Derribo Gene a gran escala en C. elegans Utilizar bibliotecas de alimentación de dsRNA para generar sólidas fenotipos de pérdida de función

El objetivo general de este procedimiento es realizar cribados de interferencia de ARN a gran escala en Celegance utilizando una biblioteca de alimentación de ARN DS bacteriano para reducir la expresión génica. Esto se logra cultivando primero clones bacterianos de una biblioteca de ARN DS. En condiciones de crecimiento que eviten la pérdida de plásmidos, comience duplicando cada placa de biblioteca primaria y luego use la placa de biblioteca duplicada de 96 pocillos para generar tallos temporales de bacterias en placas omni de agar.

Las bacterias de estas placas omnidireccionales se cultivan durante la noche en cultivo líquido y posteriormente se transfieren a la superficie de las placas de alimentación de lombrices. Cada clon bacteriano de la biblioteca lleva un plásmido codificante D-S-R-N-A único que se dirige a un gen C elgan para su eliminación. El segundo paso es colocar lombrices sincronizadas en las placas de alimentación.

A continuación, los gusanos se cultivan durante varios días en una cámara humidificada a 20 grados centígrados. A medida que los gusanos se alimentan de las bacterias, los ARN DS inducidos se liberan en el intestino del animal, donde luego se propagan a los tejidos circundantes para causar efectos de derribo sistémicos. El paso final es examinar los animales alimentados para determinar los efectos fenotípicos causados por la eliminación específica del gen.

Estos ensayos fenotípicos se utilizan para identificar genes importantes para el proceso biológico en estudio. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la microinyección de ARN de doble cadena en la gónada del gusano, es que tiene un alto rendimiento. Usando bibliotecas de alimentación, podemos examinar la función biológica de casi todos los genes de los elfos marinos en solo cuestión de semanas.

Muchos laboratorios han luchado con este enfoque de derribo porque la mayoría de los genes y la elegancia C son haplo suficientes. Y así, la eliminación del ARN debe disminuir la expresión génica en más del 50% para producir la pérdida de fenotipos de función. Para garantizar una eliminación robusta de genes, es fundamental que todas las bacterias alimentadas por los gusanos expresen el plásmido de ARN bicatenario.

Para comenzar el procedimiento para determinar la pérdida de plásmidos, extraiga una pequeña muestra de bacterias como se describe en cada paso relevante y agréguela a 450 microlitros de agua estéril. Utilice 100 microlitros de esta muestra diluida para crear más diluciones en serie con agua estéril. Mezcle bien las soluciones entre diluciones.

Extienda 100 microlitros de cada dilución en placas LB y LB AMP e incube durante la noche a 37 grados centígrados al día siguiente, identifique la placa LB que contiene entre 100 y 500 colonias bacterianas. Cuente el número de colonias en esta placa y en la placa de lb amp correspondiente que contiene la misma dilución de bacterias. Determine la pérdida de plásmidos usando esta ecuación.

El porcentaje de bacterias que no contienen el plásmido se calcula restando el número de colonias en la placa del amplificador LB del número de colonias en la placa LB, dividiendo por el número de colonias en la placa LB y multiplicando por 100 La pérdida de plásmido se previene mediante el crecimiento de bacterias en altas concentraciones de venta carbónica para una eliminación efectiva. Verifique la pérdida de plásmidos antes de alimentar a los animales y continúe solo si la pérdida de plásmidos es inferior al 15%Comience este procedimiento eliminando las placas de biblioteca duplicadas del congelador negativo de 80 grados Celsius. Retire el sello de aluminio mientras los cultivos aún están congelados.

Vuelva a colocar la cubierta de plástico de las placas y coloque las placas de biblioteca duplicadas sobre una superficie nivelada para que se descongelen a temperatura ambiente durante no más de 30 minutos. Esterilice el replicador bucal de 96 pines. Colóquelo en un baño de etanol y luego queme el etanol.

Cubra los alfileres con un panecillo y un quemador. Deje que la llama se extinga y luego repita. Las clavijas de un replicador limpio deben enjuagarse con agua destilada y luego esterilizarse antes de cada uso.

Coloque el replicador esterilizado en los pocillos de la placa duplicada descongelada y utilícelo para remover suavemente los cultivos. Pequeños volúmenes del cultivo se adherirán a los pines del replicador. Retire con cuidado el replicador de los pocillos de la placa duplicada y colóquelo suavemente con alfileres sobre la superficie de la placa omnidireccional.

Tenga cuidado de no perforar la superficie del agar. Deje el replicador en la superficie de la placa omnidireccional durante tres o cuatro segundos para que las bacterias de los pines del replicador se transfieran a la superficie del agar. Para evitar la pérdida de plásmidos en medios sólidos, el ato contiene dos miligramos por mililitro.

Venta carbónica. Retire el replicador y permita que el pequeño volumen de cultivo bacteriano se absorba en el agar. Después de que ambas placas se hayan duplicado.

Incubar las placas omni invertidas durante 15 a 18 horas a 37 grados centígrados a la mañana siguiente. Estas placas omnidireccionales se pueden utilizar para inocular cultivos líquidos de 96 pocillos o almacenarse hasta siete días a cuatro grados centígrados. Las bacterias para la alimentación de lombrices se preparan como cultivos líquidos utilizando bacterias de las placas omnidireccionales utilizando un pipeteador de repetición y una punta combinada de 50 mililitros, dispensa un mililitro de medio de crecimiento bacteriano en cada dos mililitros.

El pocillo profundo de una placa de 96 pocillos esteriliza el replicador y colócalo en la superficie de una placa omnidireccional que contiene colonias bacterianas, asegurándose de que los pines estén en contacto con cada una de las 96 colonias bacterianas. Mueva con cuidado el replicador desde la superficie de la placa omnidireccional hasta la placa de pocillo profundo, asegurándose de que los alfileres no raspen los lados de los pocillos profundos hasta que se sumerjan en el medio de crecimiento. Para desalojar las bacterias en el medio de crecimiento.

Mueva el replicador lentamente en un movimiento cuadrado siguiendo la pared interior de la placa del pozo profundo. Tenga cuidado de no salpicar y contaminar los pozos. Para cada placa de cultivo de 96 pocillos profundos, se deben incluir dos controles.

Bacterias que expresan ARN DS como control positivo para el knockdown esperado, fenotipo y bacterias que contienen vector vacío de ARN DS como control negativo. Usando un asa de inoculación estéril, extraiga una sola colonia aislada de la placa de control positivo e inocule un pocillo vacío en la placa llamada placa de pocillo profundo. Registre la posición del pocillo que se ha inoculado.

Repita para el control negativo. Agite las placas de pozos profundos en una posición plana a 650 RPM en un micro agitador a 37 grados Celsius durante la noche. Después de la incubación nocturna de los cultivos, las bacterias de las 96 placas de pocillos profundos se transferirán a 12.

La transferencia de placas de alimentación de pocillos se puede realizar en cuatro pocillos a la vez. Coloque las puntas de pipeta en cada tercer canal de una pipeta multicanal de 12 canales. Retire 150 microlitros de cultivo bacteriano de la placa de pocillo profundo y expulse a la superficie de cuatro pocillos de la placa de alimentación de 12 pocillos.

Es importante no perforar la superficie del agar durante la transferencia, ya que los gusanos excavarán y no se alimentarán de las bacterias que expresan el ARN DS. Después de transferir cada juego de cuatro pocillos, reemplace las cuatro puntas de pipeta por cuatro nuevas puntas de pipeta estériles y siembre los siguientes cuatro pocillos de la placa de alimentación. Guarde las placas sembradas en posición vertical en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche para que las bacterias puedan absorberse en el agar. Antes de transferir L, una detuvo las larvas de C. elgan en las placas de alimentación de DS RNA para una pantalla de alimentación.

Debe determinarse la concentración de las larvas L one detenidas previamente preparadas. Mezclar el matraz de Erlenmeyer que contiene las larvas L one detenidas para distribuir los animales. A continuación, retire una alícuota de 10 microlitros y colóquela gota a gota sobre una placa NGM de seis centímetros desmontada.

En cuatro o cinco gotas por el centro del plato. Asegúrese de que todos los medios sean expulsados de la pipeta. Con el extremo de la punta de la pipeta, extienda los puntos de suspensión de gusano para formar una sola línea continua de líquido que se extienda por el diámetro de la placa.

Usando un microscopio de disección, cuente a todos los animales comenzando en un extremo de la línea de líquido y continuando hasta el otro extremo antes de que el líquido se haya absorbido en la placa y los animales se dispersen. Esto puede requerir un reenfoque constante del visor de disección para asegurarse de que no se pierda ningún animal. Repita este procedimiento de conteo para tres alícuotas separadas de 10 microlitros para determinar el número promedio de gusanos por microlitro de suspensión de gusano y registre este número directamente en el matraz erlenmeyer.

Para comenzar la pantalla de alimentación, use la suspensión de larvas detenidas L one y agua estéril para preparar una solución que contenga 2000 lombrices por mililitro. Cada placa de alimentación de 12 pocillos requerirá 120 microlitros de esta suspensión de gusano mezclados completamente para garantizar una distribución uniforme de los animales y transferir los animales a un depósito estéril para su pipeteo. Utilizando la pipeta multicanal configurada con puntas en cada tercera posición, transfiera 10 microlitros de la solución de lombriz directamente sobre el césped bacteriano de las placas de alimentación.

Tenga cuidado de no perforar la superficie del agar, ya que los gusanos se introducirán en el agar y no se alimentarán de las bacterias que expresan D-S-R-N-A. Después de transferir la solución de lombriz a cada dos filas de placas de alimentación, vuelva a mezclar la solución de lombriz en el depósito agitándola suavemente a medida que las lombrices se asientan rápidamente, examine algunos pozos desde el principio bajo el alcance de disección para asegurarse de que cada pocillo reciba de 20 a 30 lombrices. Una vez que todas las placas de alimentación tengan lombrices, guarde las placas en posición vertical en una caja humidificada en una incubadora de 20 grados centígrados al día siguiente después de que la suspensión de lombrices se haya absorbido en la placa, invierta las placas y regrese al humidor a 20 grados centígrados.

Los animales en estas placas se pueden observar después de tres días para los fenotipos P cero y luego nuevamente después de seis días para los fenotipos F1. El protocolo descrito aquí se utilizó para probar cuatro genes para el huevo knockdown L 30 dumpy 17, PAT 10, y en cuatro huevos L 30 y en cuatro se expresan en el sistema nervioso. Pat 10 se expresa en el músculo de la pared corporal y dumpy 17 se expresa en las células epidérmicas.

Se utilizaron mutantes Erie one Lin 15 B en las pruebas de detección debido a su mayor sensibilidad al ARNi como control negativo. Los gusanos fueron alimentados con bacterias que contenían el plásmido PL 44 40 vacío que no expresaba un ARN DS como se esperaba. Los animales alimentados con bacterias que contenían en el plásmido vacío no mostraron ningún defecto morfológico o de comportamiento.

Esta fotografía muestra animales moviéndose libremente, como lo demuestra su postura corporal normal. La flecha negra indica la posición de un animal adulto joven. La flecha blanca indica la posición de un grupo de huevos puestos.

El comportamiento normal de los gusanos se muestra en este videoclip: el huevo L 30 codifica el orto logaritmo de la proteína G de la proteína G alfa Q. Cuando L una etapa Erie una larva Lin 15 B fueron alimentadas con bacterias que expresan el huevo L 30 DS ARN. Las larvas crecieron hasta convertirse en adultos que mostraron claros defectos en la locomoción y el comportamiento de puesta de huevos. Después de tres días, el 100% de los animales alimentados con ARN DS contra el huevo L 30 estaban paralizados y no podían poner huevos.

Esta fotografía muestra que todos los animales han adoptado un aspecto rígido propio de los animales paralizados. También hay que tener en cuenta la ausencia total de huevos puestos en el plato. Dumpy 17 codifica una proteína de colágeno necesaria para la formación de cutículas en el mar.

Elgan y los 17 mutantes nulos son más bajos y gordos que los animales salvajes. En este experimento, no se observaron defectos morfológicos en los animales P zero alimentados con 17 D-S-R-N-A. Sin embargo, el 98% de los animales F1 como se muestra en esta figura mostraron el fenotipo rechoncho.

Tenga en cuenta que los animales adultos en el campo, uno de los cuales está marcado por la flecha, son más bajos y gordos que el animal adulto marcado por la flecha negra. En el panel A.La falta de animales P cero bajos y gordos indica que la función del gen 17 es necesaria en las primeras etapas larvales para una morfología corporal adecuada. Pat 10 codifica la proteína troponina CA del músculo de la pared corporal que contiene cuatro motivos de mano EF que se unen al calcio.

Se observó en este estudio que el 100% de los animales Erie un Lin 15 B alimentados con ARN Pat 10 DS se paralizaron en tres días y no pusieron huevos, lo que dio lugar a un fenotipo letal. Tenga en cuenta que aunque los animales están paralizados, todavía pueden mover los músculos de su cabeza para alimentarse, como lo indica la eliminación de bacterias cerca de la cabeza marcada por la flecha en cuatro codificas, una proteína de dominio homeo que se expresa en las neuronas motoras del cordón ventral y es necesaria para la entrada sináptica adecuada. La elección de cuatro fue elegida como gen de prueba en este estudio porque ha demostrado ser resistente a las estrategias previas de alimentación de ARN DS.

Los resultados de este estudio mostraron que el 62% de los animales alimentados con cuatro bacterias que expresan ARN DS de la preparación de la biblioteca mostraron defectos en el comportamiento de locomoción en comparación con los animales de tipo salvaje que retroceden libremente en un movimiento sinusoidal cuando se les pincha en la cabeza, UNC cuatro mutantes nulos no retroceden, sino que se contraen fuertemente causando un flexor dorsal, que a menudo llega a ser tan extremo que la cabeza y la cola del animal se tocan colocando el cuerpo en una posición enrollada. Esta tabla muestra el porcentaje de animales que exhiben fenotipos nulos cuando se alimentan con ARN DS contra cada uno de los cuatro genes probados: se examinaron 100 animales para cada experimento de derribo. Estos resultados demuestran la importancia de la retención de plásmidos para el éxito del ARN DS.

Las pantallas de interferencia pueden observarse fenotipos de pérdida de función robustos y altamente penetrantes en todos los tejidos. Cuando todas las bacterias alimentadas a los gusanos expresan el ARN del DS una vez dominadas, toda la biblioteca de alimentación puede ser examinada por una persona en aproximadamente dos meses. Para mejorar el rendimiento, solo probamos cada clon bacteriano una vez en una criba de alimentación.

Los genes identificados en el primer paso a través de la biblioteca se vuelven a analizar. Por triplicado, insistimos en que el fenotipo deseado se observe en todas las repeticiones para que el gen se eleve al cuadrado como un resultado positivo. A continuación, el plásmido se purifica a partir de las bacterias y se secuencia para verificar la identidad del gen codificado.

Una vez que se identifica un gen, ordenamos un mutante L si está disponible y lo analizamos para el fenotipo deseado antes de realizar cualquier caracterización adicional del gen.