Microfabricación de los patrones de oro Nanoporous de Estudios de interacción célula-materiales

El objetivo general de este procedimiento es fabricar micropatrones de oro nanoporoso y demostrar su compatibilidad con el cultivo celular. Esto se logra creando primero máscaras de esténcil o fotolitografías. El segundo paso es pulverizar oro y plata a través de las máscaras para modelar la aleación precursora del oro nanoporoso.

A continuación, los patrones de aleación de oro y plata se desalean en ácido nítrico para producir recubrimientos de oro nanoporosos. El paso final es cultivar células sobre los micropatrones de oro nanoporoso y teñirlas con inmunotinción, en última instancia, la fluorescencia y la microscopía electrónica de barrido, junto con el análisis de imágenes, se utilizan para cuantificar las interacciones del material celular. La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos para crear recubrimientos nanoestructurados, como los nanotubos de carbono, es que el oro nanoporoso se beneficia de la compatibilidad con la microfabricación, la alta área de superficie efectiva, la facilidad de funcionalización con la química basada en baldosas, la conductividad eléctrica y la biocompatibilidad.

Este método puede responder a preguntas clave en los campos de la ciencia de los materiales y la bioingeniería, como el efecto de la nanoestructura del material en las propiedades eléctricas, mecánicas, biológicas y químicas. Sin embargo, este método proporciona información sobre el efecto de la nanoestructura en la morfología celular. También se puede aplicar a otros sistemas, como el desarrollo de biosensores, sistemas de administración de fármacos y plataformas de almacenamiento de energía.

Comience este procedimiento limpiando los portaobjetos de microscopio de una pulgada por tres pulgadas y los cubreobjetos pequeños con una solución de piraña, cargue los portaobjetos de cubreobjetos pequeños en un bote de tinción inmunológica de porcelana y sumerja el bote y el portaobjetos del microscopio en la solución de piraña. Consulte el protocolo de texto para obtener detalles sobre el procedimiento de limpieza. Después de la limpieza, transfiera las muestras a platos de cristalización y enjuáguelas con agua durante tres minutos.

Coloque las muestras en toallas sin pelusa y séquelas con una pistola de nitrógeno para crear patrones de escala milimétrica. Punzón de láminas de elastómero de silicona de 250 micras de espesor con un punzón de biopsia. Limpie las láminas de elastómero procesadas sumergiéndolas en isopropanol al 70% y luego séquelas con una pistola de nitrógeno.

A continuación, coloque la hoja perforada sobre una toalla sin pelusa y alinee los deslizamientos de cubierta limpios sobre la plantilla con la superficie de la muestra orientada hacia la plantilla. Transfiera la plantilla con los deslizamientos de la cubierta a una oblea portadora para crear patrones de escala submilimétrica. Coloque un microscopio limpio, deslícelo en un mandril giratorio y sople las partículas con una pistola de nitrógeno.

Dispense 1,5 mililitros de dilano de metilo hexadecimal en el portaobjetos de vidrio. Con una pipeta de plástico, extienda el dilano de metilo hexagonal girando el portaobjetos sucesivamente a 500 RPM durante cinco segundos y a 1500 RPM durante 30 segundos. Cuando termine, hornee el portaobjetos en un plato caliente a 115 grados centígrados durante siete minutos y luego déjelo enfriar durante cinco minutos.

A continuación, dispensa cuatro mililitros de una foto positiva. Resista en el portaobjetos de vidrio. Extienda la fotorresistencia girando la corredera utilizando las condiciones descritas anteriormente.

Hornee el portaobjetos en una placa caliente a 115 grados centígrados durante 1,5 minutos y retírelo después de la exposición a los rayos UV y el horneado. Disuelve la foto expuesta. Resiste sumergiendo la diapositiva en una foto positiva.

Resiste el revelador durante al menos 3,5 minutos. Cuando termine, enjuague bien el portaobjetos con agua desionizada e inspeccione los patrones desarrollados bajo un microscopio óptico. A continuación, cargue las muestras en una máquina pulverizadora catódica que pueda depositar de forma independiente pulverización catódica de oro, plata y cromo.

Limpie las muestras durante 90 segundos a 50 vatios bajo una atmósfera de procesamiento Argonne de 25 militorr antes de comenzar la deposición de metal bajo cromo pulverizado Argonne de 10 militorr durante 10 minutos a 300 vatios. A continuación, pulveriza oro durante 90 segundos a 400 vatios, seguido de oro y plata durante 10 minutos con plata a 200 vatios y oro a 100 vatios. Apague la fuente de pulverización catódica de oro aproximadamente 10 segundos antes de apagar la fuente de pulverización catódica de plata.

Retire las muestras de la máquina pulverizadora catódica después de retirar las muestras de la máquina pulverizadora catódica. Sonicarlos en unos 180 mililitros de una foto positiva. Resist stripper durante 10 ciclos de sonicación 22 con pausas de dos minutos entre los ciclos.

Cuando termine, enjuague las muestras con agua y séquelas con una pistola de nitrógeno. Inspecciona los patrones metálicos bajo un microscopio. A continuación, retire la plantilla de elastómero de las muestras no recubiertas de fotorresistencia con dos pinzas para revelar el metal depositado.

Trate los pequeños cubreobjetos con plasma de aire a 10 vatios durante 30 segundos antes de sumergirlos en ácido nítrico. Dealear los portaobjetos del microscopio sumergiéndolos en un vaso de precipitados con ácido nítrico al 70% a 55 grados centígrados durante 15 minutos. Una vez que se complete la desaleación, enjuague las muestras sumergiéndolas sucesivamente en vasos de precipitados de di agua tres veces cada uno.

Coloque las muestras en toallas sin pelusa y séquelas con una pistola de nitrógeno. Ajuste la temperatura de una placa calefactora entre 150 y 300 grados centígrados. A continuación, baje las muestras lentamente sobre la superficie caliente para minimizar los cambios bruscos de temperatura.

Después de cinco minutos, retire las muestras de la placa caliente para que se enfríen. Coloque las muestras de oro nanoporoso en placas de poliestireno y trátelas con plasma de aire a 10 vatios durante 30 segundos. A continuación, transfiera las muestras a placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos.

Agregue 500 microlitros de medio de cultivo completo a cada uno. Almacene bien las placas en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5%CO2 hasta la siembra de las células. Mantener las células de astrocitos murinos en matraces T 75 con medios de cultivo.

Una vez que las células estén confluentes en un 70%, páselas primero retirando los medios viejos y lavando las células con PBS. Consulte el protocolo de texto para obtener detalles sobre las condiciones de passeng. Después de retirar las placas de cultivo de la incubadora, aspire los medios gastados de los pocillos y siembre las células en el vidrio.

La cubierta se desliza a una densidad de 25.000 células por centímetro cuadrado con un volumen final de un mililitro. Agite la placa de cultivo para asegurar una capa uniforme de células sobre las muestras y coloque la placa de cultivo en la incubadora cuando las células estén listas para ser analizadas. Retire los medios gastados de los pozos y lávelos dos veces con PBS.

Una vez que las células se han fijado en 4%para formaldehído en PBS y se lavan dos veces, perme en 500 microlitros de 0.1%Triton X 100 en PBS durante cinco minutos. Repita el lavado de PBS dos veces y transfiera las celdas a pozos limpios. Seque 80 microlitros de la solución de tinción sobre las muestras y guárdelas cubiertas con papel de aluminio durante 20 minutos.

Después de otro lavado con PBS, contratiña las células con tres nanomolares de DPI en PBS durante cinco minutos. Lave las celdas con PBS una vez más y sumérjalas en di, luego monte las celdas en vidrio. Cubra las diapositivas con medios de montaje y séllelas con una imagen transparente de esmalte de uñas.

El oro nanoporoso sale a la superficie con un microscopio electrónico de barrido con un aumento de 50.000 x a una energía de electrones de 10 kilovoltios utilizando un detector de electrones secundario. A continuación, capture imágenes de células compuestas en diferentes puntos de las muestras utilizando un microscopio de fluorescencia invertida con un aumento de 10x con los cubos de filtro adecuados. Abra las imágenes en la imagen J.Divida las imágenes en canales individuales.

Conviértelos en ocho ofertas. Reste el fondo y suéltelo mediante el filtrado de la mediana. A continuación, ajuste el umbral manualmente para resaltar los poros, los cuerpos celulares y los núcleos.

Utilice el comando cuenca hidrográfica para separar los poros o las células fusionados. Establezca los parámetros de análisis de partículas y ejecute el comando para extraer el número de partículas, el área promedio y el porcentaje de cobertura por partículas. Por último, modifique los archivos de macros incluidos para realizar análisis por lotes de varias imágenes.

Aquí se muestra el cambio de color de los patrones de metal depositados antes y después de la aleación. El acabado plateado se debe al contenido de aleación rico en plata en la aleación. La película adquiere un tinte marrón anaranjado visible.

Aquí se muestran las características más finas producidas por la fotolitografía. Patronaje del metal. Se pueden obtener diferentes morfologías pobres mediante el tratamiento térmico de las películas de oro nanoporoso.

La imagen de la sección transversal revela si las películas están desaleadas uniformemente a través del espesor de la película. Las imágenes del microscopio electrónico de barrido se pueden segmentar en imágenes binarias para determinar el tamaño y el porcentaje de cobertura de vacíos. El código para generar esta salida se puede descargar desde la página web de JoVE.

Aquí se muestra una imagen de fluorescencia representativa de células de astrocitos murinos adherentes cultivadas en una superficie de oro nanoporoso. Los canales individuales de la imagen se pueden dividir y segmentar para producir imágenes binarias para analizar la interacción del material celular. Las imágenes segmentadas del citoesqueleto se pueden utilizar para cuantificar el área celular y la cobertura de la superficie.

Mientras que las imágenes segmentadas del núcleo celular son útiles para el recuento de células. Los códigos para generar estas salidas se pueden descargar desde la página web de JoVE. Aquí se muestra un resumen visual de las fallas en la fabricación de estructuras de oro nanoporoso, incluida la adhesión de la película de PO, la ausencia de porosidad y el tratamiento térmico excesivo.

Siguiendo este procedimiento, otros métodos sugieren que se puede realizar la caracterización electroquímica en microscopía forestal, lisis celular y PCR para responder a preguntas adicionales, como el efecto de la adhesión celular de la nanoestructura y la expresión génica. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo producir patrones de oro de nanoporos y cuantificar sus interacciones con las células mediante el análisis de imágenes digitales de microscopía. Resultados. No olvide que trabajar con ácido nítrico, ácido de azufre y peróxido de hidrógeno puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, incluido el aumento del equipo de protección personal, al realizar este procedimiento.