñidas por todo el montaje<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Se describen las técnicas de inmunotinción fosfo-epítopos en embriones de pez cebra enteros y luego llevar a cabo la localización de dos colores confocal de fluorescencia en las estructuras celulares tan pequeños como los cilios primarios. Las técnicas para la fijación y formación de imágenes pueden definir la ubicación y la cinética de la aparición o la activación de proteínas específicas.

Inmunotinción fosfo-epítopos en ciliadas Órganos de todo el montaje embriones de pez cebra

Desarrollo de cilios es vital para la correcta organogénesis. Este protocolo describe un método optimizado para la etiqueta y visualizar las células ciliadas del pez cebra.

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

Las tecnologías de edición de genes han permitido a los investigadores generar mutantes de peces cebra para investigar la función génica con relativa facilidad. Aquí, proporcionamos una guía para realizar el genotipado de embriones paralelos y la cuantificación de señales de hibridación in situ en peces cebra. Este enfoque imparcial proporciona una mayor precisión en los análisis fenotípicos basados en la hibridación in situ.

Genotipado y cuantificación de la tinción de hibridación in situ en el pez cebra

Este artículo describe un método para montar embriones frágiles de pez cebra para microscopía confocal de lapso de tiempo extendido. Este método de bajo costo es fácil de realizar utilizando platos regulares de microscopía de fondo de vidrio para obtener imágenes en cualquier microscopio invertido. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones.

Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo para la detección de proteínas mediadas por anticuerpos fluorescentes en preparaciones enteras de embriones y larvas de peces cebra.

Inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra

El pez cebra es un modelo importante para comprender el desarrollo renal. Aquí, se optimiza un protocolo de hibridación in situ para detectar la expresión génica en larvas y juveniles de pez cebra durante el desarrollo de mesonephros.

In situ Hibridación en larvas y juveniles de pez cebra durante el desarrollo de Mesonephros

Este protocolo describe cómo obtener imágenes combinando hibridación in situ e inmunohistoquímica de secciones embrionarias de pez cebra. La hibridación in situ se realizó antes de la criosección, seguida de tinción de anticuerpos. Es útil detectar los patrones de expresión de dos genes en el pez cebra si hay escasez de anticuerpos.

In situ Hibridación combinada con inmunohistoquímica en embriones crioseccionados de pez cebra

Aprende hibridación in situ de montaje completo en embriones de Danio rerio para analizar expresión génica espaciotemporal. Este protocolo mejora la detección de transcritos de baja abundancia con alta resolución.

Alta resolución todo el montaje de In Situ La hibridación en embriones de pez cebra para estudiar la expresión génica y la función (Video) | JoVE Journal

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