Tinción de anticuerpos en C. Elegans Uso de "Freeze-Cracking"

El objetivo general de este procedimiento es realizar la tinción de anticuerpos en C elegance. Para hacer esto, los nematodos se enjuagan, se esparcen en portaobjetos y se comprimen cuidadosamente entre dos portaobjetos adhesivos, que luego se congelan en hielo seco. A continuación, los portaobjetos se separan para abrir los nematodos y se colocan inmediatamente en el fijador.

A continuación, los nematodos se tiñen utilizando técnicas estándar de tinción de anticuerpos, el análisis por microscopía fluorescente revela una tinción exitosa de anticuerpos de nematodos semiintactos. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la fijación de nematodos intactos, es que minimiza el tratamiento químico de la muestra. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la preparación de los portaobjetos y los nematodos es algo difícil de demostrar.

El procedimiento será RTO Basu y yo, un estudiante graduado de mi laboratorio Para preparar placas de nematodos para teñir, comience colocando una pieza plana de metal sobre hielo seco para enfriarla con agua destilada y un enjuague con pipeta de vidrio. Gusanos cultivados en una placa NGM de 60 milímetros con bacterias en un tubo de micro fuga de 1,5 mililitros. Los gusanos pueden ser sincronizados o mixtos, pero evite usar placas con muchas dotes que son difíciles de romper o gusanos hambrientos, lo que aumentará la autofluorescencia usando la misma pipeta de vidrio.

Enjuague los gusanos tres o cuatro veces con agua destilada para liberarlos de las bacterias. Luego, para recolectar principalmente adultos, déjelos sentarse en el banco durante tres a cinco minutos. Después de que las lombrices se hayan asentado en el fondo del tubo, retire la mayor parte del agua del tubo, dejando aproximadamente el doble del volumen de agua que las lombrices, pero al menos 25 microlitros de volumen total.

Etiquete el lado esmerilado de los portaobjetos de polilisina con tinta indeleble y coloque los portaobjetos en la mesa de trabajo junto al recipiente con la etiqueta de hielo seco hacia arriba. Esto servirá como la diapositiva inferior. Tener un número igual de productos limpios tratados con polilisina.

Las mejores diapositivas disponibles. A continuación, pipetee unos 25 microlitros de lombrices en agua en el portaobjetos de adherencia inferior y, utilizando el lado de la punta de la pipeta, extienda las lombrices por el centro del portaobjetos. Déjelos reposar durante 30 segundos a dos minutos.

Los extremos de los gusanos se pegarán al entrar en contacto con el portaobjetos. El aspecto más difícil de este procedimiento es evitar que los gusanos se distorsionen demasiado cuando realice los siguientes pasos. La mejor manera de hacerlo es ser paciente, tener todo listo y no beber demasiada cafeína para que tus manos estén bien firmes.

Sosteniendo la corredera inferior con una mano, coloque la corredera superior sobre ella de modo que todas las partes, excepto las esmeriladas, se superpongan. El líquido debe mantener los portaobjetos ligeramente separados para que los gusanos aún tengan algo de movilidad. No dejes que el tobogán se deslice uno sobre el otro, lo que retorcerá los gusanos.

A continuación, con los pulgares y los dedos índices de cada mano, presione con cuidado hacia abajo el portaobjetos superior Con la cantidad adecuada de presión, algunos de los hermafroditas más grandes se romperán en el borde del tobogán. Si bien la mayoría de los adultos y las larvas entrarán en contacto con cada portaobjetos, pero permanecerán intactos de inmediato y con cuidado sin permitir que los portaobjetos se deslicen, colóquelos en la pieza de metal sobre hielo seco. En un minuto, los portaobjetos aparecerán congelados, pero manténgalos allí durante cinco minutos para asegurarse de que estén completamente congelados.

Las guías ya están listas para su fijación. Si no continúa, guarde inmediatamente los portaobjetos en una caja etiquetada a menos 80 grados centígrados durante varios días. Deben usarse dentro de una semana más o menos después de que se hagan.

No utilice los portaobjetos después de un almacenamiento prolongado. Los nematodos individuales también se pueden preparar en portaobjetos con un método similar al que se acaba de mostrar como se ha mostrado antes. Coloque una pieza plana de metal sobre hielo seco para enfriarla.

A continuación, use un palillo de lombriz para transferir nematodos individuales a una gota de agua en una placa NGM para liberarlos de bacterias. Los nematodos deben estar bien alimentados para disminuir la autofluorescencia. Si es posible, repita la transferencia a nuevos lugares de agua según sea necesario hasta que el lombriz esté libre de bacterias.

A continuación, prepare las diapositivas superior e inferior como antes. Luego coloque una gota de agua de cinco a 10 microlitros en el área tratada con polilisina del portaobjetos inferior mientras observa con un microscopio. Use un pico de lombrices para transferir hasta 20 lombrices a la gota de agua.

Los gusanos deben hundirse hasta tocar la superficie pegajosa del portaobjetos. A continuación, coloque la corredera superior como antes, pero no la comprima asegurándose de que las correderas no se deslicen inmediatamente. Coloque los toboganes sobre el metal sobre hielo seco.

Manténgalo en hielo seco durante cinco a 30 minutos y proceda inmediatamente a la fijación. Estas diapositivas no se pueden almacenar para su uso posterior. Para fijar ligeramente los gusanos, comience colocando frascos de tinción que contengan soluciones de fijación sobre hielo para enfriarlos durante 10 minutos.

Las soluciones necesarias son 100% metanol, 100% acetona y solución salina tamponada con fosfato. Tome un par de portaobjetos inferior y superior del hielo seco, gírelos rápidamente y sumerja inmediatamente el portaobjetos inferior en metanol helado durante dos minutos, deseche el portaobjetos superior. A continuación, transfiera los portaobjetos de metanol a acetona helada durante cuatro minutos.

Si los portaobjetos tenían muchos gusanos, la mayoría de ellos se caerán en el fijador incluso con portaobjetos bien preparados. Si los portaobjetos de un solo gusano se prepararon adecuadamente, los gusanos deben permanecer adherentes. Finalmente, para enjuagar el fijador, sumerja los portaobjetos en el frasco con PBS.

Los portaobjetos ahora están listos para teñir para realizar una fijación dura con formaldehído o glutaraldehído. Comience diluyendo la solución de formaldehído o glutaraldehído de grado reactivo en PBS hasta una concentración final de 0.5 a 4%Las alícuotas se pueden almacenar a menos 20 a menos 30 grados y descongelar según sea necesario. Recuerde, siempre el formaldehído y el glutaraldehído son muy tóxicos, por lo que debe usar guantes y trabajar en una campana extractora.

Tome un par de toboganes inferior y superior del hielo seco y gírelos rápidamente de inmediato. Coloque el portaobjetos inferior que tiene los gusanos en un plato plano con tapa, deseche el portaobjetos superior inmediatamente pipetee 200 microlitros del fijador sobre el centro del área del portaobjetos. Con los gusanos, el fijador se congelará parcialmente en su lugar y luego se derretirá para cubrir una región más grande del portaobjetos.

Si las lombrices no están totalmente cubiertas con fijador de inmediato y cuidado, agregue más fijador con una micropipeta. No permita que el fijador fluya sobre el borde del portaobjetos. Agregue toallitas húmedas dobladas sin pelusa al plato para mantenerlo humidificado.

No permita que las toallitas toquen los portaobjetos. Luego cubra el plato con una tapa y déjelo durante 10 minutos a toda la noche a temperatura ambiente después de que se complete la fijación, use una pipeta para transferir cuidadosamente el fijador con gusanos sueltos a un tubo de 1.5 mililitros. A continuación, sumerja el portaobjetos en un frasco de tinción que contenga PBS.

Gire el tubo que contiene los gusanos a alta velocidad durante 30 segundos para pelletizarlos. Enjuague los gusanos dos veces con PBS. Luego proceda a teñirlos en paralelo con los gusanos en el portaobjetos.

El protocolo de tinción de anticuerpos es similar a los protocolos estándar para cualquier tejido en portaobjetos y se describe en detalle en el documento adjunto. Después de teñir, transfiera los portaobjetos a PBS y deje que permanezcan allí hasta 12 horas a cuatro grados centígrados hasta que estén listos para montar. Para montar las diapositivas, retire una diapositiva del PBS.

Use una toallita sin pelusa para secar la parte trasera y luego colóquela brevemente sobre una toalla de papel rápidamente. Coloque unos 20 microlitros de medio de montaje sobre los gusanos de modo que haya partes aproximadamente iguales de medio y PBS. En la diapositiva.

Incline suavemente el portaobjetos para mezclar las dos soluciones. Precaución: el medio de montaje es tóxico. Sosteniendo el borde esmerilado.

Incline el portaobjetos para que la solución se acumule cerca del glaseado. A continuación, coloque un borde de un cubreobjetos de 24 por 60 milímetros sobre la solución para minimizar las burbujas de aire que aumentan el blanqueo e interrumpen la visualización. Baje suavemente el cubreobjetos.

Si se forman burbujas, levante lentamente el borde de la funda. Luego, sin deslizarse por los gusanos, vuelva a bajarlo. Agregue más PBS si es necesario para eliminar las burbujas de aire.

Con una toallita sin pelusa, comprima los bordes del cubreobjetos y deslícelos con cuidado para secar el borde. El borde de la corredera debe ser visible alrededor de todo el borde del cubreobjetos y no debe estar demasiado mojado. Sella el cubreobjetos y aplica dos o tres capas de esmalte de uñas en el borde.

Una vez que el portaobjetos esté bien sellado y seco, limpie el cubreobjetos y la parte posterior del portaobjetos y colóquelo en los pozos de un portaobjetos. Los portaobjetos sellados se pueden mantener días a cuatro grados centígrados o semanas a menos 20 grados centígrados durante períodos más largos. Las manchas de ADN y la mayoría de los tintes verdes se desvanecen, vuelva a sellar el cubreobjetos con más esmalte de uñas según sea necesario, especialmente después de usar cualquier lente de inmersión en aceite.

Las siguientes imágenes representativas se recolectaron utilizando láminas realizadas durante los primeros intentos de tinción de anticuerpos de estudiantes universitarios en un curso de laboratorio de biología celular. Esta imagen muestra un ejemplo de las cabezas de dos hermafroditas adultos que están debidamente comprimidas, agrietadas y ligeramente fijadas con acetona de metanol. Fueron marcados con múltiples anticuerpos y colorantes.

En este caso, prácticamente todo el gusano es accesible a los anticuerpos. En este caso, la ubicación de los núcleos, indicada por la tinción DPI, indica qué partes del gusano están intactas. Cuando los gusanos se someten a un fijador más duro, como el formaldehído, la morfología del gusano puede distorsionarse.

Esto se puede ver en estas imágenes como una apariencia ondulada de los músculos que se muestran en rojo. Otro problema común asociado con el uso de fijadores más duros es la fijación o penetración desigual de tejidos particulares. Esto se puede ver aquí donde el músculo que se muestra en rojo está manchado solo en una parte del gusano.

Aquí, la presencia de otras manchas, incluido el ADN, que se muestra en azul indica que al menos parte del cuerpo estaba presente. El patrón resultante de tinción parcial se puede identificar fácilmente con la práctica, de modo que se puede determinar la distribución completa de la tinción, incluso si un solo gusano muestra una tinción desigual. Aquí se ilustran los problemas comunes encontrados con el agrietamiento por congelación utilizando cualquier condición de fijación.

El problema más común es la torsión de la muestra debido al movimiento relativo de los dos portaobjetos. Aquí, la morfología de los tejidos teñidos indica que el cuerpo del gusano está retorcido justo después de la faringe. Esta imagen también muestra el problema con las manchas de fondo debido a que los anticuerpos se adhieren al recubrimiento de polilisina del portaobjetos.

Esto se puede evitar utilizando el microscopio confocal. Tenga en cuenta que incluso con la práctica, muchos gusanos individuales se perderán o mostrarán algunos de los problemas que se muestran aquí. Una vez dominado, la preparación y fijación se puede hacer en una hora y la tinción se puede hacer en un día.

Después de este procedimiento, se pueden realizar una variedad de métodos de fijación para optimizar la tinción de cualquier anticuerpo y tejido dado.