Generación de Arenavirus recombinante para el Desarrollo de Vacunas de la FDA aprobados células Vero

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un protocolo simple y altamente reproducible para la generación de virus de arena recombinantes en células Vero aprobadas por la FDA para el desarrollo potencial de semillas de vacunas o vectores de vacunas. Esto se logra primero preparando cuidadosamente la mezcla de transfección de ADN plasmídico. El segundo paso es transfectar células Vero con la mezcla de transfección de ADN plasmídico.

A continuación, es necesario escalar las células transfectadas en placas de 100 milímetros. En última instancia, el paso final es confirmar un rescate exitoso del virus mediante inmunofluorescencia utilizando microscopía de virus de tipo salvaje o bifluorescencia y la expresión de luciferasa GIA utilizando virus segmentados tris en comparación con los métodos existentes, como los rescates y las líneas celulares rine. Este protocolo genera virus renales en células Vero, las cuales están aprobadas por la FDA para el desarrollo de vacunas.

Además de la generación de semillas de vacunas potenciales, el gen reportado que expresa el virus trisegmentado también se puede aplicar para la identificación de antivirales contra VIRs en cribados de rendimiento de cabeza sin necesidad de ensayos secundarios para la detección viral. Primero, prepare 250 microlitros de medio óptimo y, dependiendo del virus, rescate de 10 a 12 microgramos de lipo 2000 por transfección incubar durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente. Durante este tiempo, prepare la mezcla de transfección de plasma en un tubo de microcentrífuga separado utilizando las cantidades recomendadas para cada rescate de virus.

Llevar el volumen final a 50 microlitros con optimum. A continuación, a 250 microlitros de la mezcla lipo óptima en la mezcla de transfección de ADN plasmático e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para preparar las células Vero primero equilibrar, el medio P-B-S-D-M-E-M 10%FBS 1%PS y la mezcla de tripsina EDTA a 37 grados Celsius para cosechar la oficina de células, lavar los cultivos dos veces con cinco mililitros de PBS.

Luego agregue un mililitro de tripsina EDTA para el desprendimiento de células si es necesario, golpee suavemente para separar completamente las células. Ahora vuelva a suspender las celdas en 10 mililitros de DMEM completo en un tubo de centrífuga de 15 mililitros. A continuación, centrifugar las células durante cinco minutos a 1000 rpm y suspender las células en 10 mililitros de DMEM completo.

Cuente las celdas y ajuste la concentración a una por 10 a las seis celdas por mililitro. Después de la incubación de 20 a 30 minutos a temperatura ambiente, agregue un mililitro de células Vero a la mezcla óptima de lemina y plásmido de ADN e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Ahora siembre la mezcla de células de ADN lipo en placas de seis pocillos.

Agite suavemente y luego colóquelo en la incubadora. Después de 16 a 24 horas, después de la transfección, retire el medio de transfección y agregue dos mililitros de cultivo del medio de infección, las células durante 48 horas adicionales. Junto al paso, las células retiran el sobrenadante del cultivo de tejidos y se lavan dos veces con un XPBS y tripsina congelan las células como se muestra anteriormente.

A continuación, vuelva a suspender las células en un mililitro de DMEM completo para granular las células en centrífuga durante cinco minutos. A 5.000 RPM y cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender cuidadosamente los gránulos en un mililitro de medio de infección y transfiera las células a un plato de 100 milímetros.

Con medios infecciosos, aumente el volumen total de la placa a ocho mililitros, un volumen suficiente para evitar la desecación de las células, así como para concentrar el virus. Agite suavemente el plato de 100 milímetros para obtener una monocapa uniforme de células transfectadas después del cultivo. Después de 72 horas, recoja la centrífuga de sobrenadantes de cultivo de tejidos para eliminar los restos celulares y almacene los sobrenadantes a menos 80 grados centígrados el día antes de la valoración.

Lave las células Vero dos veces con PBS y hielo de tripsina. Después de resus suspender las celdas en 10 mililitros de DMEM completo. Cuente las células con un hemocímetro y ajuste la concentración a cuatro veces 10 de las cuatro células por pocillo, luego prepare placas de 96 pocillos para alcanzar una fluidez del 80 al 90%.

Al día siguiente. Agite suavemente las placas con la mano para obtener una distribución uniforme de las células. Cultive las células durante la noche el día de la infección.

Revise las células bajo el microscopio para confirmar que hay una monocapa antes de continuar con la infección. Ahora diluir en serie el virus que contiene los sobrenadantes de cultivo de tejidos que se recuperaron anteriormente en óptimas en una placa de 96 pocillos, luego aspirar el medio de las células Vero sembradas. Lavar dos veces con 50 microlitros de PBS e infectar las células con 50 microlitros del virus diluido en serie.

Infecta las células durante una hora y media a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. A continuación, retire el inóculo del virus a 100 microlitros de medio de infección por pocillo e incube las células durante 16 a 18 horas. Ahora retire los sobrenadantes del cultivo de tejidos de cada uno.

Fije bien las células con formaldehído al 4% diluido en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, retire el formaldehído y permea con 0,1%trite X 100 a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, aspire la solución de permeación y lave tres veces con 100 microlitros de celdas de bloqueo PBS con suero de albúmina bovina al 2,5%.

Diluir el anticuerpo primario específico de una proteína arenavirus en BSA al 2,5% y centrifugar durante 15 minutos. A 3.500 RPM, incubar las células con el anticuerpo durante una hora a 37 grados Celsius después de tres lavados de PBS con un anticuerpo secundario conjugado con fluorescente cuatro apropiado durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Retire el anticuerpo secundario y lave tres veces con 100 microlitros de PBS.

A continuación, valore contando las unidades formadoras de foco fluorescentes mediante microscopía de fluorescencia. Similar al virus arena recombinante de tipo salvaje. Valorar el virus segmentado tric diluyendo primero en serie el virus presente en el cultivo de tejidos, el sobrenadante luego infecta las células Vero en 96 placas de pocillos después de 16 a 18 horas de incubación titulando el foco fluorescente, formando unidades mediante microscopía de fluorescencia.

Alternativamente, mida el rescate exitoso del virus por la expresión de luciferasa de Gaia utilizando 100 microlitros de sobrenadantes de cultivo de tejidos en una placa blanca de 96 pocillos. Configure el luminómetro según las recomendaciones del fabricante. Agregue de 50 a 100 microlitros de solución de ensayo Gaia a cada muestra.

A continuación, mida la expresión del gen reportero de Gaia con el luminómetro como control negativo. Mida la expresión de Gaia a partir de TCS de células infectadas con virus de tipo salvaje. Los virus Arena son virus de ARN de sentido negativo con envoltura y genomas bisegmentados.

Cada segmento utiliza una estrategia de recubrimiento ambi sense para dirigir la síntesis de dos proteínas virales. En orientación opuesta, se utilizan dos tipos de plásmidos de rescate para la generación de arenavirus recombinante en células Vero. El plásmido de expresión de PCA dirige la síntesis de las proteínas virales L y np.

El plásmido polimerasa humano uno dirige la síntesis de los segmentos de ARN viral. El rescate exitoso de un virus de arena de tipo salvaje recombinante se confirma mediante la presencia de antígenos virales mediante IFA a las 16 a 18 horas. Después de la infección de las células Vero por cultivo de tejidos, las células sobrenadantes se tiñen con LCMV o anticuerpos específicos de cánido número uno.

En tris segmentado arenavirus rescata la polimerasa humana, un plásmido se separa en dos plásmidos en un plásmido. La NP es reemplazada por GFP y en el otro plásmido, la GP es reemplazada por el gen Gaia. El éxito del rescate viral puede evaluarse simplemente observando la expresión de GFP mediante microscopía de fluorescencia.

Además, el éxito del rescate puede confirmarse evaluando la expresión de Gaia. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo rescatar virus de arena segmentados de tipo salvaje y tris en células Vero con alta reproducibilidad. Recomendamos tres transfectes independientes para cada virus recomendado para aumentar la probabilidad de nuestro rescate exitoso, ya que las células graves no se transfectan fácilmente.