Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la fluorescencia para cuantificar la respuesta de estallido respiratorio. Primero, cargue los embriones de pez cebra en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Luego, agregue un sustrato fluorescente y active el estallido respiratorio con un agente químico.

Luego, cuantifique la fluorescencia relativa utilizando un fluorímetro. En última instancia, la fluorescencia se utiliza para mostrar el potencial de estallido respiratorio. Este método puede emplearse para estudiar cómo las manipulaciones experimentales afectan la salud inmunológica innata en general.

Aquí lo utilizamos para obtener información sobre la ráfaga respiratoria de embriones de pez cebra, pero también puede aplicarse a otros sistemas como peces cebra adultos, células renales y preparaciones celulares de otras especies de peces. Cultive los embriones en placas de Petri profundas a 28 grados Celsius en agua de huevo hasta la etapa de desarrollo deseada. Retire diariamente los embriones muertos.

Vierta cuidadosamente el agua vieja de los huevos y reponga con agua nueva diariamente. El día del experimento, prepare una solución trabajo de fluoresceína reducida en un tubo microcentrífugo de 1,7 mililitros envuelto en papel de aluminio. También prepare una solución trabajo con una concentración final de 20 microgramos por mililitro de PMA.

Luego prepare cinco mililitros de cada solución de dosificación en tubos cónicos de 15 mililitros, como se describe en el texto adjunto. Mantenga las soluciones de dosificación en hielo; primero encienda el lector de microplacas y caliente la fuente de luz para medir la fluorescencia. Configure un programa que especifique las longitudes de onda de excitación y emisión, la sensibilidad de la posición óptica, y también incluya un paso de agitación de cinco segundos.

Antes de la lectura, organice los materiales experimentales: placas con embriones recubiertos, una microplaca negra de 96 pocillos, un pipeta P-200 con puntas, un cubo de hielo con los reactivos que contienen fluoresceína, un pipeta multicanal P-200, dos depósitos estériles, papel de aluminio y tijeras.

Ahora corte la punta de una pipeta de manera que los embriones o riñones puedan pasar a través de la abertura. Ajuste una pipeta P 200 a 100 microlitros y transfiera un embrión junto con agua de huevo a tantos pozos como desee de una microplaca negra de 96 pozos. A continuación, vierta la solución de dosificación en un reservorio estéril de 25 mililitros utilizando una pipeta multicanal P 200.

Añada 100 microlitros de la solución de dosificación H 2D CFDA en una columna de la microplaca de 96 pocillos y repita el procedimiento para la mitad de las muestras de embriones control y la mitad de las muestras de embriones manipulados experimentalmente. Vierta la solución de dosificación que contiene PMA en un nuevo reservorio estéril de 25 mililitros.

Luego, alícuote esta solución de dosificación en las columnas restantes de la microplaca de 96 pocillos. Cubra la microplaca con papel de aluminio y colóquela en un agitador durante aproximadamente 20 segundos. Incube la microplaca a 28 grados Celsius a 150 RPM cuando no esté siendo leída.

Lea la microplaca tras la adición de PMA. Continúe tomando mediciones cada pocos minutos durante el intervalo de tiempo deseado, o incube la microplaca envuelta en papel de aluminio a 28 grados Celsius hasta un punto de tiempo fijo. A continuación, recupere los embriones de los pocillos y eutanice los embriones según el protocolo institucional de cuidado y uso de animales.

Asimismo, deseche la microplaca y otros materiales desechables en el recipiente para residuos biopeligrosos. Decida el punto temporal en el que desea comparar la fluorescencia. Reste el valor promedio de fluorescencia del grupo control no inducido de los valores individuales de fluorescencia del grupo control inducido con PMA.

Repita esto para el grupo experimental con y sin PMA. Luego, almacene estos valores de fluorescencia normalizados en columnas: el grupo control más PMA y el grupo experimental más PMA. A continuación, calcule las medias y las desviaciones estándar de los valores de fluorescencia normalizados del grupo control más PMA y del grupo experimental más PMA.

Compare los valores de fluorescencia normalizados mediante una prueba T no pareada para determinar la significancia estadística. Luego, grafique las medias del grupo control más PMA y del grupo experimental más PMA con barras de error que reflejen las desviaciones estándar apropiadas; registre el nivel de significancia en el gráfico y en la leyenda de la figura. Este experimento compara la respuesta de estallido respiratorio en embriones de pez cebra de tipo silvestre de fondo AB a las 48 y 72 horas posteriores a la fertilización.

Se midió la fluorescencia cruda cuatro horas después de la adición de PMA en los grupos inducidos con PMA. Los valores de fluorescencia cruda fueron más altos en la población de 72 HPF. Como indican las medias calculadas de los valores de fluorescencia, estos se normalizaron para compensar la variabilidad en los niveles de fondo de la fluorescencia.

Los resultados de este ensayo de estallido respiratorio revelaron que los embriones de pez cebra a las 72 HPF son capaces de producir significativamente más especies reactivas de oxígeno y, por lo tanto, desencadenar una respuesta de estallido respiratorio más robusta que los embriones a las 48 HPF tras la inducción con PMA. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la fluorescencia para cuantificar el potencial de estallido respiratorio de los embriones de pez cebra. No olvide que trabajar con el polvo de PMA puede ser extremadamente peligroso, por lo que debe tomar precauciones, como usar una mascarilla facial al pesar el polvo de PMA.