Name: Cuantitativo In vitro Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Aprende a cuantificar la adhesión de neutrófilos humanos a células endoteliales microvasculares activadas en condiciones estáticas mediante espectrofluorimetría. Este ensayo in vitro permite evaluar la respuesta inflamatoria.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Anestesia y Cuidados perioperatorios UCSF.

1. Revestimiento y mantenimiento de las células endoteliales microvasculares <ol><li> Descongele y hacer crecer las células endoteliales microvasculares de acuerdo a los fabricantes suministran instrucciones. En este protocolo, las células fueron cultivadas en medio EGM-2 MV (Lonza), y se recomienda que todos los experimentos se llevan a cabo dentro de dos semanas de descongelación para minimizar cualquier variación debida al número de pases. Nuestros experimentos con HMVEC-pulmón se llevan a cabo entre los pasos 4 a 9. </li><li> Día 1: Cuando las células alcanzan 80-90% de confluencia, trypsinize y resuspender en 120.000 células por ml. Placa de 36.000 células (0,3 ml) por pocillo en 48 pocillos, placa de cultivo tisular de poliestireno (s). Incluir pozos de HMVEC que no se incubaron con neutrófilos con el fin de obtener una lectura de fluorescencia de fondo. A menos que el uso de placas de 48 pocillos diseñadas específicamente para ensayos de fluorescencia, filas o columnas alternas será minimizar cualquier contaminación lumínica de los pozos vecinos. NOTA: Los pozos pueden ser pre-recubiertas con poli-Lysine, colágeno o fibronectina. </li><li> Día 2: Agregar medio fresco. </li><li> Día 3: Por microscopía de contraste de fase, confirman las células están sanos (es decir, la apariencia &quot;adoquines&quot; y poco restos de células), y son 100% confluentes (Figura 1). Si las células no son 100% confluentes, cambiar los medios de comunicación todos los días hasta que estén listos. </li><li> Una vez que las monocapas HMVEC están listos para el tratamiento, lavar las células una vez con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y añadir 0,3 ml de EGM-2 MV medios frescos o medios que contienen agonista inflamatoria a los pocillos apropiados. En este protocolo la HMVEC-pulmón fueron tratados con TNF [100 ng / ml] (PeproTech, Nueva Jersey) durante 3 horas ya que este es un activador bien descrito de ECs 21. NOTA: Se recomienda que el tiempo de su experimento para que sus células HMVEC activados (Paso 4.1) y calceína AM neutrófilos marcados (Paso 3.5) están listos para su uso al mismo tiempo. Nos lleva aproximadamente 2,5 horas para aislar y etiquetar neutrophils. </li></ol> 2. Aislamiento de neutrófilos mediante Polymorphprep <ol><li> Aislar los neutrófilos como se ha descrito previamente 22, o con una solución de gradiente de densidad confeccionada para aislar los granulocitos polimorfonucleares de la sangre entera. El empleo de Polymorphprep siguiendo el protocolo por Nuzzi et.al. 2007 resultados de los rendimientos de aproximadamente 2-3 x 10 6 neutrófilos por ml de sangre entera 23. NOTA: Para evitar la lisis de los eritrocitos excesiva, una sedimentación de dextrano para eliminar las células rojas de la sangre puede llevar a cabo antes de la centrifugación en gradiente de densidad 24. </li><li> Poner la solución en gradiente de densidad Polymorphprep a RT. </li><li> Recoger 30 ml de sangre completa de un voluntario humano sano en presencia de un anticoagulante tal como heparina, citrato o EDTA. La sangre se debe utilizar dentro de 2 horas, y se mantiene entre los 18-22 ° C. </li><li> Capa 5 ml de sangre entera sobre 5 ml de la solución de gradiente de densidad en un tubo cónico de 15 ml (Figura 2A). Evite alterar volúmenes de sangre y la solución de gradiente de densidad, ya que podría cambiar las condiciones de centrifugación posteriores. </li><li> Centrifugar a 450 xg durante 30 min a 18-22 ° C. Asegúrese de que para acelerar lentamente arriba y abajo de la centrífuga (es decir, desactivar el freno de centrífuga), y el equilibrio de los tubos así para evitar vibraciones para ayudar a reducir la activación de los neutrófilos y evitar la mezcla de las capas. Tiempos de centrifugación más largos o más alta fuerza centrífuga se traducirá en la capa de leucocitos inferior, que contiene los neutrófilos, a migrar más abajo hacia a las células rojas de la sangre sedimentadas. </li><li> Aspirar el plasma y la banda de leucocitos superior que contiene las PBMC para evitar la contaminación de la capa que contiene los neutrófilos (Figura 2B). </li><li> Con una pipeta serológica 1-2 ml para eliminar la capa inferior que contiene los leucocitos neutrófilos. Se combinan las capas de neutrófilos en 30 ml de PBS (sin Ca 2 + y Mg 2 +) en un 50 mltubo cónico. </li><li> Llevar el volumen hasta 50 ml con PBS (sin Ca 2 + y Mg 2 +) y se centrifuga a 450 g durante 10 min a 18-22 ° C. </li></ol> Nota: Los pasos 2.9 y 2.10 son opcionales, pero altamente recomendable. <ol start="9"><li> Aspirar el sobrenadante. Resuspender los neutrófilos en 8 ml de agua estéril durante 30 segundos para lisar las células rojas de la sangre, añadir inmediatamente la suspensión de células a 2 ml de 5x PBS (sin Ca 2 + y Mg 2 +) y mezclar suavemente con la mano. No incubar las células en agua durante más de 30 segundos desde la muerte de neutrófilos significativa puede ocurrir. </li><li> Centrifugar a 250 xg durante 5 min a 18-22 ° C. </li><li> Se lavan las células una vez con 10 ml de PBS (sin Ca 2 + y Mg 2 +) y centrifuga de nuevo a 250 xg durante 5 min a 18-22 ° C. </li><li> Resuspender los neutrófilos en 10 ml de medio RPMI-1640 (sin rojo fenol) y contar las células vivas utilizando el azul de tripanoteñir método de exclusión. Evitar períodos prolongados de densidades celulares superiores a 5 x 10 6 por ml ya que esto puede resultar en la activación de los neutrófilos. </li></ol> 3. Neutrófilos Etiquetado con calceína AM <ol><li> 6 x 10 5 neutrófilos se utilizan por pocillo de una placa de 48 pocillos. </li><li> Después de contar, transferir las células resuspendidas a un tubo cónico de 50 ml y diluir los neutrófilos a 2-4 x 10 6 células por ml con rojo fenol libre de RPMI-1640. </li><li> Añadir calceína AM solución madre de 3 m (es decir 2,98 l de calceína AM stock (1 mg / ml) por ml de medio) y mezclar bien accionando suavemente el tubo. Mayor que 5 mM calceína AM dará lugar a fugas de los neutrófilos Nota:. No fluorescente calceína AM se escinde dentro de las células por las esterasas endógenas para producir la molécula altamente fluorescente calceína (es decir, las células muertas no fluorescencia). </li><li> Cubra el tubo con papel de aluminio e incubar for 30 min a 37 ° C en la oscuridad Nota:. tiempos de incubación más largos puede resultar en más calceína ser liberado de los neutrófilos en el transcurso del ensayo de adhesión. </li><li> Centrifugar a 450 xg durante 5 min a 18-22 ° C, y lavar los neutrófilos 2x con 10 ml de medio RPMI-1640 (sin rojo de fenol; pre-calentado a 37 ° C). Después de resuspender las células para el segundo lavado, primero pasar a los neutrófilos a través de un filtro estéril 40 mM para eliminar grumos y, a continuación centrifugar una vez más a 450 xg durante 5 min a 18-22 ° C. </li><li> Resuspender los neutrófilos en medio RPMI 1640 (sin rojo de fenol; pre-calentado a 37 ° C) a 2 x 10 6 neutrófilos por ml. </li></ol> 4. Ensayo de unión de neutrófilos <ol><li> Se lavan las monocapas HMVEC 3x con 0,5 ml de esterilizada por filtración (0,22 micras) RPMI 1640 (sin rojo fenol) que contiene 3% de BSA por pocillo. </li><li> Aspirar los medios de comunicación y añadir 6 x 10 5 neutrófilos marcados con calceína-(0,3 ml de suspensión de células), O 0,3 ml de medio RPMI 1640 (sin rojo fenol) sin neutrófilos, a los pocillos apropiados de la placa de 48 pocillos Nota:. Este es el equivalente de 8 x 10 5 neutrófilos por cm 2. </li><li> Incubar durante 20 min en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Total de neutrófilos fluorescencia (PRE lavado): Mide la intensidad de fluorescencia de cada pocillo con una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm (filtro establecido fluoresceína) en una FLUOstar, o equivalente, espectrofotómetro. Realice este paso justo antes del punto final de incubación Nota: En este protocolo, calceína de excitación y detección de la luz emitida se realizaron a partir de la parte superior de los pozos no cubierto, sin embargo, ambos también se puede realizar desde el fondo de los pocillos.. </li><li> Lave los pocillos que contienen monocapas HMVEC y neutrófilos 5x con 0,5 ml por pocillo de PBS (w / Ca 2 + y Mg 2 +). Retire el papel y lavadosinvirtiendo la placa, y palmaditas suavemente sobre toallas de papel para eliminar el líquido restante. </li><li> Añadir nuevo 0,3 ml de RPMI 1640 (sin rojo fenol) por pocillo. </li><li> Adherente de neutrófilos fluorescencia (POST lavado): Medir la intensidad de fluorescencia de cada pocillo como en el paso 4.4. </li><li> Determinar el porcentaje de cumplimiento y la adherencia relativa por así: </li></ol> Nota: En esta etapa, las imágenes de los neutrófilos marcados con calceína se puede conseguir mediante el uso de un microscopio capaz de fluorescencia equipado con filtros de fluoresceína estándar. Las imágenes en la Figura 4 se obtuvieron en una Olympus IX51 microscopio invertido equipado con una cámara 2000R Retiga (Q Imaging) utilizando Q-Capture Pro7 software (Q Imaging).

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Collins, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+endothelial+cell+adhesion+molecules%3A+NF-kappa+B+and+cytokine-inducible+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal+%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers.</a> FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+physiological+roles+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454, 428-435 (2008).</li>
<li>Chen, G. Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation%3A+sensing+and+reacting+to+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li>
<li>Middleton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcytosis+and+surface+presentation+of+IL-8+by+venular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells.</a> Cell. 91, 385-395 (1997).</li>
<li>Rot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+binding+of+NAP-1%2FIL-8%3A+role+in+neutrophil+emigration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Today%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration.</a> Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).</li>
<li>Detmers, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-activating+protein+1%2Finterleukin+8+stimulates+the+binding+activity+of+the+leukocyte+adhesion+receptor+CD11b%2FCD18+on+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils.</a> J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).</li>
<li>Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+integrin+activation+by+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte integrin activation by chemokines.</a> Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).</li>
<li>Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+tethering+on+E-selectin+activates+beta+2+integrin+binding+to+ICAM-1+through+a+mitogen-activated+protein+kinase+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway.</a> J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).</li>
<li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+consequences+of+neutrophil+interaction+with+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).</li>
<li>Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+leukocyte+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of leukocyte transendothelial migration.</a> Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Kumar, V., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+Cinderella+of+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: Cinderella of innate immune system.</a> International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).</li>
<li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+danger+signals+guide+neutrophils+to+sites+of+sterile+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation.</a> Science. 330, 362-366 (2010).</li>
<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li>
<li>Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+neutrophil-mediated+monocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment.</a> Blood. 114, 4613-4623 (2009).</li>
<li>Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+endothelial+TLR2+by+bacterial+lipoprotein+upregulates+proteins+specific+for+the+neutrophil+response%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response.</a> Innate Immun. 18, 602-616 (2012).</li>
<li>Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22The+Handbook%3A+A+Guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labelling+Technologies%22">The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies</a>. , 10, (2005).</li>
<li>Shin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lipoprotein+TLR2+agonists+broadly+modulate+endothelial+function+and+coagulation+pathways+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo.</a> J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).</li>
<li>Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK5+protein+promotes%2C+whereas+MEK1+protein+differentially+regulates%2C+the+Toll-like+receptor+2+protein-dependent+activation+of+human+endothelial+cells+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes.</a> J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).</li>
<li>Pober, J. S., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+functions+of+endothelial+cells+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evolving functions of endothelial cells in inflammation.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745(2008).</li>
<li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of neutrophil chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).</li>
<li>Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+to+detect+nuclear+factor+activation+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (74), e50410(2013).</li>
<li>Kuma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BIRB796+inhibits+all+p38+MAPK+isoforms+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).</li>
<li>Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+production+and+E-selectin+expression+in+activated+endothelial+cells+are+inhibited+by+p38+MAPK+%28mitogen+activated+protein+kinase%29+inhibitor+RWJ+67657%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657.</a> International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).</li>
<li>Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+polymorphonuclear+cells+to+human+endothelial+cells.+Adhesion-molecule-dependent%2C+and+Fc+receptor-mediated+adhesion-molecule-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms.</a> Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).</li>
<li>Akeson, A. L., Woods, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorometric+assay+for+the+quantitation+of+cell+adherence+to+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells.</a> Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).</li>
<li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).</li>
<li>De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescent+dyes+in+the+determination+of+adherence+of+human+leucocytes+to+endothelial+cells+and+the+effect+of+fluorochromes+on+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function.</a> Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).</li>
<li>Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+1+acts+on+cultured+human+vascular+endothelium+to+increase+the+adhesion+of+polymorphonuclear+leukocytes%2C+monocytes%2C+and+related+leukocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines.</a> The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).</li>
<li>Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+vascular+endothelial+cells+acquire+adhesiveness+for+neutrophils+after+stimulation+with+interleukin+1%2C+endotoxin%2C+and+tumor-promoting+phorbol+diesters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters.</a> J. Immunol. 136, 649-654 (1986).</li>
<li>Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+the+adherence+of+neutrophils+to+umbilical+vein+endothelium+by+human+recombinant+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).</li>
<li>Braut-Boucher, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-isotopic%2C+highly+sensitive%2C+fluorimetric%2C+cell-cell+adhesion+microplate+assay+using+calcein+AM-labeled+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).</li>
<li>Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelium%3A+physiological+functions+and+role+in+microcirculatory+failure+during+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis.</a> Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).</li>
<li>Andonegui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium-derived+Toll-like+receptor-4+is+the+key+molecule+in+LPS-induced+neutrophil+sequestration+into+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).</li>
<li>Sharma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+endothelial+cell+platelet-activating+factor+production+and+inflammatory+cell+adherence+are+increased+in+response+to+cigarette+smoke+component+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).</li>
<li>Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathogenic+roles+of+microvasculature+in+inflammatory+bowel+disease%3A+a+Jack+of+all+trades%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades.</a> The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).</li>
<li>Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Wegener%26%2339%3Bs+granulomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+de+Medecine+Interne%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Wegener&#39;s granulomatosis.</a> Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+inflammatory+cell+involvement+in+brain+arteriovenous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations.</a> Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).</li>
<li>Martens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+which+bind+to+E-selectin+and+block+neutrophil+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion.</a> J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).</li>
</ol>

Los autores tienen nada que revelar.

Los pasos más importantes para el éxito de neutrófilos / ensayo de adhesión celular endotelial microvascular son los siguientes: 1) El uso del número de paso bajo (&lt;9), células endoteliales sanas, 2) El mantenimiento de los neutrófilos aislados con una densidad baja (es decir, células &lt;5 x 10 6 / ml) y el uso de ellos en las dos horas de aislamiento, y 3) el lavado Fastidious de los neutrófilos calceína AM-etiquetados y el uso de los neutrófilos calceína AM-etiquetados de manera oportuna para m...

Dado que el endotelio vascular está en contacto directo con la sangre circulante, que tiene una ubicación única para iniciar una respuesta inflamatoria rápida durante la infección o lesión. Las células endoteliales (EC) receptores de reconocimiento de patrones expresas que reconocen una variedad de componentes bacterianos conservados y las moléculas de peligro, y los receptores para sistemas principales mediadores de la inflamación tales como TNFa. La activación de estos receptores induce ECs para secretar citoquinas (por ejemplo, IL-6, IL-8, CXCL1 y CCL2), y para upregulate moléculas de adhesión (por ejemplo, E / P-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) en su superficie celular 1 , 2. Estas moléculas de todo facilitar la localización de los leucocitos a los sitios de infección y la lesión con el fin de despejar el campo de los agentes infecciosos e iniciar la reparación del tejido 3,4. La respuesta de los neutrófilos a la infección implica una interacción bien coordinada entre el endotelio vascular y la respuesta los neutrófilos. Tras la activación CE, IL-8 se secreta y forma un gradiente intravascular en el endotelio que permite a los neutrófilos a la casa en el sitio de la infección o lesión 5,6. E / P-selectinas median la captura de neutrófilos y rodando a través de asociaciones relativamente débiles con glycomolecules en la superficie celular de neutrófilos. Estas interacciones, junto con la IL-8 la unión a sus receptores afines, facilitan la robusta, unión mediada por la integrina y la eventual detención de los neutrófilos sobre la superficie de la célula endotelial 7-10. Después de la detención, los neutrófilos pueden migrar fuera de la vasculatura a los sitios específicos de infección para eliminar directamente los patógenos, generar trampas extracelulares de neutrófilos para prevenir la propagación de los agentes patógenos, promover la cicatrización de heridas y liberar factores adicionales que reclutan otros leucocitos tales como monocitos, macrófagos y dendríticas 11-17 células. Se describe en el presente informe es un método in vitro para cuantificar la adhesión de neutrófilos a microVascular ECs después de la activación por el mediador inflamatorio TNF anfitrión. Este ensayo está diseñado para evaluar la activación de EC, y no los neutrófilos. Los neutrófilos humanos primarios son primero aislados utilizando separación por gradiente de densidad, y luego se marcan con calceína acetoximetilo (AM). Esterasas dentro de las células en vivo hidrolizan calceína AM a la molécula calceına altamente fluorescente con una excitación de 492-495 nm y de emisión de 513-516 nm 18. Los neutrófilos marcados con fluorescencia se incuban a continuación con monocapas CE, y los neutrófilos no adherentes se eliminan posteriormente. La fluorescencia de las restantes, neutrófilos enlazados a continuación, se mide utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia, y se calcula como un porcentaje del total de entrada de la fluorescencia de neutrófilos por pocillo. Este método tiene la ventaja adicional de que los neutrófilos calceína-marcado unido utilizados en espectrofotometría se pueden visualizar directamente mediante microscopía de fluorescencia para dar una más cualitativa lectura de CE de corriente alternavación. Puesto que este ensayo se lleva a cabo bajo condiciones estáticas, únicamente los eventos muy iniciales que se producen en la cascada de adhesión de neutrófilos serán evaluados. Esto se confirma en el informe utilizando anticuerpos bloqueantes E-selectina para mostrar que la adhesión de neutrófilos al pulmón humano TNF-tratada microvascular CE (HMVEC-pulmón) monocapas se reduce drásticamente cuando se interrumpe la interacción con E-selectina. Además de TNFa, hemos utilizado con éxito este ensayo para determinar la extensión de la vena activación CE umbilical humana (HUVEC) por el receptor de tipo Toll medio agonistas lipoproteína asociada a peptidoglicano (PAL), mureína lipoproteína (MLP) y Pam3Cys y activación HMVEC-Pulmón por Pam3Cys 19,20. Además, hemos utilizado con éxito este ensayo con inhibidores de la quinasa y después de RNAi mediada desmontables de superficie y proteínas citoplasmáticas en HMVEC-pulmón, lo que sugiere que esta metodología es compatible con una variedad de bioquímica y screeninensayos de 20 g. En resumen, este ensayo proporciona una fácil de usar, forma reproducible, más funcional para acceder a la medida de la activación de CE por mediadores inflamatorios in vitro.

<table><tbody><tr><td>HMVEC-Lung</td><td>Lonza</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td>Se puede sustituir con cualquier proveedor</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 48 pocillos</td><td>BD Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sin rojo de fenol)Instalación de</td> <td>cultivo celular UCSF</td><td>CCFAL001</td><td>Se puede sustituir con cualquier proveedor</td></tr><tr><td>D-PBS (sin Ca2+ y Mg2+ y rojo de fenol)</td><td>Instalación de cultivo celular de UCSF</td><td>CCFAL003</td><td>Puede ser sustituido por cualquier proveedor</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (sin rojo fenol)</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114683</td><td></td></tr><tr><td>calceína AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3099</td> <td>(0,995 mM) stock soln</td></tr><tr><td>Solución Azul de Tripán</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; Filtros M</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td>Puede ser sustituido por cualquier proveedor</td></tr><tr><td>FLUOstar OPTIMA Espectrofotómetro</td><td>BMG LABTECH</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantitativo<em&gt; in vitro</em&gt; ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al activado primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

El endotelio vascular juega un papel integral en la respuesta inflamatoria. Durante la fase aguda de la inflamación, las células endoteliales (EC) se activan por los mediadores de acogida o directamente por componentes microbianos conservados peligro o moléculas derivadas del huésped. ECs activados expresan citocinas, quimiocinas y moléculas de adhesión que movilizan, activan y retienen los leucocitos en el sitio de la infección o lesión. Los neutrófilos son las primeras en llegar leucocitos, y se adhieren al endotelio a través de una variedad de moléculas de adhesión presentes en las superficies de ambas células. Las principales funciones de los neutrófilos son para eliminar directamente las amenazas microbianas, promover el reclutamiento de otros leucocitos a través de la liberación de factores adicionales, e iniciar la reparación de la herida. Por lo tanto, su reclutamiento y el apego al endotelio es un paso crítico en la iniciación de la respuesta inflamatoria. En este reporte se describe un ensayo in vitro de la adhesión de neutrófilos mediantecalceína AM marcada con neutrófilos humanos primarios para cuantificar el grado de activación de las células endoteliales microvasculares en condiciones estáticas. Este método tiene la ventaja adicional de que las mismas muestras se cuantificaron por espectrofotometría de fluorescencia también se pueden visualizar directamente mediante microscopía de fluorescencia para una evaluación más cualitativa de la unión de neutrófilos.

Con el fin de obtener resultados fiables, reproducibles utilizando un ensayo de unión de neutrófilos, es esencial que la salud y la confluencia de las células endoteliales microvasculares son óptimas en el día del ensayo, como se ilustra con HMVEC-pulmón en la Figura 1. Además, es imperativo que el número de pase bajo microvascular AE se utiliza (es decir, menos de 9 pasajes), y, en consecuencia, se recomienda llevar a cabo todos los experimentos en las dos semanas siguientes a la descongelació...

Adherencia de los neutrófilos al endotelio activado en los sitios de infección es un componente integral de la respuesta inflamatoria del huésped. Se describe en el presente informe es un ensayo de unión de neutrófilos, que permite la<em&gt; In vitro</em&gt; Cuantificación de neutrófilos humana primaria unión a las células endoteliales activadas por los mediadores inflamatorios en condiciones estáticas.

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar el grado de activación inflamatoria de las células endoteliales microvasculares mediante la cuantificación del número relativo de neutrófilos que se adhieren a las células endoteliales in vitro en condiciones estáticas. Esto se logra primero tratando monocapas confluentes y sanas de células endoteliales microvasculares con el estímulo experimental deseado durante el segundo paso. Los neutrófilos de voluntarios humanos sanos se aíslan y luego se marcan con amilo de calcio.A continuación, se añaden los neutrófilos marcados a las células endoteliales y se deja que se adhieran durante 20 minutos, tiempo durante el cual se obtiene una medición previa al lavado mediante espectrogeometría de fluorescencia. En el paso final, se eliminan mediante lavado los neutrófilos no adheridos, tras lo cual se obtiene una medición posterior al lavado. En última instancia, puede determinarse el porcentaje y la adhesión relativa de los neutrófilos marcados con calcio a las monocapas de células endoteliales bajo cada condición de tratamiento.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología inflamatoria humana, ya que pu

quantitative-vitro-assay-to-measure-neutrophil-adhesion-to-activated

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un ensayo para medir la frecuencia de adhesión ligando del receptor de la cinética de interacción cuando ambas moléculas están anclados en la superficie de las células que interactúan se describe. Este ensayo mecánico basado en se ejemplifica mediante la micropipeta presurizado glóbulo rojo humano como sensor de adhesión y αLβ2 integrina y la molécula de adhesión intercelular-1 como interactúan los receptores y ligandos.

Ensayo de adherencia de frecuencia para In Situ El análisis de la cinética de unión de la Cruz-Las interacciones moleculares en la interfaz célula-célula

Este primer artículo se describe un procedimiento para aislar las células endoteliales humanas de las venas umbilicales y, a continuación se muestra cómo utilizar estas células para examinar la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo. Mediante el uso de una cámara de flujo de bajo volumen hecha de un polímero con las características ópticas de vidrio, en vivo de células de imagen fluorescente de poblaciones celulares raras también es posible.

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

En este video, demostramos un ensayo que utiliza microscopía de fluorescencia para detectar la adhesión de las células cancerosas a las trampas extracelulares de neutrófilos (NETs). En los pocillos de prueba, hay un aumento notable en el número de células cancerosas marcadas con fluorescencia que se adhieren a los NET, mientras que los pocillos tratados con DNasa exhiben una adhesión reducida de las células cancerosas a los NET.

Ensayo de adhesión in vitro para detectar la adherencia de las células cancerosas a las trampas extracelulares de neutrófilos

La migración transepitelial del neutrófilo en respuesta a la infección bacteriana de la mucosa contribuye a lesión epitelial y a la enfermedad clínica. Se ha desarrollado un modelo in vitro que combina patógenos, neutrófilos humanos y capas polarizadas de células epiteliales humanas cultivadas en filtros transwell para facilitar las investigaciones hacia el desentrañamiento de los mecanismos moleculares que orquestan este fenómeno.

In vitro Ensayo de cocultivo para evaluar la migración transepitelial de neutrófilos inducida por patógenos

Se presenta un método de cuantificación de la adhesión de neutrófilos. Este método crea un ambiente de flujo dinámica similar al que se encuentra en un vaso sanguíneo. Se permite la investigación de la adhesión de neutrófilos a cualquiera de las moléculas de adhesión purificadas (ligando) o sustrato de células endoteliales (HUVEC) en un contexto similar al entorno in vivo con el estrés pura.

Ensayo de adhesión de neutrófilos Cámara de flujo humano

Los leucocitos atraviesan la monocapa endotelial usando el paracelular o la ruta transcelular. Hemos desarrollado un ensayo sencillo para seguir la distribución de la unión endógena VE-cadherina y PECAM-1 durante la migración de leucocitos transendotelial bajo flujo fisiológico de discriminar entre las dos vías de transmigración.

Imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales Durante neutrófilos Transmigración Bajo Flujo Fisiológica

Presentamos un método in vitro que permite cuantificar el número real de células adhesivas dentro de una monocapa de células endoteliales.

La cuantificación de la adhesividad de la célula endotelial<em&gt; In Vitro</em

Endotelio vascular controla firmemente el reclutamiento leucocitario. Extravasación leucocitaria inadecuada contribuye a enfermedades inflamatorias humanas. Por lo tanto, es necesario diseñar mejores terapias para trastornos inflamatorios buscando nuevos elementos reguladores de la activación endotelial. Aquí, describimos una completa metodología para caracterizar nuevos reguladores endoteliales que pueden modificar el tráfico de leucocitos durante la inflamación.

Selección de ensayos para caracterizar nuevos reguladores endoteliales implicados en la respuesta inflamatoria

Leucocitos con avidez interactúan con las células vasculares y las plaquetas después de lesión de pared del recipiente o durante la inflamación. Aquí, describimos un análisis sencillo basado en el flujo laminar para caracterizar los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre los leucocitos y sus socios celulares.

Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes

Dinámica adhesión de células inmunes a la pared del vaso es un prerrequisito para autoguiado hacia el blanco gut. Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo funcional en vitro para el análisis del impacto de los anticuerpos anti-integrina, quimioquinas u otros factores de la adherencia de la célula dinámica de células humanas mediante capilares histórico cubierto.

Ensayo de adhesión dinámico para el análisis funcional de las terapias anti-adherencia en enfermedad inflamatoria intestinal

Aprende a cuantificar la adhesión de neutrófilos humanos a células endoteliales microvasculares activadas en condiciones estáticas mediante espectrofluorimetría. Este ensayo in vitro permite evaluar la respuesta inflamatoria.

Cuantitativo In vitro Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas (Video) | JoVE Journal

Cuantitativo

Explorar más videos