Name: Los ensayos de viabilidad de las células en cultivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprende ensayos de viabilidad celular que combinan mediciones de ATP con inmunotinción e imagen infrarroja. Este método evalúa la función metabólica y la integridad estructural de manera objetiva.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Reconocemos Juliann Jaumotte a la idea de ahorrar en los volúmenes de reactivos en el ensayo de ATP. Estamos profundamente agradecidos por el apoyo administrativo extraordinario de María Caruso, Deb Willson, y Jackie Farrer y para la Escuela de Farmacia de Mylan para proporcionar apoyo financiero para estos estudios. Gracias también a las Enfermedades Hunkele Temido Fundación y el Parkinson y Trastornos del Movimiento de la Fundación por su apoyo financiero de los estudios primarios de neuronas.

Ninguno de los autores tiene ningún conflicto a revelar.

Hemos encontrado que la intensidad de la señal en los tres ensayos de viabilidad es lineal y se correlacionó con densidad de placas. Sin embargo, no todos los ensayos son igualmente sensibles a 2 veces o cambios 1.5 veces en la densidad de placas. Para las células N2a, los ensayos de infrarrojos son menos sensibles que el ensayo de ATP, particularmente a densidades más bajas de chapado. Aunque los ensayos de infrarrojos son menos sensibles que los ATP, los ensayos DRAQ5 + Zafiro y los ensayos de α-tubulina están en buen...

El ensayo de viabilidad más común en las ciencias biológicas implica el recuento de células. Esto se evidencia por un análisis de los mejores (los más recientes) 200 publicaciones que aparecieron en PubMed con cualquiera de las palabras clave &quot;in vitro&quot; o &quot;cultura&quot; en 29/04/2013 y 30/04/2013. De estas publicaciones, el 23,5% utilizan ensayos de recuento de células, incluyendo recuento de número de células manuales, el número de células automatizado cuenta con software de imágenes, y Trypan exclusión de azul. El ensayo Live / Dead se utilizó en el 1% de estas publicaciones. El número de publicaciones utilizando el MTT (3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) de ensayo para la viabilidad metabólica era 11%. Esta revisión de la literatura también muestra que el número de publicaciones que utilizan ensayos tales como MTT junto con ensayos de recuento de células fue sólo del 3,5%. A pesar de la tendencia a usar un ensayo de viabilidad por sí mismo, la evaluación de la función celular en combinación con el número de células parece ser la mejor elección para la evaluación de i celularntegridad. Los recuentos de células por sí mismas no son suficientes debido a que las células restantes pueden no ser funcional o sano a pesar de que están presentes en el pocillo 1,2. A la inversa, las medidas funcionales tales como ATP pueden aumentar o disminuir en ausencia de cambios paralelos en el número de células. El desacoplamiento de las lecturas metabólicas del número de células sugiere que los ensayos de la ATP y MTT nunca debe ser usado como el único ensayo de viabilidad. En el presente informe, tres ensayos de viabilidad control que analicen tanto las estructuras celulares y la función metabólica se describen, por una visión más completa de la integridad celular que cualquier ensayo por sí solo puede permitirse. Dos de nuestros ensayos requieren una cámara infrarroja que mide la fluorescencia en los 700 y 800 nm canales. El ruido es baja en las longitudes de onda infrarrojas, lo que lleva al aumento de la relación señal-ruido 3. El generador de imágenes Odyssey que usamos tiene un rango dinámico 4,5 log y una profundidad de bits de 16, Translatinga 2 16 o 65.536 tonos de infrarrojos. Esto se puede contrastar con imágenes en color de 8 bits, que sólo ofrece 2 8 o 256 tonos de color para cada longitud de onda. Por lo tanto, de formación de imágenes de 16 bits tiene una resolución más fina. Cabe señalar que las imágenes infrarrojas originales son a menudo pseudocoloreada verde (800 nm) y roja (700 nm) en los informes publicados para la presentación. Cámaras Odyssey son de uso común tanto para Western Blot e In-Cell Westerns 4-7. Dentro de la célula del Oeste en las células fijadas con formaldehído utilizan anticuerpos primarios contra cualquier proteína de interés y etiquetarlos a su vez con anticuerpos secundarios fluorescentes infrarrojos. Esta técnica es conocida por ser particularmente útil para los puntos finales de fosforilación 6. En nuestra en la celda del Oeste, que tiñe las células fijadas para las proteínas del citoesqueleto α-tubulina o microtúbulos neuronales proteína asociada 2 (MAP2) en el canal de 800 nm. Estas proteínas son lo suficientemente abundantes para producir alta relación señal-ruido. También tiñe nuestros platos en el 700canal nm para núcleos con la mancha de DRAQ5 y para el citoplasma con la mancha de zafiro. Tanto las proteínas del citoesqueleto y las DRAQ5 + manchas Sapphire por lo tanto reflejan las estructuras celulares. El tercer ensayo de viabilidad mide la función metabólica y se llama &quot;célula Titulación Glo.&quot; En este ensayo basado en la luciferasa, los valores de luminiscencia están en proporción directa a los niveles de ATP. Ensayos de ATP se utilizan comúnmente para cuantificar las células viables 8-12. Sin embargo, incluyendo la palabra &quot;título&quot; en el nombre del ensayo es algo de un nombre inapropiado porque la producción de ATP por célula puede cambiar como una función de los tratamientos de toxina y es, por tanto, no siempre en proporción al número de células 8. Los niveles de ATP también pueden verse afectados por los ritmos circadianos 13 y por la división celular y la diferenciación celular 14 15. Sin embargo, el ensayo de ATP se muestra aquí es simple de realizar y útil porque ATP es una medida robusta de metabólicaviabilidad 16-21, si no del teléfono celular número en sí. Utilizando este ensayo para complementar el infrarrojo en la celda del Oeste, por lo tanto se obtiene un panorama más completo de la integridad celular de un ensayo de cualquier solo.

<table><tbody><tr><td>Cell Titer Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Compre en cantidades de 100 ml y alícuota, en lugar de comprar la cantidad más cara de 10 ml. Los reactivos reconstituidos y no utilizados se pueden volver a congelar a -20 °C; C durante al menos 21 semanas</td></tr><tr><td>18% de formalina</td><td>Thermo-Shandon</td><td>9990244</td><td>La compra de este fijador evita el pesaje de los polvos de formaldehído y la ebullición de la solución; De este modo, se minimiza la exposición a los vapores</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>No es esencial añadir esto a las soluciones de formaldehído, pero mejora el aspecto de las células fijas</td></tr><tr><td>Odyssey Block</td><td>LI-COR</td><td>927-40003</td><td>Este suero de pescado se puede comprar a granel y congelar a -20 & grados; C para uso a largo plazo</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568</td><td>Almacenamos una solución madre de Triton-X 100 al 10% en agua estéril a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Fosfato de Sodio Monobásico</td><td>Fisher</td><td>S468</td><td>También se pueden comprar tabletas de PBS o 10x soluciones de PBS, pero son más caras</td></tr><tr><td>Fosfato de Sodio Dibásico</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td>Ver arriba</td></tr><tr><td>Azida de Sodio (250x)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>7144.8-16</td><td>No compre el polvo porque la azida de sodio es muy tóxica. Almacenamos todos nuestros anticuerpos usados en 1x azida de sodio a 4 & grados; C hasta que se contaminen con desechos</td></tr><tr><td>Anti-&alfa;-tubulina de ratón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td>Este anticuerpo es caro, pero puede diluirse mucho y es muy específico</td></tr><tr><td>Anti-MAP2 de ratón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942</td><td>Este anticuerpo es caro pero es muy específico (un requisito previo para los westerns en células)</td></tr><tr><td>800 nm IgG LI-COR</td><td></td><td>926-32210</td><td>Otras compañías también venden anticuerpos secundarios infrarrojos. Asegúrese de comprar los anticuerpos altamente adsorbidos y tenga en cuenta que las concentraciones de IgG pueden variar según la fuente</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td>Este compuesto solía ser vendido por LI-COR a 1 mM</td></tr><tr><td>Zafiro</td><td>LI-COR</td><td>928-40022</td><td></td></tr><tr><td>Luminómetro</td><td>PerkinElmer</td><td>VICTOR3 1420 Contador</td><td></td>multietiqueta</tr><tr><td>Odyssey Imager</td><td>LI-COR</td><td>9201-01</td><td></td>Productos de Investigación de</tr><tr><td>Agitadores/Mezcladores</td><td>248555</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

los ensayos de viabilidad de las células en cultivo

Viability Assays for Cells in Culture

Manual de células en un microscopio son un medio sensible de la evaluación de la viabilidad celular, pero consumen mucho tiempo y por lo tanto caro. Ensayos de viabilidad computarizados son costosos en términos de equipo, pero puede ser más rápido y más objetivo que el recuento de células manuales. El presente informe se describe el uso de tres de estos ensayos de viabilidad. Dos de estos ensayos son de infrarrojos y uno es luminiscente. Ambos ensayos infrarrojos se basan en un Imager 16 bits Odyssey. Un ensayo de infrarrojos utiliza la mancha de DRAQ5 para los núcleos combinados con la mancha de zafiro de citosol y se visualiza en el canal de 700 nm. El otro ensayo de infrarrojos, una en la celda Occidental, utiliza anticuerpos contra las proteínas del citoesqueleto (proteína asociada α-tubulina o microtúbulos 2) y los etiqueta en el canal 800 nm. El tercer ensayo de viabilidad es un ensayo luminiscente comúnmente utilizado para el ATP, pero usamos un cuarto del volumen recomendado para ahorrar en coste. Estas mediciones son lineales y se correlacionan con el número de CElls plateado, pero varían en sensibilidad. Todos los tres ensayos de eludir microscopía de tiempo y muestrean todo el pozo, reduciendo así el error de muestreo. Por último, todos los ensayos fácilmente se puede completar en un día del final del experimento, lo que permite un mayor número de experimentos a realizar en plazos cortos. Sin embargo, todos ellos se basan en el supuesto de que el número de células permanecen en proporción a la intensidad de la señal después de los tratamientos, la suposición de que a veces no se cumple, especialmente para ATP celular. Además, si las células aumentan o disminuyen de tamaño después del tratamiento, esto podría afectar la fuerza de la señal sin afectar el número de células. Llegamos a la conclusión de que todos los ensayos de viabilidad, incluidos los recuentos manuales, adolecen de una serie de advertencias, pero que los ensayos de viabilidad computarizados son bien vale la pena la inversión inicial. El uso de los tres ensayos en conjunto da una visión completa de la estructura y la función celular.

El factor limitante de la velocidad en estos experimentos es la tinción de infrarrojos, como el ensayo de ATP es relativamente de breve duración. Para los ensayos de infrarrojos, anticipamos que ocho placas de 96 pocillos se pueden teñir y escanean el plazo de un día a la asombrosa cifra de dos lotes de cuatro platos cada una (ver Figura 1). Esta estimación asume 20 min de la fijación, de 30 minutos de lavado, 30 min de bloqueo, 2 horas de incubación del anticuerpo primario seguido de 30 min de los lava...

Los compuestos terapéuticos a menudo se examinaron por primera vez in vitro con los ensayos de viabilidad. Recuentos de células ciegos por un observador humano puede ser muy sensible a pequeños cambios en el número de células, pero no evaluar la función. Ensayos de viabilidad computarizados, tal como se describe aquí, pueden evaluar tanto la estructura y función de una manera objetiva.

Los ensayos de viabilidad de las células en cultivo

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar múltiples ensayos de viabilidad que proporcionen una visión más completa de la aptitud celular de la que puede ofrecer un solo ensayo por sí solo. Esto se logra primero midiendo los niveles de ATP de células sembradas para evaluar la función metabólica. El segundo paso consiste en inmunotincionar proteínas del citoesqueleto, como la alfa tubulina o la proteína asociada a microtúbulos dos, utilizando anticuerpos infrarrojos con longitudes de onda de 800 nanómetros.A continuación, las células se marcan con drac cinco infrarrojo y zafiro para teñir el núcleo y el citoplasma a 700 nanómetros. El paso final consiste en obtener imágenes de la alfa tubulina o map dos y del drac cinco más zafiro a ambas longitudes de onda, 700 y 800 nanómetros, en un imagenador infrarrojo. En definitiva, estos ensayos luminiscentes e infrarrojos proporcionan información sobre las estructuras anatómicas y la función fisiológica.La principal ventaja de estas técnicas frente a los métodos existentes, como el ensayo de viabilidad MTT, es la medición rápida y sensible de múltiples aspectos de la integridad celular. Estos métodos pueden ayudar a responder pre

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Determinar el número de células en cultivo es importante en la normalización de las condiciones de cultivo y en la realización de experimentos precisa cuantificación. En este vídeo, se demuestra cómo las células se contaron usando un hemocitómetro.

Contar y determinar la viabilidad de las células cultivadas

La aplicabilidad del ensayo para evaluar la viabilidad clonigénicas reproductiva se ha establecido desde hace más de 50 años. Aquí se demuestra el procedimiento general para llevar a cabo el ensayo clonogénico con células adherentes.

Ensayo clonigénicas: las células adherentes

Una modificación en 3-D in vitro sistema se presenta en el que las características del crecimiento de varias líneas de células tumorales en la membrana basal reconstituida se correlacionan con el comportamiento inactivo o proliferativa de las células tumorales en un sitio secundario...

Un In Vitro Sistema para el Estudio de latencia del tumor y el salto hacia el crecimiento metastásico

Este video describe una técnica basada en impedancia celular para estudiar la cinética de supervivencia de los virus que inducen efectos citopáticos. El método mide la impedancia eléctrica de las células adherentes infectadas por el virus pretratadas con solución salina.

Ensayo cinético de supervivencia basado en impedancia celular para evaluar la supervivencia del virus

Se describe un bioensayo sencillo basado en células para la detección, cuantificación y seguimiento de la actividad de los miembros de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular de ligandos. El ensayo utiliza receptores quiméricos expresados ​​en una línea celular dependiente de factor para proporcionar una evaluación semi-cuantitativa o cuantitativa de la unión al receptor y la reticulación por el ligando.

Un ensayo biológico simple para la Evaluación de Factores de Crecimiento Endotelial Vascular

A menudo es necesario evaluar la citotoxicidad potencial de un conjunto de compuestos en las células cultivadas. Aquí, describimos una estrategia para detectar compuestos tóxicos de forma fiable en un formato de 96 pozos.

Una estrategia para identificar compuestos que afectan el crecimiento celular y la supervivencia en células de mamíferos cultivadas a un rendimiento bajo a moderado

Aquí, presentamos varios métodos simples para evaluar la viabilidad y la muerte en esferoides de células cancerosas 3D, que imitan los gradientes fisicoquímicos de los tumores in vivo mucho mejor que el cultivo 2D. El modelo esferoide, por lo tanto, permite evaluar la eficacia del fármaco oncológico con una mejor traducción a condiciones in vivo.

Evaluación de la viabilidad celular y la muerte en cultivos esferoides 3D de células cancerosas

Este protocolo demuestra métodos para permitir el cultivo in vitro extendido de xenoinjertos derivados del paciente (PDX). Un paso mejora la viabilidad general de los cultivos de racimos multicelulares en hidrogeles 3D, a través de la eliminación directa de células individuales no viables. Un paso secundario demuestra las mejores prácticas para el cultivo de PDX en una plataforma microfluídica perfundida.

Viabilidad mejorada para cultivos de hidrogel 3D Ex vivo de xenoinjertos derivados del paciente en una plataforma microfluídica perfundida

Este protocolo presenta ensayos de citotoxicidad de uso común (ensayos Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red y MTT) adaptados para la evaluación de la citotoxicidad en líneas celulares de embrión de pez cebra (ZEM2S) e hígado (ZFL) en placas de 96 pocillos.

Ensayos de citotoxicidad con líneas celulares de pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar la supervivencia post-estrés en muestras de levadura. El ensayo emplea dos colorantes fluorescentes, SYTO 9 y yoduro de propidio (PI), para cuantificar la integridad de la membrana plasmática. Utiliza la citometría de flujo para proporcionar estimaciones cuantitativas y reproducibles de las fracciones de células vivas, muertas y dañadas para muestras de estrés postoxidativo.

Un ensayo VIVO/MUERTO optimizado junto con citometría de flujo para cuantificar la supervivencia post-estrés en células de levadura

Aprende ensayos de viabilidad celular que combinan mediciones de ATP con inmunotinción e imagen infrarroja. Este método evalúa la función metabólica y la integridad estructural de manera objetiva.

Los ensayos de viabilidad de las células en cultivo

Explorar más videos