Name: Un ensayo de microplacas para evaluar los efectos químicos sobre RBL-2H3 mástil degranulación: Efectos de Triclosan y sin uso de un disolvente orgánico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T19:45:00.000+00:00
Duration: 17 min 35 s
Description: Aprende a evaluar la degranulación de mastocitos RBL-2H3 mediante un ensayo de microplacas sin disolventes orgánicos. Este método permite cuantificar los efectos inhibidores del triclosan en respuestas alérgicas.

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LMW y RHK son apoyados por la Escuela de Graduados de Ciencias Biomédicas e Ingeniería (GSBSE) de UMaine; RHK también fue apoyada por el Maine Agrícola y la Estación Experimental Forestal. Igualmente está subvencionado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIH P20-GM103423), el Maine Agrícola y la Estación Experimental Forestal (número de concesión ME08004-10, JAG), la Universidad de Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF Grant # 1008498) y una investigación Starter Grant en Farmacología / Toxicología de la Fundación PhRMA (JAG). Agradecemos a los Dres. David Holowka y Barbara Baird por el antígeno y células. Estamos muy agradecidos a Hina Hashmi, Alejandro Vélez, y Andrew Abovian para obtener ayuda con equipos y pedidos. Se trata de Maine Agrícola y Forestal de la Estación Experimental número de publicación 3311.

En 2004, Naal et. Al 1 desarrolló un biosensor de los mastocitos para pruebas de alto rendimiento de la degranulación. Se trata de un ensayo robusto que hemos adaptado para nuestros estudios de TCS y detallados en este video. Antes de la Naal et al. 1 ensayo, la desgranulación de mastocitos se ha evaluado de forma rutinaria a través de β-hexosaminidasa 59-61, pero estos primeros métodos utilizados fluorómetros en el que una muestra se leyó a la vez. Es importante destacar que, Naal et a...

Los mastocitos son altamente granular células inmunes efectoras que sirven como mediadores en el asma, las alergias, parásitos de defensa y la carcinogénesis 13-16. Ellos residen en casi todos los tejidos vascularizados 15, donde se almacenan de forma segura mediadores inflamatorios y alérgicos en los gránulos citoplasmáticos hasta que se activa a degranulación. La desgranulación es la exocitosis de gránulos unidos a la membrana, lo que resulta en la liberación de mediadores farmacológicamente activos, tales como histamina, triptasa, y los leucotrienos 15. Este proceso resulta en la iniciación de las reacciones de hipersensibilidad de tipo I que son críticos en la defensa contra los parásitos de montaje, así como el inicio de las respuestas alérgicas, asmáticas, y carcinogénicos 15. Los mastocitos y basófilos expresan receptores varepsilon RI, los receptores de alta afinidad para la inmunoglobulina E (IgE) 17. La exposición a un alérgeno o antígeno provoca la agregación de múltiples receptores varepsilon RI de IgE enlazados a 17, y es este so-llamado &quot;reticulación&quot; de los receptores de Fc de IgE unidas a que inicie el proceso de desgranulación: una cascada de eventos de fosforilación de tirosina, la activación de la fosfolipasa C, flujo de calcio desde las reservas internas, y la afluencia de calcio en la célula 18. Este influjo de calcio es necesario para la desgranulación, y, además, señales de fusión de gránulos con la membrana antes de causar la exocitosis de los gránulos 15. Experimentalmente, un ionóforo de calcio se puede utilizar para transportar calcio directamente a través de la membrana de la célula 19, que esencialmente no pasa por todos los pasos de transducción de señales antes de la etapa influjo de calcio 20, lo que permite la identificación de un objetivo por vía de un tóxico como aguas arriba o aguas abajo de señalización de calcio 20. La desgranulación se puede medir con rapidez y eficacia mediante el control de la liberación de β-hexosaminidasa en sobrenadante de células, que se libera linealmente a partir de los gránulos junto con histamina 6, pero is mucho más fácil de detectar utilizando una reacción enzima-sustrato simple y un lector de microplacas a ensayo el producto fluorescente. Esta microplaca de ensayo, como se detalla en la sección de protocolo, se basa en un método robusto desarrollado originalmente por Naal et al. 1, que cuantifica la escisión del sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-N-acetil-β-D-glucosaminida por β- hexosaminidasa. Hemos modificado el ensayo a efectos de prueba de los fármacos y sustancias tóxicas, con triclosán resaltado aquí. Este método cuantifica con fiabilidad la desgranulación, es una alternativa económica a, por ejemplo, métodos de detección de citometría de flujo basados ​​en 21, y tiene el potencial de que se presta muy bien a la selección de alto rendimiento de una amplia variedad de fármacos contra la alergia, así como inmunotóxicos o sustancias químicas alergénicas. Este último punto es particularmente importante a la luz de las &quot;Pruebas de Toxicidad 2007 informe del Consejo Nacional de Investigación en el siglo 21: una visión y una Stratgia &quot;( <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a> ), que aboga por el desarrollo de las pruebas de toxicología de alto rendimiento que utilizan cultivo de células para reducir el costoso uso de animales de laboratorio tradicionales tales como ratones. El protocolo desarrollado por la desgranulación de Naal et al. 1 y modificado por nosotros 2, utiliza la línea de células RBL-2H3, que es un modelo bien aceptado homóloga a mastocitos de la mucosa humanos o basófilos 3-5. (Los métodos para el cultivo de células RBL-2H3 se detallan en Hutchinson et al. 22). Este ensayo probablemente podría ser adaptado a cualquier tipo de célula mástil adjunto. Triclosan (TCS) es un antimicrobiano de amplio espectro que se ha utilizado durante más de 30 años en los hospitales, productos de cuidado personal, y bienes de consumo 23,24. El modo de acción antimicrobiana de la característica de TCS es la inhibición de la biosíntesis de ácidos grasos, probablemente mediante la inhibición de enoil-aciloproteína portadora reductasa 25,26. Se encuentra en todo el mundo en una amplia gama de productos de consumo, tales como gel de ducha, loción para las manos, pasta de dientes, enjuague bucal, y en jabones de tocador en concentraciones de hasta el 0,3% o 10 mM 24. El uso generalizado de TCS se ha traducido en niveles detectables en los seres humanos 27 a 29 y en los ríos y arroyos 30. Un estudio realizado por Allmyr et al. 27 demostró que los ECT y sus metabolitos están presentes tanto en el plasma y la leche de las madres lactantes. Es importante destacar que, TCS se absorbe fácilmente en la piel 31-37. Queckenberg et al. Encontraron 37 ~ 10% de absorción de un ~ 70 mM de TCS crema en la piel humana dentro de 12 horas, lo que resulta en una concentración significativa en la piel, donde residen las células cebadas. TCS ha demostrado clínicamente para controlar la enfermedad alérgica en la piel humana 7-11, pero el mecanismo por el cual TCS alivia las enfermedades alérgicas de la piel ha sido desconocido 38. Uso de la microplaca de ensayo fluorescente detailed en este video, recientemente hemos demostrado que TCS, a concentraciones tan bajas como 2 M, amortigua significativamente la función de los mastocitos y degranulación, proporcionando una posible explicación de estos datos clínicos 2. Además de proporcionar una explicación de estos datos clínicos, nuestros hallazgos en Palmer et al. 2 sugieren que los ECT se dirige a moléculas de señalización aguas abajo de la entrada de calcio. Debido a la importancia de la señalización de calcio en muchos inmunológica y otros procesos biológicos, TCS potencialmente podría tener efectos adversos en una amplia variedad de procesos biológicos necesarios. De hecho, Udoji et al. 39 demostraron que TCS suprime la actividad lítica de las células asesinas naturales humanos, otra importante función inmune innata. Más allá de su potencial como una ayuda terapéutica en la enfermedad alérgica de la piel (o, a la inversa, como un inmunotóxico), TCS también puede ser un disruptor endocrino 40-49. Así, un procedimiento claro sobre cómo preparar esta sustancia química en solución is de interés para los toxicólogos. Debido a TCS es una pequeña molécula hidrófoba, los vehículos orgánicos se utilizan a menudo para que sea más soluble en agua. En la mayoría de los estudios de toxicidad donde TCS ha sido probado, la preparación ha implicado la disolución en agua con la ayuda de un disolvente orgánico tal como etanol, acetona, o aceite 2,50,51. Sin embargo, muchas veces estos disolventes son biológicamente activos a sí mismos, lo que complica la interpretación de los datos de la sustancia problema 51. De hecho, de acuerdo con Rufli et al. 52 y otros 53, se recomienda que las soluciones de prueba para los experimentos de toxicidad acuática se preparan utilizando métodos físicos sobre los métodos químicos, debido a la posibilidad de disolventes químicos para crear artefactos de toxicidad. Hemos demostrado anteriormente que los ECT disolvió en 0,24% de etanol / agua (vol / vol) y se sometió a ultrasonidos durante 30 min amortigua RBL degranulación de los mastocitos 2. El etanol a concentraciones más altas que 0,24% se ha demostrado para amortiguar la degradación de los mastocitoscanulación 54,55-ejemplos de los efectos de confusión potenciales de disolventes orgánicos en los estudios de toxicidad. No sólo es importante tener en cuenta el efecto de los disolventes sobre el organismo o las células utilizadas para el estudio, pero también es importante para controlar el efecto de un disolvente sobre la propia sustancia de ensayo. Por ejemplo, Skaare et al. 51 encontraron que la disolución de TCS en polietileno glicol (comúnmente encontrado en los dentífricos y enjuagues bucales) debilitada efectos anti-bacterianos y anti-placa en las mujeres sanas, mientras que la disolución en aceites causó una pérdida completa de la función. Por lo tanto, la capacidad de los diferentes disolventes para modular tóxico y drogas, incluyendo TCS, efectos deben ser considerados en el diseño de ensayo. Uso de aceites o aditivos de sabor puede interferir con los efectos de TCS en diversos productos 50,51. En un esfuerzo por eliminar la necesidad de utilizar disolventes orgánicos, hemos mejorado sobre nuestro método para disolver TCS 2 mediante la eliminación de la utilización de un sol orgánicodesahogarse. En el presente protocolo, disolvemos gránulos TCS directamente en tampón acuoso con el calor (≤ 50 ° C), a continuación, compruebe que la concentración de esta población TCS por espectrofotometría UV-Vis. Estas mejoras son posibles porque TCS es soluble en agua hasta 40 mM ( <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ) y se ha demostrado para resistir la degradación cuando se calienta a 50 ° C ( <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http:// / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ) 56,57. También tenemos el beneficio añadido de espectrofotometría UV-Vis, como TCS también se conoce para absorber fuertemente a 280 nm 58 con un coeficiente de extinción molar de 4200 L / mol / cm 12. Este protocolo proporciona una manera sencilla, pero eficaz para disolver gránulos de TCS en un tampón sin la ayuda de un disolvente orgánico, incluyendo bajo costo y verificación rápidade la concentración, y describe un potente microplaca de ensayo fluorescente para el seguimiento de los efectos químicos sobre la desgranulación de los mastocitos.

<table><tbody><tr><td> RBL-2H3 Cells </td><td>ATCC</td><td>CRL-2256</td><td> Las células que usamos fueron un regalo, pero también están disponibles en ATCC </td></tr><tr><td> Triclosan/Irgasan </td><td>Sigma</td><td>72779 CAS# 3380-34-5</td><td> Debe almacenarse en un ambiente de baja humedad </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td>Gibco</td><td>25300-054 CAS# 3380-34-5</td><td> </td></tr><tr><td> EMEM </td><td>Lonza</td><td>12-611F</td><td> </td></tr><tr><td> Suero fetal bovino </td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td> </td></tr><tr><td> Gentamycin Sulfato </td><td>Lonza Biological Sciences</td><td>17-518</td><td> </td></tr><tr><td> Albúmina, suero bovino </td><td>Calbiochem</td><td>12659 CAS# 9048-46-8 </td><td> </td></tr><tr><td> Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; solución al 10%) </td><td>Pierce</td><td>28314 CAS# 9002-93-1</td><td> </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>J.T Baker</td><td>4153-01 CAS# 75277-39-3</td><td> </td></tr><tr><td> Cloruro de magnesio </td><td>VWR</td><<td>p align="center">BDH0244-500G CAS# 7791-18-6</td><td> </td></tr><tr><td> D-(+)-Glucosa </td><td>Biomedicals</td><td>152527 CAS# 50-99-7</td><td> </td></tr><tr><td> Cristal de cloruro de potasio </td><td>J.T Baker</td><td>3046-01 CAS# 7447-40-7</td><td> </td></tr><tr><td> Dicidato de cloruro de calcio </td><td>Acros Organics</td><td>207780010 CAS# 10035-04-8</td><td> </td></tr><tr><td> Glycine </td><td>Sigma</td><td>G8898 CAS# 56-40-6</td><td> </td></tr><tr><td> 4-Methylumbelliferyl-N-acetil-&beta;-D-glucosaminide (4-MU) </td><td>EMD Biosciences</td><td>474502-250MG CAS # 37067-30-4</td><td> Envolver en papel de aluminio &ndash; es sensible a la luz </td></tr><tr><td> Anti-DNP Mouse IgE </td><td>Sigma</td><td>D8406</td><td> El reactivo tiene una concentración de 1 mg/ml. Alícuota 25 y micro; l&nbsp; del reactivo en tubos de microcentrífuga separados y Parafilm. Almacene las alícuotas a -20 &deg; C que no se están utilizando y almacene la alícuota que se está utilizando a 2-8 &deg; C por no más de 1 mes. </td></tr><tr><td> DNP-BSA </td><td>Regalo del Dr. David Holowka y la Dra. Barbara Baird, Universidad de Cornell</td><td></td><td> Sugerir: life technologies DNP-BSA catalog# <a href="http://www.invitrogen.com/search/global/miniPDPAction.action?query=A23018">A23018</a> </td></tr><tr><td> Ionóforo de calcio A23187 </td><td>Sigma</td><td>C75-22-1mg</td><td> Ionophore se hizo a partir de un polvo añadiendo 400 &micro; l&nbsp; de DMSO 100% fresco en el vial de ionóforo y se mantiene a -20 & deg; C Nota: hemos utilizado el ionóforo después de su fecha de caducidad de 3 meses con éxito </td></tr><tr><td> DMSO </td><td>Sigma</td><td>D2650 CAS# 67-68-5</td><td> </td></tr><tr><td> Ácido acético </td><td>VWR</td><td>BDH3094-2 CAS# 64-19-7</td><td> </td></tr><tr><td> Carbonato de sodio anhidro </td><td>Sigma</td><td>222321 CAS# 497-19-8</td><td> </td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td>Sigma</td><td>71376 CAS# 7647-14-5</td><td> </td></tr><tr><td> Ácido clorhídrico </td><td>VWR</td><td>BDH3026 CAS# 7647-01-0</td><td> </td></tr><tr><td> Buffer de referencia, pH 7 </td><td>VWR</td><<td>p align="center">BDH5046</td><td> </td></tr><tr><td> Tampón de referencia, pH 10 </td><td>VWR</td><<td>p align="center">BDH5072</td><td> </td></tr><tr><td> Tampón de referencia, pH 4 </td><td>VWR</td><<td>p align="center">BDH5018</td><td> </td></tr><tr><td> electrodo de pH solución de almacenamiento </td><td>VWR</td><<td>p align="center">14002-828</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">Equipment:</td></tr><tr><td> DU 7500 Spectrophotometer </td><td>Beckmann</td><td>Ya no se vende</td><td> </td></tr><tr><td> Lector de placas Synergy 2 Utiliza el software de recopilación y análisis de datos de microplacas Gen5 </td><td>BioTek</td><td>Module S</td><td> </tr><tr><td> > Hematocytometer </td><td>Hausser Scientific</td><td> 3110</td><td> </tr><tr><td> > 7 x&nbsp; 7 CER HOT/STIR 120 V Combinación de placa calefactora/placa de agitación magnética </td><td>VWR</td><<td>p align="center">97042-634</td><td> </td></tr><tr><td> Centrífuga </td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td> </td></tr><tr><td> Baño de agua para cultivo de tejidos </td><td>VWR</td><<td>p align="center">Model# 89032-206</td><td> </td></tr><tr><td> Tissue Culture cabina de seguridad biológica SafeGARD (campana TC) </td><td>The Baker Company</td><td>Model# SG403A-HE</td><td> </td></tr><tr><td> Incubadora de cultivo de tejidos </td><td>ThermoScientific</td><td>Model# 3598</td><td> </tr><tr><td> > Pipetman </td><td>VWR</td><<td>p align="center"></td><td> Rango: P2-P1000 </td></tr><tr><td> Balance </td><td>Mettler Toledo</td><td>Model# AG204</td><td> </td></tr><tr><td> medidor de pH </td><td>Symphony/VWR</td><td>Model# SB70P</td><td> </td></tr><tr><td> Pipet-Aid </td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-100</td><td> </td></tr><tr><td> Dispensador Combitip </td><td>Eppendorf</td><td>4981 000.019</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">Recetas:</td></tr><tr><td> Tampón de acetato, pH 4.4 </td><td>Prepare ácido acético 0.12 M y ajuste a pH 4.4 con 10 N NaOH. Se trata de 5,3 ml de ácido acético glacial en 1 L de agua MilliQ: (1 L)*(0,12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1,37 g) = 5,3 ml porque la densidad del glacial es de 1,37 g/ml</td><td>Filtro estéril en frasco de vidrio esterilizado en autoclave</td><td></td></tr><tr><td> Sustrato (4-MU) </td><td>Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Almacenar en -20&deg; C Stock: 0,12 M en DMSO (46 mg en 1 ml DMSO), tibio a 37 °C; C, vórtice, sonicatar 10 min. en un sonicador en baño de agua con agua tibia, vórtice de nuevo</td><td>Para cada experimento, haga una solución fresca de sustrato en tampón de acetato (dilución 100x), para una concentración final de 1,2 mM en tampón de acetato</td><td></td></tr><tr><td> Tampón de carbonato de glicina, pH 10 </td><td>26,7 g glicina 47,1 g de carbonato de sodio anhidro Añadir agua desionizada durante 1 L, y ajuste el pH a 10</td><td>Filtro estéril en frasco de vidrio esterilizado en autoclave</td><td></td></tr><tr><td> Tyrodes (2 L), pH 7.4 </td><td>135 mM NaCl: 15.78 g (o 270 ml de 1 M) 5 mM KCl: 10 ml de stock 1.8 mM CaCl2: 7,20 ml de culto de 0,5 M 1 mM de MgCl2: 4,00 ml de 0,5 M de culata 5,6 mM de glucosa: 2,02 g (11,2 ml de 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml de 1 M de caldo Utilizando un pH concentrado de HCl de ~9,7-7,4</td><td>Filtro estéril en frasco de vidrio esterilizado en autoclave</td><td></td></tr><tr><td> RBL Cell Media </td><td>Descongelación del suero fetal bovino (FBS, almacenado a -20 &deg; C) durante unas 4 horas en 37 &deg; C baño de agua Siga la técnica estéril estándar Obtenga 1 L de medio esencial mínimo (MEM) con L-glutamina (con Earle' Vierta un poco de MEM para obtener 800 ml de MEM, agregue 200 ml de FBS tibio Agregue 1 ml de antibiótico de sulfato de gentamicina a 1 L de medio con una pipeta estéril Utilice únicamente frascos de medios que hayan sido esterilizados en autoclave y marcados únicamente para uso en cultivos celulares.</td><td>Filtro estéril (0.2 mm) en frasco de vidrio esterilizado en autoclave</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Material plástico utilizado:</td></tr><tr><td> 200 &micro; l&nbsp; Puntas de pipeta estériles desechables con graduaciones en 96 rack </td><td>VWR</td><<td>p align="center">53509-009</td><td> polipropileno </td></tr><tr><td> 1.000 &micro; l&nbsp; Puntas de pipeta de aerosol estériles con HighRecovery </td><td>VWR</td><<td>p align="center">89003-420</td><td> polietileno </td></tr><tr><td> 10 &micro; l&nbsp; micro punta de baja ligar estéril </td><td>VWR</td><<td>p align="center">14217-704</td><td> polipropileno </td></tr><tr><td> Desechables/cónicos Tubos de microcentrífuga para alta fuerza G </td><td>VWR</td><<td>p align="center">20170-038</td><td> polipropileno </td></tr><tr><td> Desechable/graduado/cónico/estéril 50 ml&nbsp; tubos de centrífuga con tapones de rosca </td><td>VWR</td><<td>p align="center">21008-178</td><td> polipropileno </td></tr><tr><td> Desechable/graduado/cónico/estéril 15 ml&nbsp; tubos de centrífuga con tapones de rosca </td><td>VWR</td><<td>p align="center">21008-103</td><td> polipropileno </td></tr><tr><td> CELLSTAR Matraz T-25 tratado con cultivo de tejidos con tapón de filtro </td><td>Greiner Bio One</td><td>690175</td><td> poliestireno </td></tr><tr><td> CELLSTAR Matraz T-75 tratado con cultivo de tejidos con tapón de filtro </td><td>Greiner Bio One</td><td>658175</td><td> poliestireno </td></tr><tr><td> CELLSTAR 10 ml&nbsp; Pipeta serológica envuelta en papel/plástico </td><td>Greiner Bio One</td><td>607180</td><td> poliestireno </td></tr><tr><td> CELLSTAR 2 ml&nbsp; Pipeta serológica envuelta en papel/plástico </td><td>Greiner Bio One</td><td>710180</td><td> poliestireno </td></tr><tr><td> CELLSTAR 5 ml&nbsp; Pipeta serológica envuelta en papel/plástico </td><td>Greiner Bio One</td><td>606180</td><td> poliestireno </td></tr><tr><td> CELLSTAR 25 ml&nbsp; Papel /Pipeta serológica envuelta en plástico </td><td>Greiner Bio One</td><td>760180</td><td> poliestireno </td></tr><tr><td> 1 cm cubetas </td><td>N/A</td><td>N/A</td><td> poliestireno </td></tr><tr><td> CELLSTAR, Microplaca de 96W, Tratada con Cultivo de Tejidos, Negro, con Tapa Placa de 96 pocillos </td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td> poliestireno </td></tr><tr><td> Combitips </td><td>Eppendorf</td><td> 022266501</td><td> Polipropileno/ polietileno </td></tr></tbody></table>

un ensayo de microplacas para evaluar los efectos químicos sobre rbl-2h3 mástil degranulación: efectos de triclosan y sin uso de un disolvente orgánico

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Los mastocitos juegan un papel importante en la enfermedad alérgica y la defensa inmune contra parásitos. Una vez activado (por ejemplo, por un alergeno), se desgranulan, un proceso que resulta en la exocitosis de mediadores alérgicos. La modulación de la degranulación de los mastocitos por las drogas y las sustancias tóxicas pueden tener efectos positivos o negativos sobre la salud humana. La función de los mastocitos ha sido diseccionado en detalle con el uso de mastocitos de rata leucémicas basófilas (RBL-2H3), un modelo ampliamente aceptado de mastocitos de la mucosa humanos 3-5. Mástil componente de células granulares y el mediador alérgica β-hexosaminidasa, que se libera linealmente en tándem con histamina de los mastocitos 6, se pueden medir fácilmente y de forma fiable a través de la reacción con un sustrato fluorogénico, dando la intensidad de fluorescencia medible en una microplaca de ensayo que es susceptible de alto rendimiento estudios 1. Publicado originalmente por Naal et. Al 1, hemos adaptado este ensayo degranulación para la detección of drogas y sustancias tóxicas y demostrar su uso aquí. El triclosán es un agente antibacteriano de amplio espectro que está presente en muchos productos de consumo y se ha encontrado para ser una ayuda terapéutica en la enfermedad alérgica de la piel humana 7-11, aunque se desconoce el mecanismo de este efecto. Aquí se demuestra un ensayo para el efecto de triclosán en la degranulación de los mastocitos. Recientemente, hemos mostrado que el triclosán afecta en gran medida la función de los mastocitos 2. En un esfuerzo por evitar el uso de un disolvente orgánico, el triclosán se disuelve directamente en tampón acuoso con calor y agitación, y la concentración resultante se confirmó usando espectrofotometría UV-Vis (utilizando ε 280 = 4.200 L / M / cm) 12. Este protocolo tiene el potencial para ser utilizado con una variedad de productos químicos para determinar sus efectos sobre la desgranulación de los mastocitos, y en términos más generales, su potencial alérgico.

Cuando se calienta a 50 ° C durante 90 min, el espectro de absorbancia de UV-Vis para TCS produce una fuerte curva, suave entre ~ 260 y 300 nm, con un pico a 280 nm, como se muestra en la Figura 1. Espectrofotometría UV-Vis es, por lo tanto, una herramienta importante que puede ser utilizado para calcular la concentración, ya que el coeficiente de absorción molar publicado a 280 nm es 4200 L / mol / cm 12. Hemos encontrado que los ECT no se caiga fuera de la solución durante el marco de tiempo de todo el experime...

Degranulación de los mastocitos, la liberación de mediadores alérgicos, es importante en la alergia, el asma, y ​​la defensa parásito. Aquí demostramos técnicas 1 para evaluar los efectos de las drogas y las sustancias tóxicas en la degranulación, la metodología utilizada recientemente para exhibir el poderoso efecto inhibidor del agente antibacteriano triclosán 2.

Un ensayo de microplacas para evaluar los efectos químicos sobre RBL-2H3 mástil degranulación: Efectos de Triclosan y sin uso de un disolvente orgánico

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

El objetivo general del siguiente experimento es utilizar un ensayo de microplaca de fluorescencia para evaluar los efectos químicos en la degranulación de mastocitos. En este protocolo, se demuestran los efectos inhibidores del agente antimicrobiano triclosán sin el uso de un solvente orgánico. Esto se logra colocando primero los mastocitos en una placa de 96 pocillos para permitir que se adhieran durante la noche y preparando el triclosán en una solución acuosa sin el uso de solventes orgánicos mediante calentamiento.A continuación, la concentración de la solución de Trian se determina rápidamente mediante espectroscopia ultravioleta visible. Como segundo paso, las células se estimulan con antígeno de corte IgE o un ionóforo de calcio en presencia o ausencia de triano, lo que provocará la liberación del marcador de degranulación de mastocitos beta hexosaminidasa en el sobrenadante. La liberación de beta hexosaminidasa en el sobrenadante celular se cuantifica utilizando un sustrato de beta hexosaminidasa cuyo producto fluorescente se cuantifica en un lector de microplacas.Con el fin de medir el efecto del triclosán u otros productos problema en la degranulación de mastocitos, se o

a-microplate-assay-to-assess-chemical-effects-on-rbl-2h3-mast-cell

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, describimos un método in vitro para evaluar el potencial alérgico de un antígeno para inducir la degranulación de basófilos. β-hexosaminidasa se utiliza como índice de liberación de mediador químico, y la actividad enzimática de la β-hexosaminidasa se mide utilizando un sustrato fluorogénico.

Ensayo de liberación de enzimas mediadoras humanizadas: un método inmunoquímico para detectar el potencial alérgico del antígeno de prueba mediante el seguimiento de la respuesta de degranulación de basófilos in vitro

Este video muestra un ensayo colorimétrico para determinar la actividad de degranulación de los mastocitos. La enzima liberada por los mastocitos hidroliza el sustrato y produce un producto coloreado. La actividad de degranulación de los mastocitos se midió como el porcentaje de liberación de enzimas fuera de la célula normalizado con el contenido total de enzimas en la célula.

Ensayo de degranulación de mastocitos para estudiar el efecto de un producto químico objetivo

Este video ilustra un ensayo celular que involucra células de glioblastoma que expresan receptores de quimiocinas CXCR4. El ensayo emplea un tinte sensible al calcio para medir los cambios de fluorescencia tras la interacción del agente, lo que ofrece información sobre la dinámica de la señalización celular.

Un ensayo celular para la identificación de agentes que interactúan con CXCR4

Este video muestra un ensayo para monitorear la activación de neutrófilos y la exocitosis de gránulos a través de un ensayo de degranulación. Al ser activados por compuestos proinflamatorios, los gránulos citoplasmáticos dentro de los neutrófilos que contienen gelatinasa se fusionan con la membrana celular, descargando su carga. La presencia de gelatinasa en el sobrenadante se evalúa mediante la hidrólisis de un sustrato de gelatina conjugado con fluoróforos, lo que confirma la activación y...

Un ensayo de degranulación para controlar la activación de neutrófilos y la liberación de gelatinasa

La investigación de la migración temprana de células endoteliales (EEC) es importante para comprender la fisiopatología de ciertas enfermedades y para identificar potencialmente nuevas estrategias para la intervención terapéutica. El siguiente protocolo describe las técnicas para evaluar la migración celular que han sido adaptadas para la investigación de la EEC.

Evaluación de la migración de células endoteliales después de la exposición a sustancias químicas tóxicas

Aquí, presentamos protocolos para cribar y caracterizar rápidamente la actividad antimicrobiana de las enzimas. El ensayo de difusión de microportaobjetos y el ensayo de liberación de colorante utilizan sustratos bacterianos objetivo para la evaluación cualitativa y cuantitativa de la actividad enzimática.

Los ensayos cualitativos y cuantitativos para la detección y caracterización de proteínas de antimicrobianos

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y cultivar células de mástil peritoneales murinas. También describimos dos protocolos para su caracterización funcional: una proyección de imagen fluorescente de la concentración de Ca libre2 + intracelular y una prueba de degranulación basado en la cuantificación colorimétrica de la β-hexosaminidasa lanzado.

Aislamiento de mastocitos de peritoneo derivado y su caracterización funcional con Ca2 +-proyección de imagen y pruebas de degranulación

Hemos desarrollado un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para sondear el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes. Este análisis es compatible con citometría de flujo, inmunotinción y microscopía de fuerza de tracción, lo que permite mediciones cuantitativas de las interacciones biomecánicas entre las células y su matriz extracelular, las bacterias patógenas.

Un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para estudiar el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes

Aquí presentamos el ensayo de liberación de mediadores, utilizando una línea celular de leucemia basofílica de rata transfectada con el receptor de IgE humano, para simular la degranulación de células efectoras típicamente observadas en reacciones alérgicas tipo 1. Este método investiga la actividad biológica de los alérgenos de una manera altamente sensible, reproducible y personalizable.

Ensayo de liberación de mediadores humanizados como lectura para la potencia de los alérgenos

Aquí, presentamos un protocolo mejorado de ensayo de quimiotaxis. El objetivo de este protocolo es reducir los pasos y los costos de los métodos tradicionales de quimiotaxis bacteriana y servir como un recurso valioso para comprender las interacciones planta-microbio.

Un ensayo de quimiotaxis mejorado para la identificación rápida de quimioatrayentes rizobacterianos en exudados radiculares

Aprende a evaluar la degranulación de mastocitos RBL-2H3 mediante un ensayo de microplacas sin disolventes orgánicos. Este método permite cuantificar los efectos inhibidores del triclosan en respuestas alérgicas.

Un ensayo de microplacas para evaluar los efectos químicos sobre RBL-2H3 mástil degranulación: Efectos de Triclosan y sin uso de un disolvente orgánico (Video) | JoVE Journal

Un ensayo de microplacas para evaluar los efectos químicos sobre RBL-2H3 mástil degranulación: Efectos de Triclosan y sin uso de un disolvente orgánico

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