Un método para cultivar embrionarias C. elegans Células

El objetivo general de este procedimiento es disociar y cultivar in vitro células embrionarias y elegantes del mar. Esto se logra cultivando primero grandes cantidades de animales de tumba. A continuación, los huevos se aíslan de los adultos.

Luego, los huevos se tratan con quitinasa para disolver la cáscara del huevo. Finalmente, las células se disocian manualmente y se colocan en placas para su cultivo. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la expresión de marcadores específicos de células a través de técnicas de inmunofluorescencia, microscopía, electrofisiología e imágenes de calcio.

La demostración del procedimiento correrá a cargo de un laboratorio postdoctoral. Después de cultivar al menos cuatro platos de elegancia marina para la etapa adulta GR y preparar los medios y soluciones de acuerdo con el protocolo de texto. Comience el aislamiento del huevo colocando primero un tubo de solución de lechina de maní previamente preparada.

Coloque los cubreobjetos de autoclave en los pocillos de una placa de 24 pocillos y agregue 200 microlitros de lectina de maní a cada cubreobjetos e incube durante al menos una hora a temperatura ambiente. A continuación, aspire la solución y use agua estéril para lavar los pozos. Una vez eliminado todo rastro de lectina de cacahuete para evitar la aglomeración de células.

Luego, usando agua estéril de autoclave, lave los adultos GR de las placas de agar y recoja la suspensión en dos tubos cónicos estériles de 50 mililitros. Coloque los tubos en hielo durante un máximo de cinco minutos para permitir que los gusanos se asienten en el fondo Con una pipeta de transferencia, retire el agua y reemplácela con una centrífuga de agua fresca y estéril en autoclave. Los gusanos a 200 G durante 10 minutos.

Después del lavado final, suspenda los gusanos en agua fresca estéril y transfiéralos a un tubo cónico estéril de 15 mililitros antes de volver a girar a 200 G durante 10 minutos. Si los gusanos no están completamente granulados, coloque el tubo en hielo durante cinco minutos. Una vez que las lombrices estén completamente asentadas, retire el agua y agregue de cinco a seis mililitros de solución de lisis.

A continuación, balancee suavemente la suspensión durante cinco a 10 minutos y cada dos o tres minutos, coloque una gota de suspensión en un cubreobjetos y compruebe si hay lisis bajo un microscopio estereoscópico. Cuando el 72-80% de los gusanos estén lisados, detenga la reacción de lisis agregando nueve mililitros de tampón de huevo antes de girar a partir de este punto, encienda un mechero bunsen y manténgalo encendido para evitar la recontaminación de los huevos, retire con cuidado el sobrenadante y use tampón de huevo para lavar a fondo el pellet tres o cuatro veces hasta que la solución esté clara. A continuación, después de retirar el sobrenadante final para separar los huevos de los cadáveres de los animales, suspenda el pellet en dos mililitros de tampón de huevo estéril y agregue dos mililitros de sacarosa al 60% en el tampón de huevo.

Mezcle bien los huevos en solución antes de centrifugar durante 20 minutos. A 200 G, retire con cuidado los tubos de la centrífuga. Los huevos estarán flotando en la parte superior de la solución.

Por lo tanto, use una pipeta y puntas estériles de un mililitro para transferir los óvulos a un tubo cónico estéril fresco de 15 mililitros. Use un tampón de huevos estéril para lavar los huevos tres veces mientras trabaja bajo una campana de flujo laminar. Para evitar la introducción de contaminación bacteriana, resus, suspenda los huevos peletizados en un mililitro de dos miligramos por mililitro de quinasa y transfiéralos a un tubo cónico fresco de 15 mililitros.

Agite el tubo durante 10 a 30 minutos a temperatura ambiente, dependiendo de la frescura de la enzima cuando se digieran aproximadamente el 80% de las cáscaras de huevo. Centrifugar los huevos a 900 g durante tres minutos. Después de retirar cuidadosamente el sobrenadante, agregue tres mililitros de medio L 15, transfiera los huevos a una placa de seis centímetros de diámetro y comience la disociación manual con una jeringa estéril de 10 mililitros con una aguja de calibre 18.

Para controlar el grado de disociación, coloque una gota de suspensión en una placa de Petri nueva y obsérvela bajo un microscopio. Continúe hasta que aproximadamente el 80% de las células estén disociadas. Para eliminar los bultos celulares, los huevos no digeridos y las larvas eclosionadas, filtre suavemente la suspensión a través de un filtro de cinco micras y pase de cuatro a cinco mililitros adicionales de medio L 15 a través del filtro para recuperar las células para cultivarlas.

Después de centrifugar el filtrado a 900 G durante tres minutos, resus suspender las celdas en medio L 15 completo jugado un mililitro por pocillo y almacenar las placas en una cámara húmeda sellada a 20 grados centígrados en el aire ambiente. Para diferenciarse de las células elegan embrionarias aisladas deben adherirse a un sustrato. El proceso de diferenciación comienza aproximadamente dos o tres horas después del enchapado y continúa durante aproximadamente 24 horas.

Las características morfológicas in vitro son notablemente similares a las in vivo. Por ejemplo, como se muestra aquí, las neuronas táctiles LM y PLM desarrollan solo dos procesos neuronales con uno más largo que el otro como lo hacen in vivo. Esto sugiere que al menos algunos de los mecanismos moleculares que impulsan la diferenciación en las células elegan son autónomos de la célula y, por lo tanto, pueden recapitularse.

También se pueden observar in vitro marcadores de proteínas in vitro y modificaciones postraduccionales específicas de la célula. Por ejemplo, la alfa tubulina es una neurona saciada solo en contacto en el elgan marino, como se muestra aquí, los procesos in vitro de las neuronas táctiles se tiñen con un anticuerpo levantado contra una alfa tubulina saciada. Y además, como se ve en este panel, las neuronas táctiles cultivadas expresan el canal mutante tóxico MEC four D, que causa la muerte de las neuronas táctiles in vivo.

Las neuronas que expresan GFP preparadas a partir de una cepa MEC four DPE 4G FP están inicialmente presentes en cultivo, pero luego degeneran. Sin embargo, al igual que in vivo, las células pueden ser rescatadas de la muerte mediante un tratamiento con un IDE y dantroleno, como se muestra aquí. Las técnicas de patch clamp se utilizan para estudiar los canales de potasio énico, ónico, no selectivo y dependiente del transportador de dopamina en células cultivadas de elgan marino.

Debido al pequeño tamaño de la celda, las pipetas de vidrio deben tener una punta pequeña y luego un cono ancho para compensar el aumento de la resistencia de entrada. Además, se logra un mayor éxito aplicando un impulso de alto voltaje al parche de membrana debajo de la punta de la pipeta en lugar de obtener acceso a toda la célula a través de la succión que puede dañar la célula. En esta figura, para estudiar el papel de los canales de calcio dependientes de voltaje, el ion cuatro se utiliza para permear la membrana y calibrar las neuronas táctiles que expresan el camaleón YC dos punto 12 para obtener imágenes de calcio en ausencia o presencia de calcio.

Además, se determinó que la concentración media de calcio libre en las neuronas táctiles es de 200 nanomolares molares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y cultivar vitro. Ver elegancia, células embrionarias.