Name: Tinción de anticuerpos en C. Elegans Uso de Freeze-Cracking (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Aprende la técnica de freeze-cracking para tinción de anticuerpos en C. elegans, minimizando el tratamiento químico y mejorando la localización de proteínas en nematodos semíntegros mediante microscopía de fluorescencia.

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El financiamiento fue proporcionado por la NSF CCLI # 0633618 y la Universidad de Ohio. Algunas cepas fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis. El estudiante de posgrado Reetobrata Basu aparece en el video.

<ol><li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).</li>
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<li>Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLP-1+is+localized+to+the+mitotic+region+of+the+C.+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line.</a> Development. 120, 2901-2911 (1994).</li>
<li>Strome, S., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+visualization+of+germ-line-specific+cytoplasmic+granules+in+embryos%2C+larvae%2C+and+adults+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).</li>
<li>Albertson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+first+cleavage+spindle+in+nematode+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos.</a> Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).</li>
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<li>Ahringer, J. Reverse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhringer%2C+J+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
</ol>

El autor declara que no tiene intereses financieros en competencia.

El protocolo de congelación de craqueo es uno de varios métodos para la tinción de anticuerpos en C. elegans. Proporciona una manera relativamente fácil de manchar los gusanos, pero requiere de reactivos específicos y práctica para obtener resultados óptimos. Los pasos críticos (descritos en la Figura 1) son: 1) la preparación de diapositivas (consulte los pasos 1 y 2) la compresión manual de los nematodos (consulte los pasos 2 y 3) de fijación rápida (ver paso 3). En primer lugar, para maximiz...

Para determinar la localización celular y subcelular de las proteínas, los científicos han denominado tradicionalmente tejidos con anticuerpos seleccionados para reconocer específicamente las proteínas particulares 1. En algunos organismos modelo como C. elegans, tinción de anticuerpos a menudo ha sido sustituido por técnicas genéticas moleculares, que dan resultados más rápidamente. Estos incluyen los organismos de transformación con constructos que consisten en fusiones de genes entre el promotor y las regiones codificantes del gen de interés y la proteína fluorescente verde. Sin embargo, las técnicas moleculares están sujetas a una serie de artefactos, incluyendo problemas con conocer la verdadera promotor y cambios en la expresión de los constructos en el número de copias alto (las técnicas habituales en C. elegans) 2,3. Por lo tanto, la tinción con anticuerpos sigue siendo un objetivo para muchos científicos que estudian la función de proteínas in vivo. La tinción con anticuerpos tejidos puede ser difícil, ya que untibodies sólo podrán reconocer su antígeno en una determinada conformación 1. Por ejemplo, los anticuerpos pueden reconocer sólo antígeno desnaturalizado o intactos fija de una manera particular y pueden no reconocer el antígeno in situ. El problema de la tinción de anticuerpos en los nematodos se ve agravada por el hecho de que la cutícula del nematodo forma una barrera relativamente impermeable, bloqueando el acceso de los anticuerpos a los tejidos. Hay varios métodos diferentes utilizados para la tinción de anticuerpos en C. elegans (revisado en nuestros trabajos anteriores 4). Para la tinción intactas &quot;gusanos, &#39;se desarrollaron métodos para congelar y descongelar en un fijador relativamente duro (formaldehído o glutaraldehído), los ciclos de congelación-descongelación ayudan a romper la cutícula para permitir una rápida penetración del fijador 5. Después de la fijación, la cutícula se permeabilizaron para permitir la penetración del anticuerpo; métodos incluyen el tratamiento con agentes, colagenasa, o tanto la reducción de 5-7. Estos treatments conservan la morfología, pero a menudo reducen o destruyen el reconocimiento de anticuerpos. Los métodos alternativos incluyen la disección 8 para permitir la penetración de anticuerpos. &quot;Freeze-cracking&quot; es una forma de obtener acceso al interior del gusano semi-intacta para permitir la tinción de anticuerpos 9-10. Freeze-craqueo se puede realizar con una variedad de condiciones de fijación, evitando tratamientos de colagenasa y de reducción. Los nematodos se colocan entre dos adhesivos diapositivas, congeladas, y luego las diapositivas se separan, dejando la mayor parte del nematodo en el portaobjetos inferior y gran parte de la cutícula en la diapositiva superior. La corredera inferior se puede colocar en fijador y toda la diapositiva con nematodos adheridas se transfiere a través del procedimiento de tinción de anticuerpos. El método no presentan dos dificultades principales. En primer lugar, es difícil aplicar la cantidad correcta de presión necesaria para dividir los nematodos sin deformar gravemente ellos. En segundo lugar, muchos de los gusanos no se smarque a cualquiera de diapositivas, y se perderá en el fijador o enjuagues. Sin embargo, con los portaobjetos y la práctica adecuados, el método producirá rápidamente nematodos con morfología razonable que se puede utilizar con una amplia variedad de fijadores y anticuerpos. El método se puede variar ligeramente, dependiendo de la meta del experimentador. Si se desea tinción de los nematodos individuales (por ejemplo, para determinar si un único transformante ha alterado la tinción de anticuerpos), a continuación, se desliza con la adhesión máxima (pero mayor tinción de fondo) se puede utilizar, tales como diapositivas preparadas en el laboratorio con polilisina adicional (ver más abajo). Para formaldehído o glutaraldehído fijación, toboganes más altos de adhesión (diapositivas polylysine preparadas en el laboratorio) deben ser usados, ya que los nematodos se adhieren más mal a la polilisina después de estas fijaciones. Si los nematodos de tipo salvaje se fijaron con metanol y / o acetona, y luego se desliza con una menor adherencia y la tinción de fondo más baja se debe utilizar (comercial o de ldiapositivas aboratory preparados). Si una variedad de anticuerpos y fijadores están siendo utilizados en el laboratorio, una selección de diapositivas se puede preparar con anticipación y se almacena hasta que se necesita. Después de acceso al tejido nematodo se ha adquirido, los procedimientos de tinción de anticuerpos siguen métodos estándar (con incubaciones más largas característicos de los tejidos en lugar de células de 1,11).

<table><tbody><tr><td>portaobjetos de poli-L-lisina (marca ESCO)</td><td>Fisher</td><td>12-545-78</td><td>Los portaobjetos de la marca Sigma también son adecuados</td></tr> para <tr><td>el hidrobromuro de poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P1524</td><td><fuerte>IMPORTANTE:</fuerte> Marca y alto peso molecular de los portaobjetos de borde esmerilado único crítico de polilisina</td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>48312-002</td><td>Otras marcas son adecuadas</td></tr><tr><td>azida de sodio</td><td>Sigma</td><td>S2002-25G</td><td>TOXIC, use guantes y mascarilla mientras pesa el polvo para hacer un 10% de caldo. Use guantes cuando pipetee la solución madre</td></tr><tr><td>frasco de tinción coplin</td><td>VWR</td><td>47751-792</td><td>Otras marcas son adecuadas</td></tr><tr><td>Sobre de 5 portaobjetos</td><td>Microscopía Electrónica Science</td><td>71549-01</td><td>Una de las muchas marcas diferentes de portaobjetos pequeño, adecuado para teñir</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td><fuerte>IMPORTANTE:</fuerte> Las soluciones regulares de formalina (37% de formaldehído) NO son adecuadas. 1) Disolver el paraformaldehído crisatlano en tampón de fosfato y almacenar en pequeñas alícuotas congeladas. O 2) comprar paraformaldehído de grado de microscopía electrónica en alícuotas. TÓXICO -use guantes; Deseche el exceso de plumón del fregadero con agua.</td></tr><tr><td>Solución de glutaraldehído, 25% en agua</td><td>Sigma</td><td>G 5882</td><td><fuerte>IMPORTANTE:</fuerte> comprar glutaraldehído de grado de microscopía electrónica en ampollas; TÓXICO -use guantes; Deseche el exceso de plumón del fregadero con agua.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>EM-9410</td><td>Otras marcas son adecuadas</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Fisher ICN820451</td><td></td><td>Otras marcas son adecuadas</td></tr><tr><td>Suero de burro, liofilizado</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td>Otras marcas son adecuadas</td></tr><tr><td>Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-marcaje</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-165-150</td><td>Esta empresa está recomendada para anticuerpos multi-etiqueta (afinidad depleida) de alta calidad. Seleccione el colorante y el antígeno apropiados (animal utilizado para producir anticuerpos primarios). </td></tr><tr><td>galato de n-propilo</td><td>Fisher</td><td>ICN10274750</td><td>Otras marcas son adecuadas</td></tr><tr><td>DAPI, 4',6'-diamidino-2-fenilindol diclorhidrato</td><td>Sigma</td><td>D 9542</td><td>TOXIC. Use guantes y dispense en pequeñas alícuotas y se mueva para minimizar la exposición</td></tr><tr><td>Whatman #1 filtros de 15 cm de diámetro</td><td>Fisher</td><td>09805G</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip #1 1/2 rectángulo 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>48393-252</td><td>#1 1/2 de grosor es ópticamente mejor</td></tr><tr><td>Carpeta de portaobjetos de microscopio</td><td>VWR</td><td>48429-092</td><td>Otras marcas son adecuadas</td></tr></tbody></table>

tinción de anticuerpos en<em&gt; c. elegans</em&gt; uso de &quot;freeze-cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Para la tinción de C. elegans con anticuerpos, la cutícula relativamente impermeable deben ser anuladas por métodos químicos o mecánicos. &quot;Freeze-cracking&quot; es un método utilizado para extraer físicamente la cutícula de los nematodos mediante la compresión de nematodos entre dos diapositivas adherentes, la congelación, y tirando de las diapositivas aparte. Freeze-craqueo proporciona una manera simple y rápida para obtener acceso a los tejidos sin tratamiento químico y se puede utilizar con una variedad de fijadores. Sin embargo, conduce a la pérdida de muchas de las muestras y la compresión requerida distorsiona mecánicamente la muestra. Se requiere práctica para maximizar la recuperación de muestras con buena morfología. Freeze-craqueo puede ser optimizado para condiciones específicas de fijación, de recuperación de muestras, o bajo la tinción no específica, pero no para todos los parámetros a la vez. Para los anticuerpos que requieren fijación de condiciones muy duras y toleran los tratamientos químicos necesarios para permeabilizar químicamente la cutícula, treatmenpuede ser preferido t de nematodos intactas en solución. Si el anticuerpo requiere una solución más ligero o si las condiciones óptimas de fijación son desconocidos, congelar-craqueo proporciona una manera muy útil para ensayar rápidamente el anticuerpo y puede proporcionar información específica de localización subcelular y celular para el antígeno de interés.

Cuando los gusanos se comprimen correctamente, agrietados, y ligeramente fijos, prácticamente todo el gusano puede ser accesible para la tinción de anticuerpos (ver Figura 2). La ubicación de los núcleos, como se indica por la tinción DAPI indica qué partes del gusano están intactos Cuando los gusanos se someten a un fijador más duro, tal como formaldehído, la morfología del gusano puede distorsionarse (como se ve por la aparición no natural ondulado de la músculos de las figuras 3A-D)....

&quot;Freeze-craqueo,&quot; un método para exponer los tejidos internos del nematodo C. elegans a anticuerpos para la localización de proteínas, se demuestra.

Tinción de anticuerpos en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso de &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar la tinción con anticuerpos en C. elegans. Para ello, los nematodos se enjuagan, se distribuyen sobre portaobjetos y se comprimen cuidadosamente entre dos portaobjetos adhesivos, los cuales luego se congelan en hielo seco. A continuación, se separan los portaobjetos para romper los nematodos y se colocan inmediatamente en fijador.Los nematodos se tiñen entonces utilizando técnicas estándar de tinción con anticuerpos; el análisis mediante microscopía fluorescente revela una tinción exitosa con anticuerpos de nematodos semienteros. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la fijación de nematodos enteros, es que minimiza el tratamiento químico de la muestra. En general, las personas nuevas en este método suelen tener dificultades porque la preparación de las muestras y los nematodos es algo complicada de demostrar.El procedimiento lo realizaré yo junto con RTO Basu, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para preparar placas de nematodos para tinción, comience colocando una pieza plana de metal sobre hielo seco para enfriarla; luego, enjuague con agua destilada y una pipeta de vidrio. Transfiera los gusanos cultivados en una placa NGM de 60 milímetros con bacterias a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Los gusanos pueden estar sincronizados o de edades mixtas, pero evite usar placas con muchas larvas, que son difíciles de romper, o gusanos en ayunas, ya que aumentarán la autofluorescencia, utilizando la misma pipeta de vidrio.Lave los gusanos tres o cuatro veces con agua destilada para eliminarles las bacterias. Luego, para recolectar principalmente adultos, déjelos reposar sobre la bancada durante tres a cinco minutos. Una vez que los gusanos se hayan sedimentado en el fondo del tubo, retire la mayor parte del agua del tubo, dejando un volumen de agua aproximadamente dos veces mayor que el volumen de gusanos, pero no menos de 25 microlitros en volumen total.Etiquete el lado esmerilado de las laminillas de polilisina con tinta indeleble y coloque las laminillas sobre la superficie de trabajo junto al recipiente con hielo seco, con el lado etiquetado hacia arriba. Esta servirá como laminilla inferior. Tenga un número igual de laminillas limpias no tratadas con polilisina.Diapositivas superiores disponibles. A continuación, pipete aproximadamente 25 microlitros de gusanos en agua sobre la diapositiva de adherencia inferior y, utilizando el costado de la punta de la pipeta, extienda los gusanos sobre el centro de la diapositiva. Deje que se asienten durante 30 segundos a dos minutos.Los extremos de los gusanos se adherirán al entrar en contacto con el portaobjetos. El aspecto más difícil de este procedimiento consiste en evitar que los gusanos se deformen demasiado mientras realiza los siguientes pasos. La mejor manera de lograrlo es siendo paciente, teniendo todo preparado de antemano y evitando consumir demasiada cafeína para que sus manos estén firmes y estables.Sosteniendo la portaobjetos inferior con una mano, coloque la portaobjetos superior sobre ella de modo que todo menos las partes esmeriladas quede superpuesto. El líquido debe mantener las portaobjetos ligeramente separadas para que los gusanos aún tengan cierta movilidad. No permita que las portaobjetos se deslicen una sobre la otra, ya que esto podría torcer a los gusanos.A continuación, utilizando los pulgares e índices de cada mano, presione cuidadosamente hacia abajo sobre la cubierta superior. Con la presión adecuada, algunos de los hermafroditas más grandes se romperán en el borde de la cubierta. Mientras que la mayoría de los adultos y larvas entrarán en contacto con la cubierta pero permanecerán intactos, colóquelos inmediata y cuidadosamente sobre la pieza de metal en hielo seco, sin permitir que las cubiertas se deslicen. En un minuto, las cubiertas parecerán congeladas, pero déjelas allí durante cinco minutos para asegurar que se congelen completamente.Las láminas ya están listas para la fijación. Si no se continúa inmediatamente, almacene las láminas en una caja etiquetada a menos 80 grados Celsius durante varios días. Deben utilizarse dentro de una semana aproximadamente después de haber sido preparadas.No utilice las laminillas después de un almacenamiento prolongado. También se pueden preparar nematodos individuales en laminillas mediante un método similar al mostrado anteriormente. Coloque una pieza plana de metal sobre hielo seco para enfriarla.A continuación, utilice un punzón para nematodos para transferir individuos a una gota de agua en una placa NGM con el fin de liberarlos de las bacterias. Los nematodos deben estar bien alimentados para reducir la autofluorescencia. Si es posible, repita la transferencia a nuevas gotas de agua según sea necesario hasta que el gusano esté libre de bacterias.A continuación, prepare los portaobjetos superior e inferior como antes. Luego coloque una gota de cinco a 10 microlitros de agua en el área del portaobjeto inferior tratada con polilisina mientras observa con un microscopio. Utilice una punta para gusanos para transferir hasta 20 gusanos a la gota de agua.Los gusanos deben hundirse hasta tocar la superficie adhesiva del portaobjetos. Luego, coloque el portaobjetos superior como antes, pero no comprima, asegurándose de que los portaobjetos no se deslicen inmediatamente. Coloque los portaobjetos sobre el metal en hielo seco.Mantenga sobre hielo seco durante cinco a 30 minutos y continúe inmediatamente con la fijación. Estos portaobjetos no pueden almacenarse para su uso posterior. Para fijar ligeramente los gusanos, comience colocando frascos de tinción que contengan soluciones de fijación en hielo para enfriarlos durante 10 minutos.Las soluciones necesarias son metanol al 100 %, acetona al 100 % y solución salina tamponada con fosfato. Tome un par de portaobjetos inferior y superior del hielo seco, sepárelos rápidamente girándolos y sumerja inmediatamente el portaobjetos inferior en metanol frío con hielo durante dos minutos; deseche el portaobjetos superior. A continuación, transfiera los portaobjetos del metanol a acetona fría con hielo durante cuatro minutos.Si las láminas tenían muchos gusanos, la mayoría de ellos se desprenderá en el fijador incluso con láminas bien preparadas. Si las láminas con gusanos individuales se prepararon adecuadamente, los gusanos deben permanecer adheridos. Finalmente, para eliminar el fijador, sumerja las láminas en el frasco con PBS.Las laminillas ya están listas para la tinción y para realizar una fijación permanente utilizando formaldehído o glutaraldehído. Comience diluyendo una solución de formaldehído o glutaraldehído grado reactivo en PBS hasta una concentración final de 0,5 a 4 %. Los alícuotas pueden almacenarse a entre -20 y -30 grados y descongelarse según sea necesario. Recuerde siempre que el formaldehído y el glutaraldehído son muy tóxicos, por lo que debe usar guantes y trabajar en una campana extractora.Tome un par de portaobjetos inferior y superior del hielo seco y sepárelos rápidamente con un movimiento de torsión inmediato. Coloque el portaobjetos inferior, que contiene los gusanos, en un recipiente plano con tapa; deseche inmediatamente el portaobjetos superior y agregue mediante pipeta 200 microlitros del fijador sobre el centro de la zona del portaobjetos con los gusanos. El fijador se congelará parcialmente en su lugar y luego se descongelará para cubrir una región más amplia del portaobjetos.Si los gusanos no quedan completamente cubiertos con el fijador inmediata y cuidadosamente, agregue más fijador utilizando una micropipeta. No permita que el fijador fluya por encima del borde del portaobjetos. Añada paños limpios sin pelusas doblados y humedecidos al recipiente para mantenerlo humedecido.No permita que las toallitas toquen los portaobjetos. Luego, cubra el recipiente con una tapa y déjelo de 10 minutos a toda la noche a temperatura ambiente después de que la fijación esté completa; use una pipeta para transferir cuidadosamente el fijador con los gusanos sueltos a un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, sumerja el portaobjetos en un frasco de tinción que contenga PBS.Centrifugar el tubo que contiene los gusanos a alta velocidad durante 30 segundos para formar un pellet. Lavar los gusanos dos veces con PBS. A continuación, proceder a teñirlos en paralelo con los gusanos sobre el portaobjetos.El protocolo de tinción con anticuerpos es similar a los protocolos estándar para cualquier tejido en portaobjetos y se describe detalladamente en el documento adjunto. Después de la tinción, transfiera los portaobjetos al PBS y déjelos reposar allí hasta 12 horas a cuatro grados Celsius hasta que estén listos para ser montados. Para montar los portaobjetos, retire un portaobjeto del PBS.Utilice una toallita sin pelusas para secar el dorso y luego colóquela brevemente sobre una toalla de papel de forma rápida. Coloque aproximadamente 20 microlitros de medio de montaje sobre los gusanos de modo que haya partes aproximadamente iguales de medio y PBS. Sobre el portaobjetos.Incline suavemente la laminilla para mezclar las dos soluciones. Precaución: el medio de montaje es tóxico. Sostenga el borde mate.Incline la lámina de modo que la solución se acumule cerca del esmalte. Luego coloque un borde de una cubreobjetos de 24 por 60 milímetros sobre la solución para minimizar las burbujas de aire, que aumentan el blanqueamiento e interfieren la observación. Baje la cubreobjetos suavemente.Si se forman burbujas, levante lentamente el borde de la laminilla. Luego, sin deslizarla sobre los gusanos, vuelva a bajarla. Añada más PBS si es necesario para eliminar las burbujas de aire.Utilizando una toallita sin pelusa, comprima cuidadosamente los bordes de la lámina de cobertura y del portaobjetos para secarlos. El borde del portaobjetos debe ser visible alrededor de todo el perímetro de la lámina de cobertura y no debe estar demasiado húmedo. Selle la lámina de cobertura y aplique dos o tres capas de esmalte de uñas en el borde.Una vez que la laminilla esté bien sellada y seca, limpie la cubreobjetos y la parte posterior del portaobjetos, y colóquelo en los pocillos del portadiapositivas. Las laminillas selladas pueden conservarse durante días a cuatro grados Celsius o semanas a veinte grados bajo cero durante períodos más largos. La tinción DAPI del ADN y la mayoría de los colorantes verdes se desvanecen; vuelva a sellar la cubreobjetos con más esmalte de uñas según sea necesario, especialmente después de usar cualquier objetivo de inmersión en aceite.Las siguientes imágenes representativas se obtuvieron utilizando portaobjetos preparados durante los primeros intentos de tinción con anticuerpos realizados por estudiantes de pregrado en un curso de laboratorio de biología celular. Esta imagen muestra un ejemplo de las cabezas de dos hermafroditas adultos adecuadamente comprimidas, agrietadas y ligeramente fijadas con acetona metanólica. Fueron marcadas con múltiples anticuerpos y colorantes.En este caso, prácticamente todo el gusano es accesible para los anticuerpos. En esta tinción, la ubicación de los núcleos indicada por la tinción con DPI indica qué partes del gusano están intactas. Cuando los gusanos se someten a un fijador más fuerte, como el formaldehído, la morfología del gusano puede llegar a distorsionarse.Esto puede observarse en estas imágenes como una apariencia ondulada de los músculos mostrados en rojo. Otro problema común asociado con el uso de fijadores más duros es la fijación o penetración desigual de ciertos tejidos. Esto puede verse aquí, donde el músculo mostrado en rojo está teñido solo en una porción del gusano.Aquí, la presencia de otras coloraciones, incluyendo el ADN, mostrada en azul, indica que al menos una parte del cuerpo estaba presente. El patrón resultante de coloración parcial puede identificarse fácilmente con la práctica, de modo que se pueda determinar la distribución completa de la coloración incluso si en cualquier gusano individual se observa una coloración irregular. Se ilustran aquí problemas comunes que se presentan con la técnica de congelación y fractura, utilizando cualquier condición de fijación.El problema más común es el torsionamiento de la muestra debido al movimiento relativo entre las dos laminillas. Durante la compresión, la morfología de los tejidos teñidos indica que el cuerpo del gusano está torcido justo posterior a la faringe. Esta imagen también muestra el problema del tinción de fondo debido a la adherencia del anticuerpo al recubrimiento de polilisina en la laminilla.Esto puede evitarse utilizando el microscopio confocal. Tenga en cuenta que, incluso con práctica, muchos gusanos individuales se pueden perder o presentar algunos de los problemas mostrados aquí. Una vez dominada la técnica, la preparación y fijación pueden realizarse en una hora y la coloración puede completarse en un día.Tras seguir este procedimiento, se puede realizar una variedad de métodos de fijación para optimizar la tinción con cualquier anticuerpo y tejido determinados.

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Investigación

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Biología

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Este es un método comúnmente utilizado para la disección de gónadas de C. elegans seguida de grieta por congelación, que produce muestras de línea germinal para inmunofluorescencia a través de tinción de anticuerpos, o para tinción DAPI simple para visualizar el ADN. Este protocolo ha sido exitoso para los estudiantes universitarios en un laboratorio de investigación y en una experiencia de investigación de pregrado basada en cursos.

C. elegans Disección de gónadas y grieta por congelación para inmunofluorescencia y tinción DAPI

La microscopía de superresolución puede proporcionar una visión detallada de la organización de los componentes dentro del complejo sinaptonémico en la meiosis. Aquí, demostramos un protocolo para resolver proteínas individuales del complejo sinaptonémico Caenorhabditis elegans .

Microscopía de superresolución del complejo sinaptonémico dentro de la línea germinal Caenorhabditis elegans

Aprende la técnica de freeze-cracking para tinción de anticuerpos en C. elegans, minimizando el tratamiento químico y mejorando la localización de proteínas en nematodos semíntegros mediante microscopía de fluorescencia.

Tinción de anticuerpos en

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