Visualización de los Efectos de una experiencia inicial positiva, Estímulo Táctil, sobre dendríticas morfología sináptica y la conectividad con Golgi-Cox tinción

El objetivo general de este procedimiento es utilizar técnicas de tinción de G Cox de oro para visualizar los cambios morfológicos en las neuronas que siguen a la estimulación táctil en las primeras etapas de la vida. Esto se logra administrando primero la estimulación táctil tres veces al día desde el tercer día postnatal hasta el día 21 postnatal. El segundo paso es perfundir a los animales una vez que alcanzan la edad de la investigación y almacenar sus cerebros en la solución Goldy.

A continuación, los cerebros se cortan en rodajas con Aome. El paso final es impregnar los cerebros con la técnica de tinción CO GOGI. En última instancia, el procedimiento GOGI co se utiliza para visualizar neuronas individuales, lo que permite el análisis de los cambios morfológicos.

La belleza de la técnica de Goy Cox es que nos permite cuantificar la estructura de las neuronas y correlacionarla con los resultados conductuales. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia los trastornos del desarrollo, ya que se ha demostrado que la estimulación táctil es eficaz tanto en la recuperación conductual como anatómica de estos trastornos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la neuroanatomía de las ratas, también se puede aplicar a otros organismos modelo y al tejido cerebral humano.

Para ayudarnos a mejorar nuestra comprensión de la plasticidad dependiente experimentada, los animales se mantienen en un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas con libre acceso a alimentos y agua después del nacimiento. Cada rata hembra se aloja individualmente con sus crías. Para evitar el estrés adicional relacionado con el manejo, los cachorros reciben estimulación táctil a partir de la tercera pulgada.

Después de pesar a los cachorros antes de la sesión de estimulación táctil de la mañana, transporte a los cachorros en sus jaulas domésticas a una sala de pruebas separada. Coloque la jaula de la casa sobre una almohadilla térmica que esté configurada a 24 grados centígrados. Cuando esté listo para la estimulación táctil, retire a las madres de su jaula de origen y colóquelas en una jaula temporal con comida y agua.

Mantenga la madre y la jaula temporal en la sala de cría. A continuación, use una tabla rígida para dividir la jaula de casa en dos mitades. Luego, asigne aleatoriamente a la mitad de los cachorros de cada camada para que se sometan a estimulación táctil y la otra mitad sirva como control.

Marque sus patas traseras y cola con marcador permanente para diferenciar los grupos y coloque a las crías en el grupo de estimulación táctil en un lado de la jaula y a las crías de control en el otro. Configure un temporizador a 15 minutos con un plumero suave como un plumero. Cepille a todos los cachorros del grupo de estimulación táctil al mismo tiempo durante 15 minutos consecutivos.

Las crías de rata jóvenes suelen acurrucarse y parecen entrar en un ciclo de sueño profundo, lo que hace que sea muy fácil estimular a todas las crías a la vez. A medida que los cachorros crecen, se vuelven más activos y algunos cachorros caminan e investigan. Durante la sesión, mueva a los cachorros vagabundos al grupo para asegurarse de que cada cachorro reciba la misma estimulación.

Después de 15 minutos de estimulación táctil, regrese a la madre a la jaula y transporte la jaula de regreso a la sala de cría. Este proceso se repite tres veces al día. Durante 19 días Después de la última sesión de estimulación táctil, desteta a las crías de sus madres Las crías se alojan en jaulas con otros cinco o seis animales destetados del mismo sexo, deja a las ratas intactas en condiciones de alojamiento estándar hasta que alcanzan la edad de indagación.

Las muestras se recogen cuando los animales alcanzan los 100 días de edad. Después de la eutanasia y la perfusión intracardíaca, se extrae el cerebro. Cuidando de mantener el cerebelo intacto.

Coloque los cerebros en un frasco opaco de Nalgene lleno de 20 mililitros de solución Goldy Cox, donde se conservan durante 14 días. Después de 14 días, reemplace la solución con una solución de sacarosa al 30%. Mantenga los sesos en solución de sacarosa durante dos a cinco días antes de seccionarlos para seccionarlos.

Seque el cerebro antes de fijarlo a una etapa de sección con pegamento acrílico Sano para evitar desgarros o secciones desiguales, asegúrese de que todo el cerebro esté firmemente asegurado a la etapa. A continuación, llene el depósito de Vibram con una solución de sacarosa al 6% hasta que cubra la cuchilla de sección. Ajusta la velocidad y la amplitud del Vibram a cinco.

Corta el cerebro en secciones de 200 micras y colócalas en un portaobjetos de microscopio gelatinizado al 2%. Asegúrese de mantener las secciones húmedas durante el transcurso del seccionado cuando se hayan recopilado todas las secciones de interés. Presione las secciones sobre los portaobjetos aplicando presión con papel humedecido.

Coloque los portaobjetos en un estante para portaobjetos y guárdelos en una cámara de humedad durante al menos 12 horas, pero no más de cuatro días. Para comenzar el procedimiento de tinción, etiquete y prepare 12 platos de vidrio para teñir. Primero, sumerja los portaobjetos en agua destilada durante un minuto.

A continuación, coloque los portaobjetos en hidróxido de amonio y manténgalos en la oscuridad durante 30 minutos. Después de un minuto adicional en agua destilada, coloque los portaobjetos en Kodak Fix durante 30 minutos con protección ligera. Coloque los portaobjetos en agua destilada una vez más antes de deshidratarlos en una serie de soluciones de alcohol graduadas.

Después del último lavado con alcohol, coloque los portaobjetos en una tercera solución durante 15 minutos. Por último, coloque los portaobjetos en hemo D durante 15 minutos. Cuando esté listo, use primordial para colocar los portaobjetos de cubierta en los portaobjetos y deje que los portaobjetos se sequen al aire antes de examinarlos con un microscopio visto.

Aquí hay una fotografía representativa de una neurona parametálica teñida con Golgi Cox en una rata que recibió estimulación táctil durante el desarrollo. Una fotografía ampliada muestra espinas dendríticas en las dendritas terminales. La imagen más clara de la izquierda es de una rata del grupo de control y la imagen más oscura es de una rata que recibió estimulación táctil.

Este gráfico representa la complejidad apical y dendrítica de Basler promedio para las neuronas en el área CG tres de ratas adultas que recibieron estimulación táctil durante el desarrollo o no. Al seguir este procedimiento, tenemos la ventaja de que si queremos hacer preguntas adicionales, hemos teñido todo el cerebro y, por lo tanto, podemos volver atrás y usar el mismo tejido cerebral para responder a esas preguntas. Al desarrollar estas técnicas, hemos allanado el camino para que los investigadores exploren la utilidad de la estimulación táctil como terapia para el tratamiento de traumatismos craneales u otras formas de lesiones neurológicas después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores de neurociencia exploraran su potencial para remediar el trauma cerebral y los trastornos del desarrollo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo proporcionar a los cachorros la experiencia enriquecedora de la estimulación táctil, así como un medio para visualizar neuronas y sinapsis individuales.