Name: Los ensayos de viabilidad de las células en cultivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprende ensayos de viabilidad celular que combinan mediciones de ATP con inmunotinción e imagen infrarroja. Este método evalúa la función metabólica y la integridad estructural de manera objetiva.

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Reconocemos Juliann Jaumotte a la idea de ahorrar en los volúmenes de reactivos en el ensayo de ATP. Estamos profundamente agradecidos por el apoyo administrativo extraordinario de María Caruso, Deb Willson, y Jackie Farrer y para la Escuela de Farmacia de Mylan para proporcionar apoyo financiero para estos estudios. Gracias también a las Enfermedades Hunkele Temido Fundación y el Parkinson y Trastornos del Movimiento de la Fundación por su apoyo financiero de los estudios primarios de neuronas.

Ninguno de los autores tiene ningún conflicto a revelar.

Hemos encontrado que la intensidad de la señal en los tres ensayos de viabilidad es lineal y se correlacionó con densidad de placas. Sin embargo, no todos los ensayos son igualmente sensibles a 2 veces o cambios 1.5 veces en la densidad de placas. Para las células N2a, los ensayos de infrarrojos son menos sensibles que el ensayo de ATP, particularmente a densidades más bajas de chapado. Aunque los ensayos de infrarrojos son menos sensibles que los ATP, los ensayos DRAQ5 + Zafiro y los ensayos de α-tubulina están en buen...

El ensayo de viabilidad más común en las ciencias biológicas implica el recuento de células. Esto se evidencia por un análisis de los mejores (los más recientes) 200 publicaciones que aparecieron en PubMed con cualquiera de las palabras clave &quot;in vitro&quot; o &quot;cultura&quot; en 29/04/2013 y 30/04/2013. De estas publicaciones, el 23,5% utilizan ensayos de recuento de células, incluyendo recuento de número de células manuales, el número de células automatizado cuenta con software de imágenes, y Trypan exclusión de azul. El ensayo Live / Dead se utilizó en el 1% de estas publicaciones. El número de publicaciones utilizando el MTT (3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) de ensayo para la viabilidad metabólica era 11%. Esta revisión de la literatura también muestra que el número de publicaciones que utilizan ensayos tales como MTT junto con ensayos de recuento de células fue sólo del 3,5%. A pesar de la tendencia a usar un ensayo de viabilidad por sí mismo, la evaluación de la función celular en combinación con el número de células parece ser la mejor elección para la evaluación de i celularntegridad. Los recuentos de células por sí mismas no son suficientes debido a que las células restantes pueden no ser funcional o sano a pesar de que están presentes en el pocillo 1,2. A la inversa, las medidas funcionales tales como ATP pueden aumentar o disminuir en ausencia de cambios paralelos en el número de células. El desacoplamiento de las lecturas metabólicas del número de células sugiere que los ensayos de la ATP y MTT nunca debe ser usado como el único ensayo de viabilidad. En el presente informe, tres ensayos de viabilidad control que analicen tanto las estructuras celulares y la función metabólica se describen, por una visión más completa de la integridad celular que cualquier ensayo por sí solo puede permitirse. Dos de nuestros ensayos requieren una cámara infrarroja que mide la fluorescencia en los 700 y 800 nm canales. El ruido es baja en las longitudes de onda infrarrojas, lo que lleva al aumento de la relación señal-ruido 3. El generador de imágenes Odyssey que usamos tiene un rango dinámico 4,5 log y una profundidad de bits de 16, Translatinga 2 16 o 65.536 tonos de infrarrojos. Esto se puede contrastar con imágenes en color de 8 bits, que sólo ofrece 2 8 o 256 tonos de color para cada longitud de onda. Por lo tanto, de formación de imágenes de 16 bits tiene una resolución más fina. Cabe señalar que las imágenes infrarrojas originales son a menudo pseudocoloreada verde (800 nm) y roja (700 nm) en los informes publicados para la presentación. Cámaras Odyssey son de uso común tanto para Western Blot e In-Cell Westerns 4-7. Dentro de la célula del Oeste en las células fijadas con formaldehído utilizan anticuerpos primarios contra cualquier proteína de interés y etiquetarlos a su vez con anticuerpos secundarios fluorescentes infrarrojos. Esta técnica es conocida por ser particularmente útil para los puntos finales de fosforilación 6. En nuestra en la celda del Oeste, que tiñe las células fijadas para las proteínas del citoesqueleto α-tubulina o microtúbulos neuronales proteína asociada 2 (MAP2) en el canal de 800 nm. Estas proteínas son lo suficientemente abundantes para producir alta relación señal-ruido. También tiñe nuestros platos en el 700canal nm para núcleos con la mancha de DRAQ5 y para el citoplasma con la mancha de zafiro. Tanto las proteínas del citoesqueleto y las DRAQ5 + manchas Sapphire por lo tanto reflejan las estructuras celulares. El tercer ensayo de viabilidad mide la función metabólica y se llama &quot;célula Titulación Glo.&quot; En este ensayo basado en la luciferasa, los valores de luminiscencia están en proporción directa a los niveles de ATP. Ensayos de ATP se utilizan comúnmente para cuantificar las células viables 8-12. Sin embargo, incluyendo la palabra &quot;título&quot; en el nombre del ensayo es algo de un nombre inapropiado porque la producción de ATP por célula puede cambiar como una función de los tratamientos de toxina y es, por tanto, no siempre en proporción al número de células 8. Los niveles de ATP también pueden verse afectados por los ritmos circadianos 13 y por la división celular y la diferenciación celular 14 15. Sin embargo, el ensayo de ATP se muestra aquí es simple de realizar y útil porque ATP es una medida robusta de metabólicaviabilidad 16-21, si no del teléfono celular número en sí. Utilizando este ensayo para complementar el infrarrojo en la celda del Oeste, por lo tanto se obtiene un panorama más completo de la integridad celular de un ensayo de cualquier solo.

<table><tbody><tr><td>Cell Titer Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Compre en cantidades de 100 ml y alícuota, en lugar de comprar la cantidad más cara de 10 ml. Los reactivos reconstituidos y no utilizados se pueden volver a congelar a -20 °C; C durante al menos 21 semanas</td></tr><tr><td>18% de formalina</td><td>Thermo-Shandon</td><td>9990244</td><td>La compra de este fijador evita el pesaje de los polvos de formaldehído y la ebullición de la solución; De este modo, se minimiza la exposición a los vapores</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>No es esencial añadir esto a las soluciones de formaldehído, pero mejora el aspecto de las células fijas</td></tr><tr><td>Odyssey Block</td><td>LI-COR</td><td>927-40003</td><td>Este suero de pescado se puede comprar a granel y congelar a -20 & grados; C para uso a largo plazo</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568</td><td>Almacenamos una solución madre de Triton-X 100 al 10% en agua estéril a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Fosfato de Sodio Monobásico</td><td>Fisher</td><td>S468</td><td>También se pueden comprar tabletas de PBS o 10x soluciones de PBS, pero son más caras</td></tr><tr><td>Fosfato de Sodio Dibásico</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td>Ver arriba</td></tr><tr><td>Azida de Sodio (250x)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>7144.8-16</td><td>No compre el polvo porque la azida de sodio es muy tóxica. Almacenamos todos nuestros anticuerpos usados en 1x azida de sodio a 4 & grados; C hasta que se contaminen con desechos</td></tr><tr><td>Anti-&alfa;-tubulina de ratón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td>Este anticuerpo es caro, pero puede diluirse mucho y es muy específico</td></tr><tr><td>Anti-MAP2 de ratón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942</td><td>Este anticuerpo es caro pero es muy específico (un requisito previo para los westerns en células)</td></tr><tr><td>800 nm IgG LI-COR</td><td></td><td>926-32210</td><td>Otras compañías también venden anticuerpos secundarios infrarrojos. Asegúrese de comprar los anticuerpos altamente adsorbidos y tenga en cuenta que las concentraciones de IgG pueden variar según la fuente</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td>Este compuesto solía ser vendido por LI-COR a 1 mM</td></tr><tr><td>Zafiro</td><td>LI-COR</td><td>928-40022</td><td></td></tr><tr><td>Luminómetro</td><td>PerkinElmer</td><td>VICTOR3 1420 Contador</td><td></td>multietiqueta</tr><tr><td>Odyssey Imager</td><td>LI-COR</td><td>9201-01</td><td></td>Productos de Investigación de</tr><tr><td>Agitadores/Mezcladores</td><td>248555</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

los ensayos de viabilidad de las células en cultivo

Viability Assays for Cells in Culture

Manual de células en un microscopio son un medio sensible de la evaluación de la viabilidad celular, pero consumen mucho tiempo y por lo tanto caro. Ensayos de viabilidad computarizados son costosos en términos de equipo, pero puede ser más rápido y más objetivo que el recuento de células manuales. El presente informe se describe el uso de tres de estos ensayos de viabilidad. Dos de estos ensayos son de infrarrojos y uno es luminiscente. Ambos ensayos infrarrojos se basan en un Imager 16 bits Odyssey. Un ensayo de infrarrojos utiliza la mancha de DRAQ5 para los núcleos combinados con la mancha de zafiro de citosol y se visualiza en el canal de 700 nm. El otro ensayo de infrarrojos, una en la celda Occidental, utiliza anticuerpos contra las proteínas del citoesqueleto (proteína asociada α-tubulina o microtúbulos 2) y los etiqueta en el canal 800 nm. El tercer ensayo de viabilidad es un ensayo luminiscente comúnmente utilizado para el ATP, pero usamos un cuarto del volumen recomendado para ahorrar en coste. Estas mediciones son lineales y se correlacionan con el número de CElls plateado, pero varían en sensibilidad. Todos los tres ensayos de eludir microscopía de tiempo y muestrean todo el pozo, reduciendo así el error de muestreo. Por último, todos los ensayos fácilmente se puede completar en un día del final del experimento, lo que permite un mayor número de experimentos a realizar en plazos cortos. Sin embargo, todos ellos se basan en el supuesto de que el número de células permanecen en proporción a la intensidad de la señal después de los tratamientos, la suposición de que a veces no se cumple, especialmente para ATP celular. Además, si las células aumentan o disminuyen de tamaño después del tratamiento, esto podría afectar la fuerza de la señal sin afectar el número de células. Llegamos a la conclusión de que todos los ensayos de viabilidad, incluidos los recuentos manuales, adolecen de una serie de advertencias, pero que los ensayos de viabilidad computarizados son bien vale la pena la inversión inicial. El uso de los tres ensayos en conjunto da una visión completa de la estructura y la función celular.

El factor limitante de la velocidad en estos experimentos es la tinción de infrarrojos, como el ensayo de ATP es relativamente de breve duración. Para los ensayos de infrarrojos, anticipamos que ocho placas de 96 pocillos se pueden teñir y escanean el plazo de un día a la asombrosa cifra de dos lotes de cuatro platos cada una (ver Figura 1). Esta estimación asume 20 min de la fijación, de 30 minutos de lavado, 30 min de bloqueo, 2 horas de incubación del anticuerpo primario seguido de 30 min de los lava...

Los compuestos terapéuticos a menudo se examinaron por primera vez in vitro con los ensayos de viabilidad. Recuentos de células ciegos por un observador humano puede ser muy sensible a pequeños cambios en el número de células, pero no evaluar la función. Ensayos de viabilidad computarizados, tal como se describe aquí, pueden evaluar tanto la estructura y función de una manera objetiva.

Los ensayos de viabilidad de las células en cultivo

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar múltiples ensayos de viabilidad que proporcionen una visión más completa de la aptitud celular de la que puede ofrecer un solo ensayo por sí solo. Esto se logra primero midiendo los niveles de ATP de células sembradas para evaluar la función metabólica. El segundo paso consiste en inmunotincionar proteínas del citoesqueleto, como la alfa tubulina o la proteína asociada a microtúbulos dos, utilizando anticuerpos infrarrojos con longitudes de onda de 800 nanómetros.A continuación, las células se marcan con drac cinco infrarrojo y zafiro para teñir el núcleo y el citoplasma a 700 nanómetros. El paso final consiste en obtener imágenes de la alfa tubulina o map dos y del drac cinco más zafiro a ambas longitudes de onda, 700 y 800 nanómetros, en un imagenador infrarrojo. En definitiva, estos ensayos luminiscentes e infrarrojos proporcionan información sobre las estructuras anatómicas y la función fisiológica.La principal ventaja de estas técnicas frente a los métodos existentes, como el ensayo de viabilidad MTT, es la medición rápida y sensible de múltiples aspectos de la integridad celular. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en los campos de la neurociencia y la farmacología, como si los compuestos terapéuticos pueden proteger las estructuras anatómicas y la función metabólica. Para comenzar, coseche y reinfle las células en 100 o 200 microlitros de medio a densidades celulares variables en una placa de 96 pocillos según se describe en el protocolo adjunto, y rellene los pocillos circundantes con 200 microlitros de agua estéril para reducir los efectos de evaporación en los bordes.Deje que las células se adhieran durante la noche a 37 grados Celsius en un incubador con atmósfera de CO₂. Al día siguiente, retire 50 de los 100 microlitros de medio o 150 de los 200 microlitros de medio, de modo que queden 50 microlitros de medio en cada pocillo. A continuación, agregue 25 microlitros del reactivo Cell Titer Glow a cada uno de los pocillos internos en las columnas dos a seis.Para obtener una dilución uno a dos en las columnas del siete al once, filas B a D, agregue 50 microlitros del reactivo Cell Titer Glo para obtener una dilución uno a uno en los pocillos restantes. Columnas del siete al once, filas E a G. No retire ningún medio, sino que agregue 100 microlitros del reactivo Cell Titer Glo para obtener una dilución uno a uno en un volumen total de 200 microlitros. Coloque inmediatamente la placa en un agitador rotatorio u orbital durante 10 minutos para mezclar las muestras mientras incuban.Luego, transfiera 60 microlitros de cada pocillo a una placa de 96 pocillos con paredes blancas. Los valores de luminiscencia son más altos en placas blancas que en placas transparentes o negras porque reflejan la luz hacia arriba, en dirección al detector. Si se forman burbujas durante la transferencia, reviéntelas utilizando aire forzado del bulbo de una pipeta plástica de transferencia.Luego, dentro de los 12 minutos posteriores a la adición de los reactivos, coloque la placa en un luminómetro y lea los valores de luminiscencia. Promedie los valores luminiscentes de los tres o seis pocillos en cada grupo y grafique en función del número de células, utilizando la dilución más alta de los reactivos que aún produzca resultados lineales y proporcionales, según se define en el texto adjunto. Esto permitirá ahorrar costos en los ensayos infrarrojos; recolecte las células y re suspenda a diferentes densidades según se describe en el protocolo de texto adjunto.Llene los pocillos circundantes con 200 microlitros de agua estéril para reducir el efecto de los gradientes de temperatura y la evaporación en los bordes. Deje que las células se adhieran durante la noche a 37 grados Celsius en un incubador con atmósfera de CO₂, y luego fije las células añadiendo 100 microlitros de un fijador, como formaldehído al 4% y sacarosa al 4% en tampón fosfato 0,1 molar. Incube la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos, luego retire el fijador y lave las células tres veces con 200 microlitros de PBS.A continuación, diluya la solución bloqueadora uno a uno en PBS y agregue Triton X-100 al 0,3 % como agente permeabilizante celular. Luego, añada 35 microlitros de la solución bloqueadora a cada pocillo, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas en los pocillos. Incube la placa con la solución bloqueadora durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente.Durante esta incubación, diluya los anticuerpos primarios para las proteínas de interés. Por ejemplo, diluya el anticuerpo primario Antifa tubulina uno a 10,000 en una mezcla uno a uno de tampón bloqueante y PBS con 0,3 % TRITON X 100 mientras optimiza la prueba del procedimiento. Diluciones adicionales de anticuerpos aquí, el anticuerpo primario Antifa tubulina también se diluye uno a 5,000 en una mezcla uno a uno de tampón bloqueante y PBS con 0,3 % Triton X 100.A continuación, agregue los anticuerpos en las concentraciones indicadas aquí a las células fijadas en la placa. Asegúrese de dejar los pozos de control negativo en la columna dos en la solución de bloqueo, ya que solo se expondrán a los anticuerpos secundarios. Incube las células con los anticuerpos primarios de una a dos horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius.A continuación, prepare los anticuerpos secundarios anti-IgG de ratón de 800 nanómetros diluyéndolos uno a 1000 o uno a 2000 en una mezcla uno a uno de tampón bloqueante y PBS con 0,3 % de Triton X-100 tras la incubación con el anticuerpo primario. Lave los pocillos tres veces durante 10 minutos cada vez con 200 microlitros de PBS por pocillo y luego agregue 35 microlitros de anticuerpos secundarios a los pocillos.Agregue la dilución uno a 1000 a la mitad superior de la placa y la dilución uno a 2000 a la mitad inferior. Incube las células con los anticuerpos secundarios durante una hora a temperatura ambiente, protegidas de la luz. Luego, elimine los anticuerpos secundarios no unidos realizando tres lavados de 10 minutos con PBS, utilizando 200 microlitros por pocillo cada vez.A continuación, diluya el stock de DRAC cinco uno a 10.000 para obtener una concentración final de 0,5 micromolar y el stock de zafiro uno a 1.000 en PBS con 0,3 % de Triton X-100. Añada 35 microlitros de esta mezcla a la mitad izquierda de la placa, pero no añada nada a los pozos de control negativo en la columna dos. Para la mitad derecha de la placa, añada 35 microlitros de DRAC cinco diluido uno a 20.000 y zafiro diluido uno a 2.000.Incubar en estas soluciones durante 30 minutos a temperatura ambiente y protegido de la luz. Luego, lavar la placa tres veces con 200 microlitros de PBS por pocillo durante 10 minutos cada vez. Comenzar escaneando las placas en el equipo de imagen infrarroja con una intensidad de cinco y una resolución de 169 micrones.La configuración de calidad media o baja es suficiente. A continuación, escanee con diferentes desplazamientos de enfoque de 2,5 milímetros, 3,0 milímetros, 3,5 milímetros y 4,0 milímetros para determinar dónde se logra la mayor relación señal-ruido y una señal más nítida. Una vez optimizado el desplazamiento de enfoque, utilice la función incel western del software para colocar una cuadrícula del tamaño adecuado sobre la imagen de la placa y exporte los datos a Microsoft Excel.Reste el promedio de las intensidades integradas en los pocillos de control negativo de cada punto de datos correspondiente en los canales de 700 y 800 nanómetros. Luego, promedie las intensidades de señal integradas para cada grupo de pocillos y represente los datos en un gráfico de dispersión frente a la densidad celular tras la optimización. La intensidad de la señal en los tres ensayos mostró una correlación significativa con el número de células por pocillo, aunque los tres ensayos fueron altamente lineales, no fueron equivalentes en sensibilidad.El ensayo de ATP mostró la mayor sensibilidad de los tres, definida como el cambio más proporcional en la emisión de luz con la reducción del número de células en células neuronales primarias de rata. Las concentraciones óptimas de los reactivos fueron diferentes y los ensayos mostraron menor linealidad en todo el rango del ensayo. Sin embargo, ambos ensayos fueron lineales y sensibles a densidades de siembra inferiores a 100.000 células, mostradas aquí.Nuestras curvas de respuesta a la dosis en células de neuroblastoma tratadas con MG-132, un inhibidor del proteasoma, mostraron que MG-132 se aplicó en presencia o ausencia del precursor de glutatión y de la acetilcisteína. La N-acetilcisteína desplaza las tres curvas hacia la derecha. Por ejemplo, la IC50 medida mediante DRAC5 más zafiro fue de 1,64 micromolar de MG-132 sin N-acetilcisteína y de 4,64 micromolar de MG-132 en presencia de N-acetilcisteína. Esto fue similar a los valores obtenidos en el ensayo de alfa-tubulina, que fueron de 1,96 micromolar y 6,35 micromolar de MG-132, respectivamente.Sin embargo, los niveles de ATP aumentaron a bajas concentraciones de MG 132, un fenómeno denominado hormesis. Estos datos revelan que los niveles de ATP no necesariamente son proporcionales al título celular tras el tratamiento, y que la N-acetilcisteína también puede proteger la función metabólica. Una vez dominado, el ensayo luminiscente de ATP puede completarse en menos de 30 minutos, y la tinción con infrarrojo puede realizarse fácilmente en menos de ocho horas.Al realizar estos procedimientos, es importante recordar que no miden el número de células de la misma manera que un microscopio de alta resolución. Por ejemplo, una limitación es que los niveles de la proteína alfa tubulina o los niveles de TP pueden modificarse por los tratamientos en ausencia de cambios paralelos en el número de células.

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