Un método para cultivar embrionarias

El objetivo general de este procedimiento es disociar y cultivar in vitro células embrionarias de nematodos Caenorhabditis elegans. Esto se logra primero cultivando grandes cantidades de animales adultos. A continuación, los huevos se aíslan de los adultos.

Luego, los huevos se tratan con quitinasa para disolver la cáscara del huevo. Finalmente, las células se disocian manualmente y se siembran para su cultivo. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la expresión de marcadores específicos de células mediante técnicas de inmunofluorescencia, microscopía, electrofisiología e imagen de calcio.

La persona que demostrará el procedimiento será rel ti, un investigador postdoctoral del laboratorio. Después de cultivar al menos cuatro placas de sea elegance hasta la etapa de adulto GR y preparar los medios y soluciones según el protocolo descrito en el texto, inicie el aislamiento de huevos derritiendo primero un tubo de una solución stock previamente preparada de lectina de maní.

Coloque cubreobjetos esterilizados en las cavidades de una placa de 24 pocillos y agregue 200 microlitros de lectina de maní a cada cubreobjeto; incube durante al menos una hora a temperatura ambiente. A continuación, aspire la solución y use agua estéril para lavar las cavidades. Asegúrese de eliminar todos los rastros de lectina de maní para prevenir la agregación celular.

Luego, utilizando agua estéril de autoclave, lave los adultos de GR de las placas de agar y recoja la suspensión en dos tubos cónicos estériles de 50 mililitros. Coloque los tubos en hielo durante hasta cinco minutos para permitir que los gusanos se sedimenten en el fondo. Con una pipeta de transferencia, retire el agua y sustitúyala con agua estéril de autoclave fresca. Centrifugue los gusanos a 200 G durante 10 minutos.

Después del último lavado, resuspenda los gusanos en agua estéril fresca y transfiéralos a un tubo cónico estéril de 15 mililitros antes de centrifugar nuevamente a 200 ×g durante 10 minutos. Si los gusanos no se han sedimentado completamente, coloque el tubo en hielo durante cinco minutos. Una vez que los gusanos estén completamente sedimentados, retire el agua y añada de cinco a seis mililitros de solución de lisis.

Luego, agite suavemente la suspensión durante cinco a diez minutos y, cada dos o tres minutos, coloque una gota de la suspensión sobre un cubreobjetos y verifique la lisis bajo un microscopio estereoscópico. Cuando el 72-80% de los gusanos estén lisados, detenga la reacción de lisis añadiendo nueve mililitros de tampón para huevos. A partir de este momento, encienda un mechero Bunsen y manténgalo encendido para evitar la recontaminación de los huevos durante las centrifugaciones. Retire cuidadosamente el sobrenadante y lave el sedimento con tampón para huevos de forma exhaustiva de tres a cuatro veces hasta que la solución esté clara. A continuación, tras eliminar el sobrenadante final para separar los huevos de los cadáveres de los animales, suspenda el sedimento en dos mililitros de tampón estéril para huevos y añada dos mililitros de sacarosa al 60% en tampón para huevos.

Mezcle bien los huevos en la solución antes de centrifugar durante 20 minutos. A 200 G, retire cuidadosamente los tubos del centrífugo. Los huevos flotarán en la parte superior de la solución.

Por lo tanto, utilice una pipeta y puntas estériles de un mililitro para transferir los huevos a un tubo cónico estéril nuevo de 15 mililitros. Lave los huevos tres veces con tampón estéril para huevos, trabajando bajo una campana de flujo laminar. Para evitar la introducción de contaminación bacteriana, resuspenda los huevos sedimentados en un mililitro de quinasa a dos miligramos por mililitro y transfiéralos a un tubo cónico de 15 mililitros nuevo.

Agite el tubo durante 10 a 30 minutos a temperatura ambiente, según la frescura de la enzima, hasta que aproximadamente el 80 % de las cáscaras de huevo se hayan digerido. Centrifugue los huevos a 900 G durante tres minutos. Después de retirar cuidadosamente el sobrenadante, agregue tres mililitros de medio L 15, transfiera los huevos a una placa de seis centímetros de diámetro e inicie la disociación manual utilizando una jeringa estéril de 10 mililitros con una aguja de calibre 18.

Para monitorear el grado de disociación, coloque una gota de la suspensión en una placa de Petri nueva y obsérvela bajo un microscopio. Continúe hasta que aproximadamente el 80 % de las células estén disociadas. Para eliminar grumos celulares, huevos no digeridos y larvas eclosionadas, filtre suavemente la suspensión a través de un filtro de cinco micrones y pase cuatro a cinco mililitros adicionales de medio L 15 a través del filtro para recuperar las células y cultivarlas.

Después de centrifugar el filtrado a 900 G durante tres minutos, resuspenda las células en medio L 15 completo a razón de un mililitro por pocillo y almacene las placas en una cámara sellada con humedad a 20 grados Celsius en aire ambiente. Para que las células embrionarias de elegans aisladas se diferencien, deben adherirse a un sustrato. El proceso de diferenciación comienza aproximadamente entre dos y tres horas después de la siembra y continúa durante unas 24 horas.

Las características morfológicas in vitro son notablemente similares a las in vivo. Por ejemplo, como se muestra aquí, las neuronas sensoriales de LM y PLM desarrollan solo dos procesos neuronales, uno más largo que el otro, tal como ocurre in vivo. Esto sugiere que al menos algunos de los mecanismos moleculares que impulsan la diferenciación en las células de elegans son autónomos respecto a la célula y, por lo tanto, pueden ser recapitulados.

Los marcadores proteicos in vitro y las modificaciones postraduccionales específicas de células también se pueden observar in vitro. Por ejemplo, la alfa tubulina se acetila únicamente en neuronas táctiles de gusano marino, como se muestra aquí, donde los procesos in vitro de neuronas táctiles se tiñen con un anticuerpo dirigido contra alfa tubulina acetilada. Además, como se observa en este panel, las neuronas táctiles cultivadas expresan el canal mutante tóxico MEC cuatro D, que provoca la muerte de las neuronas táctiles in vivo.

Las neuronas que expresan GFP preparadas a partir de una cepa MEC cuatro DPE 4G FP están inicialmente presentes en cultivo, pero luego degeneran. Sin embargo, tal como ocurre in vivo, las células pueden ser rescatadas de la muerte mediante el tratamiento con un IDE y dantroleno, como se muestra aquí. Se utilizan técnicas de registro de parche para estudiar los canales dependientes del potasio iónico, iónicos no selectivos y del transportador de dopamina en células cultivadas de elgan marino.

Debido al pequeño tamaño de la célula, las pipetas de vidrio deben tener una punta pequeña y luego un cono amplio para compensar la mayor resistencia de entrada. Además, se obtiene un mayor éxito aplicando un impulso de alto voltaje al parche de membrana bajo la punta de la pipeta, en lugar de obtener acceso a toda la célula mediante succión, lo cual puede dañar la célula. En esta figura, para estudiar el papel de los canales de calcio activados por voltaje, se utiliza ION cuatro para permeabilizar la membrana y calibrar neuronas táctiles que expresan el indicador de calcio YC dos punto 12 para imágenes de calcio en ausencia o presencia de calcio.

Además, se determinó que la concentración media de calcio libre en las neuronas táctiles es de 200 nanomoles por litro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y cultivar células embrionarias de *C. elegans* in vitro.