Una Metodología Descelularización para la Producción de una matriz Intestinal Natural acelular

El objetivo general de este procedimiento es crear un andamio acelular natural para la ingeniería de tejidos intestinales. Esto se logra mediante la primera canulación, una arteria mesentérica superior de rata o AME, y la recolección del intestino delgado junto con el acceso vascular. En el segundo paso, los residuos intraluminales se lavan y las cánulas intraluminales y vasculares se conectan a una bomba peristáltica.

A continuación, el intestino delgado se perfunde con agua desionizada durante 24 horas a cuatro grados centígrados. En el paso final, el intestino delgado se perfunde con desoxi de sodio, coato y ADN a temperatura ambiente. En última instancia, la descelularización completa del intestino delgado, así como su arquitectura y componentes, se pueden visualizar mediante histología y microscopía electrónica respectivamente.

Actualmente nos encontramos ante el problema clínico de la insuficiencia intestinal, afección devastadora que afecta tanto a niños como a adultos. La nutrición parental y el trasplante convencional no proporcionan una cura completa. La producción de andamio intestinal vascularizado tridimensional, como se demuestra en el siguiente vídeo, se extiende hacia la terapia de la insuficiencia intestinal.

Lo notable de esta técnica es que el uso de productos químicos de digitalización suaves preserva la microarquitectura intestinal, como lo demuestran los resultados del microscopio electrónico. Además, el mantenimiento de la red vascular jerárquica siguiendo a la civilización permite la siembra de una estructura que se puede volver a conectar al huésped. Suministro de sangre Comience colocando una bomba peristáltica con dos tubos, luego haga pasar etanol al 70% a través de los tubos de la bomba peristáltica durante 15 minutos a velocidad máxima, seguido de PBS AA recién preparado durante otros 15 minutos.

Después de enjuagar la bomba, rocíe y limpie el abdomen de una rata spra spra eutanasiada de 250 a 350 gramos con etanol al 70%. Luego, utilizando instrumentos quirúrgicos esterilizados en autoclave, realice una incisión de laparotomía púbica XO en el abdomen para asegurar un campo quirúrgico limpio, eviscere el intestino delgado hacia el lado derecho del animal sobre una toalla de papel rociada con etanol al 70%. Tenga cuidado de humedecer continuamente el intestino con P-B-S-A-A para evitar la deshidratación del tejido y la desnaturalización de la matriz extracelular.

A continuación, localice la AME, que surge en un ángulo de 90 grados desde la aorta hacia el intestino. Coloque una sutura alrededor de la AME y prepare un nudo. Use una cánula de calibre 27 para ingresar a la AME desde la aorta y luego retire rápidamente la aguja para evitar desgarrar la pared del vaso.

Ahora avance el tubo de plástico de la cánula en el SMA, asegurando el tubo con suturas de Vicryl five oh, y luego inyecte 10 mililitros de P-B-S-A-A para confirmar la canulación. A continuación, use unas tijeras para incidir la aorta proximal y distal a la AME para liberar la cánula y evitar fugas de heces al diseccionar el intestino grueso, coloque un nudo de sutura de seda de cinco oh en el extremo proximal de la unión ileocecal y uno en el extremo distal del colon sigmoide. A continuación, corte el íleon terminal y el colon entre los dos nudos y retire el intestino grueso.

Ahora corte el intestino delgado en la unión duodenal Juno y libere el intestino de cualquier conexión de tejido conectivo que pueda tener con el abdomen. Transfiera el intestino delgado a una placa de Petri que contenga PBS aa. A continuación, utilice una pipeta posterior de plástico para canular la sección proximal del intestino, asegurándola en su lugar con suturas.

Finalmente, corte la pipeta para que se ajuste al cierre de señuelo de una jeringa de 60 mililitros y, a continuación, enjuague la luz intestinal con dos lavados de 60 mililitros de P-B-S-A-A para eliminar las heces y los residuos. Antes de comenzar el proceso de descelularización, asegúrese de que no haya burbujas en la luz intestinal y las cánulas vasculares. A continuación, conecte una llave de paso de tres vías a la cánula vascular y coloque la placa de Petri en un recipiente para recoger cualquier solución que se desborde. A continuación, comience a hacer correr agua desionizada a través de la bomba de rodillos de velocidad variable master flex LS a 0,6 mililitros por hora.

Manipule el tejido con cuidado para asegurarse de que las burbujas salgan por el extremo distal. Una vez que se hayan eliminado todas las burbujas de las cánulas, transfiera el aparato a la cámara frigorífica. A continuación, inicie el proceso de descelularización perfundiendo tanto el lumen intestinal como el árbol vascular con agua desionizada corriente durante 24 horas a 0,6 mililitros por hora durante la primera hora.

Revise el aparato con regularidad para asegurarse de que todas las conexiones estén seguras. La fuga es mínima y no hay burbujas dentro del intestino. Después de 24 horas, vuelva a colocar el aparato de descelularización a temperatura ambiente.

El color del intestino debería haber cambiado a un rosa claro debajo de una campana de succión. Pesar suficiente recubrimiento de desoxi sodio para hacer una solución al 4% en 300 mililitros de agua desionizada. Use un vórtice para mezclar la solución hasta que esté clara.

Ahora, reemplace la solución desionizada con el cotejo de desoxi sodio. Compruebe las conexiones. Retire las burbujas y perfunda el intestino delgado a 0,6 mililitros por hora durante cuatro horas.

Después del paso de cotejo de desoxi sodio, el tejido se vuelve transparente. El mantenimiento de la red vascular también se hace evidente después de agregar PBS AA a la bomba. Lave el intestino con PBS AA durante 30 para evitar cualquier interacción entre el desoxi de sodio, el coato y el ADN.

A continuación, perfunde el tejido con ADN recién preparado, uno a temperatura ambiente a una velocidad de 0,6 mililitros por hora. Después de tres horas, transfiera el andamio a una campana de cultivo de tejidos y, mediante una técnica séptica, cambie la placa. Vuelva a esterilizar el tubo de la bomba peristáltica haciendo pasar etanol a través de él.

Lave el intestino por última vez con P-B-S-A-A durante 30 minutos para asegurarse de que se eliminen todos los restos de las soluciones de descelularización. Finalmente, transfiera el andamio a un reticulante UV y ejecute dos ciclos de esterilización. Luego guarde el andamio en P-B-S-A-A.

Cambiar la solución cada tres días. Tras una descelularización exitosa, el andamio debe tener una apariencia macroscópica similar a la del intestino nativo, pero con paredes translúcidas. La preservación de la macroarquitectura también debe ser evidente por la permeabilidad del árbol vascular.

Cuando el tinte se inyecta a través de la cánula SMA, debe distribuirse uniformemente por todo el andamio y llegar al árbol capilar. El andamio debe estar libre de material nuclear y citoplasmático, algo que se puede evaluar. Utilizando un kit de cuantificación de ADN y un análisis histológico simple, la tinción de hematina y eoína debería demostrar una ausencia de material nuclear y citoplasmático, al tiempo que preserva las capas del intestino delgado, como se muestra en esta imagen.

En particular, el mantenimiento de las vellosidades y las vellosidades en el lado luminal debería ser evidente después de la microscopía electrónica de barrido. También se debe esperar una mayor conservación de los componentes de la matriz extracelular, como el colágeno, la elastina y el glicano. Por ejemplo, la tinción con Chro de Massen Tri permite la demostración del tejido conectivo intacto en el andamio.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear el andamio intestinal celular natural.