El uso de un sistema de seguimiento 3D Automatizado de Registro Individual y bajíos de adultos de pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es estudiar los patrones de movimiento tridimensionales de peces cebra u otros animales acuáticos y analizar sus características cinemáticas, espaciales y sociales. Esto permite detectar comportamientos alterados debido a mutaciones genéticas o factores químicos y ambientales. Esto se logra primero calibrando el sistema, lo cual también corrige la distorsión considerable de la imagen generada por la refracción.

El segundo paso consiste en grabar fotogramas de video con una resolución temporal relativamente alta desde al menos dos ángulos diferentes simultáneamente. A continuación, el software reconstruye las trayectorias del pez. Se aplican algoritmos avanzados para reducir el efecto del ruido y deducir la posición de un pez cuando ocurre oclusión o agrupamiento.

El paso final consiste en analizar los datos y realizar el análisis estadístico de la aceleración de la velocidad, el ángulo de giro, la distribución horizontal y vertical en el recipiente de observación, las distancias interindividuales y otros parámetros de interés. En definitiva, el seguimiento en 3D calibrado a alta velocidad es útil para estudiar los déficits conductuales en pececillos de danio mutantes y los efectos de fármacos sobre una variedad de sistemas conductuales. Con fines de descubrimiento de fármacos, una ventaja del sistema es que permite estudiar la conducta de los peces en 3D.

Esto es importante porque los peces se mueven naturalmente en las tres dimensiones y, al registrar múltiples peces simultáneamente, la grabación en 2D puede ser muy engañosa al investigar las configuraciones espaciales del grupo. Otra ventaja del sistema es que corrige la refracción de la luz, la cual, si no se corrige, puede provocar errores de medición significativos en su configuración actual. El recipiente de observación que contiene los peces cebra se coloca en la cámara de observación.

La cámara también contiene una cámara, un espejo, que está suspendido a aproximadamente 45 grados sobre el recipiente y barras de luz LED. Antes de grabar, calibre el sistema para determinar las posiciones de la pared del recipiente y de la superficie del agua, así como el factor de escala de los fotogramas grabados, y ajuste también el error generado por la refracción de la luz al pasar del agua al aire. Una vez completada la calibración, se debe realizar una prueba con un pez simulado.

La recalibración debe realizarse si las posiciones del espejo o de la cámara están desajustadas o si hay problemas con el seguimiento. Para iniciar una sesión de grabación, coloque el recipiente de observación lleno hasta las marcas con agua dentro de la cámara de observación. Los pies del recipiente deben insertarse en los orificios de alineación.

Oriente los recipientes de manera que las paredes semitransparentes u opacas queden en el lado opuesto y a la derecha, tal como se ven desde la cámara. A continuación, encienda las luces en el compartimento, luego introduzca el pez en el recipiente y cierre las cortinas. Abra el módulo de grabación y aparecerá en pantalla la imagen de la vista frontal y superior del recipiente.

Inicialmente, la imagen adquirida puede no ser ideal y, por lo tanto, podría necesitar algunos ajustes para obtener un contraste suficiente entre el pez y el fondo. Para ajustar la imagen, seleccione control de cámara y, a continuación, en la ventana de configuración general que se abre, desactive las casillas mostradas aquí y luego ajuste la obturación y la ganancia de manera que la imagen no quede sobreexpuesta. A continuación, en el lado izquierdo de la ventana de control de cámara, seleccione balance de blancos a color y, en la nueva ventana, desactive la casilla de automático y ajuste los valores de rojo y azul para obtener el mejor contraste de color tanto en la vista frontal como en la vista superior.

Pueden ser necesarios múltiples ajustes después de que se completen los ajustes. Desde el menú principal del módulo de registro, seleccione la ubicación de los datos para crear o seleccionar una carpeta. Cada registro debe tener su propia carpeta, que debe ser una subcarpeta de la carpeta del experimento.

Ahora pulse iniciar grabación e introduzca un número entero para la duración de la grabación en minutos, luego pulse aceptar y comenzará la sesión de grabación experimental. Una vez finalizadas las grabaciones, copie y pegue los datos del contenedor del animal y las subcarpetas de datos de correspondencia desde la carpeta de calibración a las carpetas creadas previamente. Para iniciar la reconstrucción de la trayectoria, abra el módulo de trayectoria del software. Luego pulse ubicación de datos para seleccionar la carpeta que fue creada con el módulo de grabación.

A continuación, presione el botón de configuración del sistema para abrir primero la ventana de parámetros y ajuste los umbrales de color para la vista superior e inferior. Un valor inicial adecuado es 1000. A continuación, seleccione los umbrales de tamaño para la vista superior e inferior.

Un tamaño inicial adecuado para un pez cebra de tamaño mediano es 10, o utilice 20 para un pez grande y cinco para un pez pequeño. Cuanto más altos sean estos umbrales, menos probable será que el software detecte ruido. Sin embargo, con un valor demasiado alto, podría no ser capaz de detectar al pez.

Puede ser necesario reajustar estos umbrales más adelante en el experimento. Para el umbral superior de tamaño, un valor de 3000 suele ser suficiente. Y para la longitud específica, mantenga el valor preestablecido de 220.

El número de peces hace referencia al número de peces en el tanque de observación. El número máximo de puntos se refiere al número total de fotogramas, registre o recuerde este número y presione Aceptar. Luego seleccione adquirir fondo.

La siguiente ventana solicitará completar los campos "desde" y "hasta". Después de cargar el fondo, ajuste las tres cajas rojas utilizando el ratón; estas cajas marcan las áreas en las que el software busca al pez. Minimice la caja situada a la izquierda.

Dado que la vista lateral solo se utiliza para la calibración, ahora presione el botón de iniciar la generación de trayectorias y comenzará la reconstrucción de la trayectoria. Idealmente, la etiqueta debe colocarse sobre la imagen del pez; si a menudo se coloca incorrectamente, abra la ventana de información. Aquí observamos un caso ideal en el que solo se ven los contornos del pez.

En caso de ruido excesivo, presione detener en el menú principal y elija nuevos umbrales de color y tamaño. Asimismo, verifique si las cajas rojas pueden reducirse ligeramente. Por ejemplo, en la parte superior, para excluir el ruido generado por los movimientos del agua, observe la trayectoria en la pantalla 3D.

Al hacer clic derecho con el ratón, el investigador puede seleccionar entre rotación y traslaciones de la configuración 3D. Para comenzar el procesamiento de datos, abra el módulo de procesamiento de datos, seleccione el proyecto en la barra de herramientas y luego, en el menú desplegable, seleccione nuevo e ingrese un nombre de experimento. A continuación, seleccione editar proyecto.

Luego, agregue al proyecto seguido de un nuevo grupo y complete un nombre para el grupo experimental. Ahora seleccione el grupo experimental en la ventana derecha. Tenga en cuenta que la barra de herramientas cambiará.

Seleccione el grupo de edición, luego agregue al grupo y después agregue nuevas mediciones. Esto abrirá una ventana del navegador. A continuación, abra la carpeta creada durante la grabación y seleccione la subcarpeta trayectorias y luego el archivo de puntos suavizados.

En el ejemplo presentado aquí para el grupo A, se cargaron seis archivos y para el grupo B, cuatro archivos. Para comenzar el análisis, seleccione el archivo suavizado por puntos en la ventana derecha. Luego seleccione Procesamiento de datos y Puntos finales de valor único en el menú desplegable.

Como ejemplo, seleccione la congelación por duración. Se abrirá una ventana para especificar la congelación en función del umbral de velocidad y del umbral de duración, con el fin de familiarizarse con el programa. Pruebe otros ejemplos como distribución de profundidad por distancia recorrida, que permite determinar el número de niveles de profundidad y la frecuencia de ráfagas.

Al seleccionar la opción, se calculará el procesamiento por lotes utilizando un umbral predeterminado de aproximadamente 200 puntos finales en este contexto. Predeterminado significa que se han establecido los delimitadores. Por ejemplo, actualmente la distribución de profundidad se calcula para tres niveles de profundidad y la distribución angular se calcula para cuatro secciones.

Después de generar los parámetros, se abrirá una nueva ventana solicitando la ubicación y el nombre del archivo que se creará. Estos se guardarán en formato CSV y podrán importarse a otro software. Aquí, la figura A muestra un ejemplo típico de cuadro para el control.

Pez cebra, mientras que la figura B muestra un ejemplo típico de cuadro para peces cebra tratados con MK 801, ambos registrados durante una sesión matutina. Obsérvese que los peces cebra controlados estaban cerca del fondo y agrupados. En contraste, los peces cebra tratados con MK 801 estaban cerca de la parte superior y nadaban a una distancia considerable unos de otros.

Aquí se presentan dos trayectorias representativas de peces cebra control y peces cebra tratados con 10 micromolar de MK 801, correspondientes a una sesión matutina y a una sesión vespertina. En esta figura, se muestran las distancias sociales promedio para los controles y para los peces tratados con 10 micromolar de MK 801 en ambas sesiones, y aquí se presentan las líneas de tiempo de las distancias interindividuales promedio para ambos grupos.

Aquí en la figura A, observamos la distribución de los peces cebra en 10 niveles iguales de profundidad durante la sesión matutina, y en B, la distribución durante la sesión vespertina. Aquí se observa la distribución temporal en las cuatro zonas radiales de los grupos experimentales. El recuadro muestra la ubicación de estas zonas desde el centro hacia la periferia, y aquí vemos la distribución temporal en los cuatro cuadrantes de los grupos experimentales.

El recuadro muestra la ubicación de los cuadrantes. Las líneas dobles representan paredes blancas, las líneas simples representan paredes transparentes. La cámara se encuentra a la izquierda del recuadro IE, más cerca de los cuadrantes uno y cuatro.

Los asteriscos negros indican comparaciones entre los grupos de la sesión matutina y los asteriscos grises para aquellos de las sesiones vespertinas. Finalmente, aquí se muestran las componentes X, Y, Z de la distancia recorrida por los peces cebra durante las sesiones matutina y vespertina. Se presentan la media y el error estándar de la media.

Al trabajar con el sistema, recuerde que los datos son tan buenos como la grabación, por lo que debe asegurarse de que el sistema esté bien calibrado y de que los ajustes de la cámara sean óptimos. El resto es sencillo y simplemente se trata de familiarizarse con los diferentes pasos.