Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la fluorescencia para cuantificar la respuesta a las ráfagas respiratorias. Primero, cargue los embriones de pez cebra en los pocillos de una placa de 96 pocillos. A continuación, añade un sustrato fluorescente y activa el estallido respiratorio con un agente químico.

A continuación, cuantifique la fluorescencia relativa utilizando un fluorímetro. En última instancia, la fluorescencia se utiliza para mostrar el potencial de ráfaga respiratoria. Este método se puede utilizar para estudiar cómo las manipulaciones experimentales afectan a la salud inmunitaria innata en general.

Aquí lo usamos para proporcionar información sobre el estallido respiratorio de los embriones de pez cebra, pero también se puede aplicar a otros sistemas como el pez cebra adulto, las células de riñón y las preparaciones celulares de otras especies de peces. Cultive los embriones en placas de Petri profundas a 28 grados centígrados en agua de huevo hasta la etapa de desarrollo deseada. Retira los embriones muertos a diario.

Decanta con cuidado el agua de huevo vieja y reponla con agua de huevo nueva todos los días. El día del experimento, prepare una solución de trabajo de fluoresceína reducida en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros envuelto en papel de aluminio. Prepare también una solución de trabajo de 20 microgramos por mililitro de concentración final de PMA.

A continuación, prepare cinco mililitros de cada solución dosificadora en tubos cónicos de 15 mililitros como se describe en el texto adjunto. Mantenga las soluciones de dosificación en hielo, primero encienda el lector de microplacas y caliente la fuente de luz para medir la fluorescencia. Establezca un programa que detalle las longitudes de onda de excitación y emisión, la sensibilidad de la posición óptica y también incluya un paso de agitación de cinco segundos.

Antes de la caña, organice los suministros experimentales de platos con embriones recubiertos. Una microplaca negra de 96 pocillos, una pipeta P 200 y puntas una cubitera con los reactivos que contienen fluoresceína. Un pipeteador P 200 multicanal, dos depósitos estériles, papel de aluminio y tijeras.

Ahora corte la punta de una pipeta de manera que los embriones o los riñones puedan pasar a través de la abertura. Ajuste una pipeta P 200 a 100 microlitros y transfiera un embrión junto con agua de huevo a tantos pocillos de una microplaca negra de 96 pocillos como desee. Ahora vierta la solución dosificadora en un depósito estéril de 25 mililitros con una pipeta P 200 multicanal.

Agregue 100 microlitros de solución dosificadora de H 2D CFDA en una columna de los 96. La microplaca de pocillo se repite para la mitad de las muestras de embriones de control y la mitad de las muestras de embriones manipulados experimentalmente. Vierta la solución dosificadora que contiene PMA en un nuevo depósito estéril de 25 mililitros.

A continuación, alícuota esta solución dosificadora en las columnas restantes de la microplaca de 96 pocillos. Cubra la microplaca con papel de aluminio y colóquela en una coctelera durante aproximadamente 20 segundos. A 150 RPM, incubar la microplaca a 28 grados centígrados cuando no se esté leyendo.

Lea la microplaca después de la adición de PMA. Continúe tomando medidas cada pocos minutos durante el intervalo de tiempo deseado, o incube la microplaca envuelta en papel de aluminio a 28 grados Celsius hasta un punto de tiempo fijo. A continuación, recupere los embriones de los pozos y eutanasie los embriones de acuerdo con el protocolo institucional de cuidado y uso de animales.

Además, deseche la microplaca y otros materiales desechables en el pintor de residuos biopeligrosos. Decida el punto de tiempo en el que le gustaría comparar la fluorescencia. Reste el valor promedio de fluorescencia del grupo de control no inducido de los valores de fluorescencia de la influenza del grupo de control inducido por PMA individual.

Repita esto para el grupo experimental con y sin PMA. A continuación, almacene estos valores de fluorescencia normalizados en columnas, el grupo de control más PMA y el grupo experimental más PMA. A continuación, calcule las medias y desviaciones estándar para los valores de fluorescencia normalizados del grupo control más PMA y del grupo experimental más PMA.

Compare los valores de fluorescencia normalizados utilizando una prueba T no apareada para determinar la significación estadística. Ahora, grafique las medias del grupo de control más PMA y el grupo experimental más PMA con barras de error que reflejen las desviaciones estándar apropiadas y registre el nivel de significación en el gráfico y en la leyenda de la figura. Este experimento compara la respuesta de estallido respiratorio en embriones de pez cebra de tipo salvaje de fondo AB a las 48 horas y 72 horas después de la fertilización.

La fluorescencia bruta se midió cuatro horas después de la adición de PMA en los grupos inducidos por PMA. Los valores de fluorescencia bruta fueron más altos en la población de 72 HPF. Como lo indican las medias calculadas, los valores de fluorescencia se normalizan para tener en cuenta la variabilidad en los niveles de fondo de fluorescencia.

Los resultados de este ensayo de estallido respiratorio revelaron que los 72 embriones de pez cebra HPF son capaces de producir significativamente más especies reactivas de oxígeno y, por lo tanto, montar una respuesta de estallido respiratorio más robusta que los 48 embriones de HPF después de la inducción con PMA. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la fluorescencia para cuantificar el potencial de ráfagas respiratorias de los embriones de pez cebra. No olvide que trabajar con polvo de PMA puede ser extremadamente peligroso, así que tome precauciones como usar una mascarilla mientras pesa el polvo de PMA.