Biopolímeros Nano basados ​​en ácido polimálico de Focalización de múltiples Marcadores tumorales: una oportunidad para la medicina personalizada?

El objetivo general es establecer una plataforma a escala nanométrica abierta para un protocolo universal de síntesis de medicina personalizada basada en el perfil genético de la enfermedad de una persona, especialmente en el caso del cáncer. Primero, produzca y purifique el ácido polimalico a partir del microorganismo frum polycephalum; active químicamente el PMLA purificado en sus grupos carboxílicos laterales. Una los grupos funcionales pequeños y el enlazador MEA mediante la sustitución de los grupos activados y convierta los grupos activados no utilizados nuevamente en grupos carboxílicos mediante hidrólisis.

A continuación, agregue los anticuerpos y las moléculas antisentido mediante los grupos sulfhidrilo del espaciador, MEA y tapa. El espaciador no utilizado mediante reacción con PDP al finalizar la prueba evalúa la composición y la función del compuesto principal. El fármaco nano surge a partir de un modelo animal como ratones que portan humanos agresivos.

El cáncer de mama positivo para HER2 puede determinar la eficacia del tratamiento y también si este se lleva a cabo sin efectos secundarios no deseados. La principal ventaja de la bioproducción frente a los métodos sintéticos existentes, como la polimerización por apertura de anillo, es que el biopolímero conserva la pureza óptica completa y no está contaminado con subproductos. Esta familia de nanofármacos PolyPhen puede dirigirse a cualquier tipo celular basándose en un direccionamiento específico y regular la expresión de proteínas.

Generalmente, el tratamiento del cáncer mediante nanofármacos PHE es muy eficaz en varios modelos animales, especialmente en cánceres cerebrales y de mama primarios. Inicialmente tuvimos la idea de este método para bloquear la síntesis de la laminina específica de glioblastoma en sus isoformas, y posteriormente demostramos el direccionamiento y la inhibición de las proteínas HER2 y del cáncer de mama triple negativo para prevenir el crecimiento tumoral. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico del cáncer mediante imágenes ópticas y resonancia magnética.

Los medicamentos poli-nano pueden proporcionar información sobre la administración de fármacos para el tratamiento del cáncer. También pueden aplicarse a otras condiciones patológicas, como enfermedades infecciosas, alivio del dolor y trastornos neurológicos. Después de cultivar una cepa de plasmodio a partir de spial, inocule 100 mililitros de medio de cultivo basal y cultive la muestra a 25 grados Celsius.

El incubador termorregulado produce una cantidad de microplasma modia compactada por gravedad, excluyendo la luz. Para evitar la esporulación en un biorreactor de 10 litros, disuelva 80 gramos de carbonato de calcio en ocho litros de medio basal, luego transfiera el microplasma modia compactado al recipiente de reacción montado y configure el bioproceso durante 75 horas. A 25 grados Celsius, con un flujo de aire filtrado de 10 litros por minuto y agitación de 150 RPM mediante una barra agitadora segmentada.

Cuando el caldo de cultivo tenga un pH de 4,8, detenga el cultivo para medir la producción de ácido polimaléico. Enfriar ahora el caldo a 17 grados Celsius y permitir que las células sedimenten por gravedad, y eliminar el sobrenadante del cultivo del reactor. Ajustar el pH a 7,5.

Ahora, aspire el sobrenadante desde la parte inferior a través de una columna de celulosa DEAE de 1,5 litros equilibrada con clorhidrato de tris 20 milimolar pH 7,5 a cinco grados Celsius. Luego, pase tres volúmenes de columna de tampón de lavado que contenga cloruro de sodio 0,3 molar desde la parte inferior hasta la superior de la columna y eluya el PMLA en presencia de cloruro de sodio 0,7 molar. Ajuste la fracción eluida de PMLA a cloruro de calcio 0,1 molar y agregue etanol al 80% frío con hielo para precipitar el PMLA de calcio. A continuación, fraccione por tamaño el PMLA de calcio utilizando Cidex G-25 y agua.

Finalmente, pase cada fracción a través de una columna de luz ámbar e inmediatamente congele el flujo de ácido polimalico en nitrógeno líquido y liofilice antes de almacenar a menos 20 grados Celsius. Para activar los grupos carboxilo del PMLA, mezcle un milimol de unidades de ácido málico de P-M-L-A-H en un mililitro de acetona anhidra y un milimol, de cada uno, de hidroxiciánido y carbodiimida ciclohexil en dos mililitros de dimetilformamida; después de agitar a 20 grados Celsius durante tres horas, añada 0,05 milimoles de metil-PEG-amina en un mililitro de DMF seguido de 0,05 milimoles de trietilamina.

Luego, agregue de forma gota a gota 0,4 milimoles de éster etílico de leucina y, tras una hora, verifique la finalización de la reacción mediante la respuesta negativa al ensayo de hyn en cromatografía en capa fina. De manera similar, agregue 0,1 milimoles de dos mer-capto, 1 etilamina y 0,5 milimoles de TEA. Elimine el exceso de éster de NHS mediante hidrólisis espontánea con solución salina tamponada con fosfato.

Desalifique mediante una columna PD 10 y liofilice para obtener un polvo blanco; almacene este preconjugado seco a menos 20 grados Celsius. A continuación, añada 30 miligramos de anticuerpo en 4,5 mililitros de cloruro de sodio 150 milimolar en fosfato de sodio 100 milimolar a pH 5,5. Reduzca los enlaces disulfuro con tris 5 milimolar, clorhidrato de carboxietil fosfina 2, y purifique mediante una columna PD 10.

Ahora, disuelva el IDE PEG IDE en dos mililitros del tampón anterior, aunque a pH 6,3. Añada el anticuerpo reducido y agite a 20 grados Celsius durante una hora. Concentre hasta 2,5 mililitros mediante AVEVA spin 20 con exclusión de 30 kilodalton y luego purifique mediante cidex G 75.

Ahora verifique el producto mediante HPLC con columna de exclusión por tamaño. Mida la cantidad a 280 nanómetros y también confirme la ausencia de impurezas a otras longitudes de onda. A continuación, mezcle 50 miligramos del precursor con 200 MLEs del PEG IDE conjugado con anticuerpo en cinco mililitros de tampón pH 6,3.

Ajuste la concentración de sulfhidro a dos milimolares e incube a 20 grados Celsius durante tres horas. Para obtener un rendimiento del 98 %, solubilice el oligonucleótido antisentido amino tres primos, haga reaccionar con un volumen de SPDP, purifique el A-O-N-P-D-P sobre Cidex LH 20 en metanol, luego evapore el metanol, disuelva el producto en agua y liofilice. Incube ahora 800 nanomoles del aos activado con el preconjugado de anticuerpo PEG a MEA SH durante la noche. Cuando la reacción de intercambio de disulfuro haya finalizado, incorpore el bloque de colorante fluorescente, bloquee los excesos de sulfhidros con PDP y purifique sobre Cidex G 75.

Almacene el nano fármaco final a base de ácido polimalico a menos 20 grados Celsius. Para estimar el contenido de ácido polimalico durante la producción, proceda de la siguiente manera: a 320 microlitros de muestra, agregue 160 microlitros de cloruro de hidroxilamonio al 10% y 160 microlitros de hidróxido de sodio al 10%. Después de 10 a 15 minutos, mezcle con 160 microlitros de solución de cloruro férrico al 5% y visualice la formación de un color púrpura oscuro a 540 nanómetros. A continuación, hidrolice el nano fármaco durante la noche en ácido clorhídrico dos molar a 110 grados Celsius utilizando un ensayo con ampolla sellada para ácido maleico mediante cromatografía de fase reversa.

Utilizando muestras enriquecidas con estándares de ácido maleico. Ahora, escindir el fármaco nano con dihidroxi-tiol 100 milimolar y medir los oligonucleótidos antisentido morpho mediante HPLC cuantitativa de fase reversa frente a estándares de ON morpho. Usando el fármaco nano escindido, medir el contenido de anticuerpo mediante un kit de ensayo de proteínas para cuantificar el contenido de PEG Malik.

Primero, reaccione con tiocianato de amonio, luego extraiga con cloroformo y mida la absorbancia a 510 nanómetros. Evalúe la actividad del anticuerpo y la co-ligación mediante ELISA utilizando cinco microlitros de nano fármaco por pocillo y 0,5 microgramos por pocillo de Her2 como antígeno recubierto en placa. Finalmente, calcule el porcentaje obtenido para el oligonucleótido antisentido, EG y anticuerpo con respecto al ácido maleico.

Comparar con el porcentaje previsto por el diseño del fármaco. Este enfoque estratégico bimodal hacia el fármaco nano emplea Herceptin para inhibir la vía de señalización HER2 y un ON específico para HER2 para bloquear la transcripción de los anticuerpos del receptor HER2, lo que facilita la transcitosis mediante el TFR endotelial del vaso tumoral. La plataforma nanoconjugada de ácido polimaléico fue producida por microplasmo cultivado y purificada; la activación de los grupos carboxílicos del PMLA facilitó la síntesis del andamiaje preconjugado.

Y finalmente, el nanoconjugado de plomo. Los ensayos Eli SA demostraron la retención de anticuerpos monoclonales activos durante toda la síntesis del fármaco nano. Con ambos anticuerpos ensamblados en la misma plataforma polimérica, la microscopía confocal de fluorescencia rastreó la absorción celular del fármaco nano.

Las imágenes superpuestas en cero y tres horas se analizaron junto con los endosomas marcados. Los coeficientes de correlación de Pearson para la colocalización indican la liberación del nano fármaco desde los endosomas hacia el citoplasma y la disociación de un ON del nano fármaco mediante la escisión dependiente de glutatión de un enlace disulfuro en el citoplasma. In vitro, el nano fármaco principal inhibió significativamente el crecimiento de manera más efectiva en la línea celular que sobreexpresa HER2.

Experimentos in vivo en ratones portadores de cáncer de mama humano BT474, con sobreexpresión de HER2, mostraron una inhibición del crecimiento superior al 95 % mediante el nano fármaco principal que contiene Herceptin®. Y el inmunotransferencia ex vivo específico para HER2 indicó la inhibición tanto de la síntesis de HER2 como de la fosforilación de AKT, y la escisión de PARP marcó la apoptosis. La regresión tumoral en respuesta al tratamiento con el fármaco se demuestra mediante la reducción del tamaño del tumor y el agotamiento de las células tumorales mediante examen histológico.

Ahora debería tener una buena comprensión de cómo utilizar una plataforma nano biocompatible para lograr un tratamiento personalizado eficaz sin efectos secundarios y obtener un fármaco nano con una composición controlada y actividades funcionales verificadas. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse con alta reproducibilidad tras su desarrollo. Esta técnica que emplea una plataforma nano de ácido poliacrílico para la administración dirigida de oligonucleótidos antisentido allana el camino para que los investigadores en el campo de la medicina nano personalizada exploren tratamientos contra tumores dirigidos a marcadores moleculares tumorales específicos identificados mediante análisis genéticos personalizados. Farmacológicamente, los agentes activos y las células pueden ser extremadamente peligrosos.

Siempre se deben tomar precauciones, como usar mascarilla y guantes, al realizar este procedimiento.