Name: Visualización de los Efectos de una experiencia inicial positiva, Estímulo Táctil, sobre dendríticas morfología sináptica y la conectividad con Golgi-Cox tinción (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-25T09:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprende a visualizar cambios morfológicos neuronales tras estimulación táctil temprana en ratas usando tinción Golgi-Cox. Este método permite analizar complejidad dendrítica y plasticidad cerebral.

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Este trabajo está financiado por becas NSERC a BK y RG. Los autores también desean agradecer a Kehe Xie y Russell Hosain por su experiencia tinción de Golgi-Cox.

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales y aprobados por la Universidad de Lethbridge, Comité de Cuidado de Animales. 1. Cría y Estímulo Táctil <ol><li> Solicite ratas preñadas a proveedores comunes de los animales o de criar cachorros en la casa utilizando los métodos convencionales de mejoramiento de laboratorio. </li><li> Casa todos los animales en una habitación con temperatura controlada de cría (21 ° C), mantenido en una luz 12:12 hr: oscuridad ciclo y proporcionar acceso a alimento y agua ad libitum. </li><li> Cuando nacen las crías, la casa de ratas hembras por separado con sus crías. </li><li> Para evitar el estrés adicional en relación con el manejo de inmediatamente después del parto, comenzará la estimulación táctil de los cachorros en P3. </li><li> La estimulación táctil debe llevarse a cabo tres veces al día (9:00 am, 13:00 y 16:00) a partir de P3-P21 y cachorros debe ser destetados de sus madres en P21. </li><li> Cuando se utiliza un diseño de camada cruz, la mitad de las crías de frOM cada camada se someterá a la estimulación táctil con el otro medio que sirve como controles. Asignar aleatoriamente igual número de cachorros machos y hembras a cada grupo. Para diferenciar las crías sometidas a estimulación y los controles táctiles, marcar un grupo de cachorros con un marcador permanente sobre las patas traseras y la cola. Marcado tiene que volver a aplicar cada dos días. </li></ol> Estímulo Táctil <ol start="7"><li> Retire las presas de su jaula y colocarlos en una jaula temporal con comida y agua. Mantenga la presa y la jaula temporal en la sala de cría / vivienda. </li><li> Pesar crías de ratas como grupo antes de la sesión de estimulación táctil de la mañana (9:00 am). Para cada sesión, rata transporte cachorros sus jaulas a una sala de pruebas independiente para la estimulación táctil. Coloque la jaula de alojamiento en un cojín de la calefacción que se establece en 24 ° C. </li><li> Use una tabla rígida para dividir la jaula de alojamiento en dos mitades. Coloque las crías de rata en los estimulación grupo uno medio y control cachorros táctiles en la otra mitad.Establecer un temporizador a 15 min. </li><li> El uso de un plumero de pluma-como suave, cepille todos los cachorros en el grupo de estimulación táctil al mismo tiempo durante 15 minutos consecutivos. Los jóvenes cachorros de rata (~ P3-P12) ususally acurrucan juntos y parecen entrar en un ciclo de sueño profundo por lo que es muy fácil para estimular todos los cachorros a la vez. A medida que la edad de las crías, se vuelven más activas, con algunos cachorros caminar e investigar durante la sesión. El experimentador debe moverse continuamente cachorros errantes en el grupo para asegurar que cada cachorro recibe estímulo igual. </li><li> Una vez que la sesión de 15 minutos se ha completado, el transporte de las crías de nuevo a la sala de reproducción y volver a la madre a la jaula. </li><li> Repita este proceso tres veces al día durante los 19 días de la estimulación táctil. Después de la sesión de estimulación táctil final en P21, los cachorros deben ser destetados de sus madres. Los cachorros deben luego ser alojados en jaulas con 5 o 6 otros animales destetados del mismo sexo. </li><li> Si las ratas son sometidos a ninguna prueba adicional, se deben dejar sinperturbado, en la luz normal: oscuridad ciclo con acceso a alimentos y agua ad libitm (aparte de limpieza de la jaula regular y manipulación) hasta que alcanzan unos 100 días de edad. Si sufrir otras manipulaciones experimentales, los animales deben ser tratados o sometidos a pruebas de conformidad con esos protocolos de laboratorio. </li></ol> 2. Sacrificio y Golgi-Cox tinción <ol><li> Aproximadamente a P100, administrar una sobredosis de pentobarbital de sodio a través de la inyección IP a las ratas y perfunden intracardially con aproximadamente 100 ml de solución salina 0,9%. </li><li> Extraer el cerebro cuando la perfusión se ha completado. Retire el cerebro del cráneo, cortar el nervio óptico por debajo con esfuerzo para mantener intacto el cerebelo; investigadores pueden optar por mantener o eliminar los bulbos olfatorios. Coloque cerebros extraídos en una botella de Nalgene opaco con 20 ml de solución de Golgi-Cox 14. </li><li> Mantener el cerebro en la solución de Golgi-Cox durante 14 días. Después de 14 días, reemplace el Golgi-Csolución de buey con una solución de sacarosa al 30%. Mantener el cerebro en la solución de sacarosa durante 2-5 días antes de la sección. </li></ol> Nota: Si el cerebro no pueden ser seccionados dentro de los 14 días de la transferencia de la solución de sacarosa, el investigador tiene que sustituir la sacarosa con un nuevo balance de 30% de sacarosa. El investigador puede sustituir a la sacarosa cada dos semanas durante 4 meses, sin efectos adversos en la tinción. <ol start="4"><li> Con el fin de la sección del cerebro, el cerebro debe ser borrado en seco y se fija a la fase de seccionamiento con pegamento cyanocacrylic. Para evitar que se desgarre o seccionamiento desigual, el investigador debe tener cuidado y asegurarse de que todo el cerebro esté bien sujeta a los escenarios. </li><li> El depósito vibrátomo debe ser llenado con solución de sacarosa al 6% a un nivel que cubre la cuchilla de seccionamiento. Establezca los parámetros vibratome a una velocidad y amplitud a 5, (el punto medio en ambas escalas). Cortar el cerebro en 200 micras secciones y colocar las secciones en un micro gelatinizada 2%diapositiva alcance. Asegúrese de mantener las secciones húmeda durante el curso de la sección. </li><li> Cuando todas las secciones de interés han sido recogidos, pulse las secciones sobre los portaobjetos mediante la aplicación de presión a las diapositivas con papel secante humedecido. Almacenar los portaobjetos en una rejilla deslizante en la cámara de humedad hasta que estén listos para ser manchado. Deben permanecer en la cámara de humedad durante al menos 12 horas, pero no más de 4 días. Las diapositivas deben estar húmedo y no se debe permitir que se seque. </li><li> Preparar el regimiento se vea antes de comenzar el proceso de tinción. Etiqueta doce platos de tinción de vidrio (10,7 x 8,5 x 6,8 cm) y de proceso de la siguiente manera: <ol><li> Agua destilada - 1 min </li><li> Hidróxido de amonio - 30 min (en la oscuridad) </li><li> Agua destilada - 1 min </li><li> Kodak Fix for Film - 30 min (en la oscuridad) </li><li> Agua destilada - 1 min </li><li> 50% de alcohol - 1 min </li><li> 70% de alcohol - 1 min </li><li> 95% de alcohol - 1 min </li><li> 100% Alcohol - 5 min </li><li> 100% Alcohol - 5 min </li><li> Solución (1/3 del cloroformo, tercera HemoDe, tercera 100% de alcohol) - 15 min </li><li> HemoDe - 15 min </li></ol></li></ol> * Xileno se puede utilizar en sustitución de HemoDe. Con el fin de garantizar la calidad de la tinción consistente, las soluciones deben utilizarse para cada parrilla corrediza procesado. <ol start="8"><li> A raíz de los últimos 15 min emersión en HemoDe, cubreobjetos las diapositivas con Permount. </li><li> Deje que los portaobjetos se sequen al aire antes de examinar con un microscopio. </li></ol>

<ol><li>Mychasiuk, R., Ilnystkyy, S., Kovalchuk, O., Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensity+matters%3A+Brain%2C+behaviour%2C+and+the+epigenome+of+prenatally+stressed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intensity matters: Brain, behaviour, and the epigenome of prenatally stressed rats.</a> Neuroscience. 180, 105-110 (2011).</li>
<li>Muhammad, A., Carroll, C., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+during+development+alters+dendritic+morphology+in+the+nucleus+accumbens+and+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stress during development alters dendritic morphology in the nucleus accumbens and prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 216, 103-109 (2012).</li>
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<li>Rodrigues, A., Artneni, N., Abel, C., Zylbersztejn, D., Chazan, R., Viola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactile+stimulation+and+maternal+separation+prevent+hippocampal+damage+in+rats+submitted+to+neonatal+hypoxia-ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Tactile stimulation and maternal separation prevent hippocampal damage in rats submitted to neonatal hypoxia-ischemia.</a> Brain Research. 1002, 94-99 (2004).</li>
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<li>Muhammad, A., Hossain, S., Pellis, S., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactile+stimulation+during+development+attenuates+amphetamine+sensitization+and+structurally+reorganizes+prefrontal+cortex+and+striatum+in+a+sex-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tactile stimulation during development attenuates amphetamine sensitization and structurally reorganizes prefrontal cortex and striatum in a sex-dependent manner.</a> Behavioral Neuroscience. 125 (2), 161-174 (2011).</li>
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<li>Glaser, E. M., van der Loos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thick+brain+sections+by+obverse-reverse+computer+microscopy%3A+Application+of+a+new%2C+high+clarity+Golgi-Nissl+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: Application of a new, high clarity Golgi-Nissl stain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4, 117-125 (1981).</li>
<li>Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+vibratome+sectioning+of+Golgi-Cox+stained+whole+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 79, 1-4 (1998).</li>
<li>Meaney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+care%2C+gene+expression%2C+and+the+transmission+of+individual+differences+in+stress+reactivity+across+generations%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Maternal care, gene expression, and the transmission of individual differences in stress reactivity across generations.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 1161-1192 (2001).</li>
<li>Robinson, T. E., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+associated+with+exposure+to+drugs+of+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse.</a> Neuropharmacology. 47, Suppl 1. 33-46 (2004).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Debido a la plasticidad explícita del cerebro en desarrollo, es importante que los procedimientos experimentales con experiencias tempranas son revisados ​​a fondo y se hacen intentos de controlar todas las variables que intervienen. Por esta razón, un diseño de camada cruz se emplea durante el procedimiento de estimulación táctil para asegurar que los cachorros están recibiendo experiencias similares en todos los demás dominios de desarrollo. Además, también es importante que múltiples crías de varias camadas, se seleccionan para el análisis para evitar la posibilidad de que los efectos son el resultado de un sesgo en una sola cría o arena. Se cree que la estimulación táctil para imitar el comportamiento de la madre natural, lamiendo y aseo personal, que se cree que es beneficioso para el desarrollo de la descendencia. Aunque investigaciones anteriores han hecho hincapié en la primera semana de vida (P0-P7) es un período crítico para lamer y aseo 16, la magnitud del cambio se identificará según 18 días de tactile estimulación puede implicar que aunque existen momentos sensibles, la exposición ya es superior. También es importante tener en cuenta que los cachorros que recibieron estimulación táctil en este paradigma experimental también experimentan lamiendo y aseo por sus madres, por lo tanto, la estimulación táctil es en adición a la estimulación normal de administrado por la madre. Por último, también hay que ser conscientes de los cambios de región que dependen. Aunque la estimulación táctil durante el desarrollo de la mayor complejidad dendrítica en la corteza prefrontal, esto no garantiza que los cambios estructurales de esta naturaleza serán evidentes en todas las regiones del cerebro. Es posible que la morfología neuronal en otras regiones del cerebro tales como la corteza parietal, respondería de una manera notablemente diferente a la misma experiencia. Sin embargo, debido a que el procedimiento de estimulación táctil es fácil de administrar y no representa ningún riesgo para la descendencia o presas, tiene el potencial de servir como una herramienta valiosa para muchos estudios de investigación destinados a mejorar el desarrolloAl resultados. Con respecto a la tinción de Golgi-Cox de tejido cerebral, los pasos críticos para la visualización con éxito de células neuronales son los siguientes: 1) debe existir una adecuada perfusión del cerebro con solución salina. Perfusión inadecuada o insuficiente de los resultados de tejido cerebral en los artefactos de los vasos sanguíneos que hacen que sea difícil de visualizar en realidad células neuronales a través del laberinto de los vasos sanguíneos, al tiempo que complica la capacidad de fotografiar las neuronas teñidas. 2) cerebros perfundidos se deben almacenar en solución de Golgi-Cox y solución de sacarosa en la oscuridad. Almacenamiento del tejido cerebral en la oscuridad reduce la tinción de fondo del tejido, incrementando de nuevo la oportunidad de visualizar con éxito las células neuronales de calidad. 3) El tejido cerebral se almacena en solución de sacarosa tras el almacenamiento de 14 días en solución de Golgi-Cox. Cuando el tejido se sumerge en la solución de sacarosa al 30% durante 2-5 días, los cerebros son más flexibles que impide rompiendo y el desgarro de las secciones cuandode corte. Es importante evitar que el tejido cerebral de que queda en la solución de sacarosa para el aumento de períodos de tiempo (a menos que la solución de sacarosa se sustituye continuamente con solución fresca) porque el almacenamiento prolongado en sacarosa reduce la calidad de la tinción. 4) Por último, una vez que las diapositivas han sido manchada y cubierta deslizado, se les debe dar suficiente tiempo para secarse antes de la visualización con un microscopio. Si no están permitidas las diapositivas para ventilar adecuadamente seco, el tejido puede oscurecerse, reduciendo la visualización satisfactoria de las neuronas corticales. Se cree que los cambios estables en funcionamiento psicológico y las respuestas de comportamiento que se producen en respuesta a las experiencias para ser facilitado por la reorganización de la morfología neuronal y conectividad sináptica 17. Como estos cambios estructurales proporcionan un recurso medible para la plasticidad dependiente de la experiencia, el uso de un procedimiento de tinción fiable es importante. Procedimiento de tinción de Golgi-Cox basado Esta vibratome ofrece mancha fiableción de las ramas finas y las espinas dendríticas que pueden no ser evidentes con otros protocolos como celoidina-incrustación. El distintivo del procedimiento de Golgi-Cox se debe a su capacidad única para teñir una pequeña fracción de los elementos neuronales (1-10%), lo que permite el seguimiento de las neuronas individuales para las largas distancias. A pesar del hecho de que sólo una pequeña fracción de las neuronas están impregnadas con la tinción, las células que se representan visible, mantienen todas las características incluyendo cuerpo celular, dendritas, espinas dendríticas y axones. Por otra parte, cuando el procedimiento de tinción se lleva a cabo correctamente, las células teñidas se destacan con claridad y distinción sobre un fondo transparente, ya otras estructuras corticales permanecen sin teñir y transparente. Debido a la comprensión de que los cambios persistentes en funcionamiento hacia el exterior deben estar relacionados con la plasticidad del sistema nervioso, es decir, la capacidad de las neuronas para modificar su estructura y la conectividad, el procedimiento de tinción de Golgi-Cox proporciona a los investigadores unatécnica fiable para visualizar y cuantificar la plasticidad.

Aunque hay muchas técnicas notificados y utilizados para el examen de las primeras experiencias negativas en la maduración del cerebro, tales como el estrés perinatal 1,2, la privación sensorial 3, y la toxicidad de drogas 4, hay muy pocas metodologías empleadas para examinar los efectos de las experiencias positivas en este período de tiempo. Aparte de enriquecimiento ambiental, estimulación táctil es uno de los pocos cerebro mejora de los tratamientos con efectos demostrados 5. La estimulación táctil es un método de estimulación sensorial de la piel que imita el comportamiento de las ratas materna, lamiendo y aseo personal. Su aceptación general como una manipulación positiva surge de estudios que indican que la estimulación táctil mejora la maduración de los bebés prematuros y ratas recién nacidas 6. Además, la investigación en el laboratorio Meaney 7 ha demostrado que los niveles más altos de lamido de la madre y el aseo están vinculados a los resultados positivos en los hijos. Debido a Tinfluencias positivas stos, estimulación táctil evolucionaron rápidamente en una estrategia de recuperación destinado a reducir la ansiedad 8, la mejora de los resultados asociados con lesión cerebral 9-11, y atenuando la sensibilización de drogas 12. Como tal, la estimulación táctil es una técnica valiosa para la promoción de las primeras experiencias positivas, con una probada capacidad para reorganizar drásticamente la morfología neuronal y la conectividad sináptica del cerebro en desarrollo. Con el fin de examinar y cuantificar los cambios en la morfología neuronal, que es necesario para visualizar las neuronas intactas. El procedimiento de tinción de Golgi-Cox es una modificación de la técnica de Camillo Golgi publicado a finales de 1800 que proporciona tinción discreta de un pequeño número de neuronas completas 13. Aunque el procedimiento parece manchar las neuronas al azar y reproducibilidad se cita comúnmente como principal defecto, el permiso de pequeña tasa de impregnación visualización de todo el elemento neuronal, incluyendo cecuerpos ll, dendritas, espinas dendríticas y axones. Del mismo modo, el tiempo requerido para impregnar un cerebro dado con una solución de Golgi también ha sido citada como una caída. Sin embargo, dado que una vez que la tinción es tejido completa se puede conservar indefinidamente, y el tiempo entre la perfusión del cerebro y la visualización de las neuronas con un microscopio se puede completar en menos de 21 días, el período de tiempo no es irrazonable. Además, con modificaciones menores en el protocolo, la tinción de Golgi-Cox se puede utilizar eficazmente para impregnar cerebros de roedores de todos los rangos de edad. Como los cambios a nivel estructural se han relacionado con las modificaciones persistentes para el funcionamiento conductual y psicológica, la técnica de tinción de Golgi-Cox proporciona a los investigadores una herramienta valiosa para medir la neuroplasticidad.

<table><tbody><tr><td>Dicromato de potasio</td><td>Fisher</td><td>P188</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de mercurio</td><td>Fisher</td><td>M1561</td><td></td></tr><tr><td>cromato de potasio</td><td>Fisher</td><td>P220</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de amonio</td><td>Fisher</td><td>A669-500</td><td></td></tr><tr><td>Kodak Rapid Fix</td><td>Vistek</td><td>Kodak 146 4016</td><td></td></tr><tr><td>EtOH-95 & </td><td>Alcoholes comerciales anhidros</td><td>Sin números de gato</td><td>Todos los demás Et-OH son diluciones</td></tr><tr><td>Swiffers- Plumeros suaves como plumas</td><td>Safeway</td><td></td><td>Se puede encontrar en la mayoría de las tiendas de comestibles</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9378</td><td></td></tr><tr><td>HemoDe</td><td>Ciencias de Microscopía Electrónica</td><td>23410</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>Sp15</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td>VWR</td><td>160004-365</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>VWR</td><td>062011-9</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de los efectos de una experiencia inicial positiva, estímulo táctil, sobre dendríticas morfología sináptica y la conectividad con golgi-cox tinción

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Para generar cambios a largo plazo en el comportamiento, las experiencias deben estar produciendo cambios estables en la morfología neuronal y la conectividad sináptica. La estimulación táctil es una primera experiencia positiva que imita materno lamiendo y aseo en la rata. La exposición de las crías de rata a esta experiencia positiva se puede completar con facilidad y de manera rentable mediante el uso de materiales altamente accesibles, como un plumero hogar. Utilizando un diseño cruzado camada, los cachorros están bien acariciaron o molestar, durante 15 minutos, tres veces al día durante todo el período perinatal. Para medir los cambios neuroplásticos relacionados con esta primera experiencia positiva, se utiliza la tinción de Golgi-Cox del tejido cerebral. Debido al hecho de que de Golgi-Cox impregnación tiñe un número discreto de neuronas en vez de todas las células, la tinción del cerebro de roedores con solución de Golgi-Cox permite la visualización de elementos neuronales enteras, incluyendo el cuerpo celular, las dendritas, axones, y espinas dendríticas. El procedimiento de tinción is lleva a cabo durante varios días y requiere que el investigador prestar mucha atención a los detalles. Sin embargo, una vez que se haya completado la tinción, todo el cerebro se ha impregnado y puede ser conservada indefinidamente para el análisis en curso. Por lo tanto, la tinción de Golgi-Cox es un recurso valioso para el estudio de la experiencia que dependen de la plasticidad.

Cuando este procedimiento de tinción se ha seguido correctamente, se genera tinción coherente y uniforme de las dendritas y espinas. Ver Figura 1 para una representación de Golgi-Cox tinción neuronal. Este procedimiento produce tinción que es comparable a la recién desarrollado métodos in vitro y puede permitir la visualización de campos dendríticas que son ininterrumpida incrustación de tejido siguiente. La técnica basada vibrátomo para la tinción de Golgi-Cox se ha encontrado que produce tinción más generalizada de ramas terminales y las neuronas piramidales, que la tinción con cualquiera celoidina-incrustado y el tejido criostato-seccionada, 15. Además, ya que este método de tinción impregna todo el cerebro, todas las secciones pueden ser analizados ya sea inmediatamente o en el futuro. Como la ubicación del cambio morfológico es que no siempre es obvio cuando se genera una hipótesis original, este proceso permite la exploración de regiones cerebrales adicionales und impide la eliminación de tejido que puede ser útil en el futuro. Este método de tinción se puede utilizar para la tinción fiable de cualquier cerebros de ratas de edad (edad P0 de edad). Sin embargo, cuando la tinción de los cerebros jóvenes (&lt;1 gramo), el cerebro sólo debe permanecer en la solución de Golgi-Cox durante 6 días, en lugar de los 14 días recomendados para el cerebro adulto, todos los demás procedimientos se mantienen constantes. La principal dificultad que se pueden encontrar durante este proceso de tinción de Golgi-Cox es la incapacidad de producir la tinción de alta calidad de regiones centrales del cerebro, incluyendo el tálamo. Como todo el cerebro se impregna al mismo tiempo, las regiones centrales no pueden recibir las concentraciones ideales de mancha. A pesar de este hallazgo, la técnica de Golgi-Cox produce tinción excepcional de regiones subcorticales, tales como el hipocampo y el cuerpo estriado. Una limitación final del procedimiento surge de la eliminación incompleta de la sangre desde el cerebro durante el proceso de perfusión. La sangre puede producir artefactos en el tejido cerebraleso hace que sea difícil de fotografiar y trazar las neuronas. Técnicas de tinción de Golgi-Cox proporcionan una medida fiable de la morfología dendrítica y neuroanatomía que es útil para una amplia gama de estudios diseñados para examinar los cambios a nivel neuronal. Al examinar la estructura neuronal en la corteza prefrontal después de la estimulación táctil en el periodo postnatal temprano, la tinción de Golgi-Cox reveló un aumento espectacular en la complejidad dendrítica. Los cambios anatómicos relacionados con la estimulación táctil temprana se pueden demostrar visualmente mediante la comparación de la densidad de la espina dorsal de las neuronas piramidales de una rata de control para neuronas piramidales de una rata que se sometió a la estimulación táctil (véase la Figura 1). Además, los parámetros tales como la arborización dendrítica, la longitud dendrítica, y la densidad de la columna vertebral pueden ser calculados y analizados estadísticamente para generar datos continuo que puede ser comparado a través de los animales. Para generar resultados fiables, el análisis debe llevarse a cabo en la mañanainimum de tres animales por grupo de tratamiento y aproximadamente cinco neuronas por hemisferio debe ser seleccionado al azar para cada región del cerebro que se analiza. Figura 2 demuestra la complejidad dendrítica (espinas / m x m de dendritas) de los animales que recibieron la estimulación y los animales que no lo hicieron táctil . En los dos campos apicales y basales de las neuronas analizadas desde el córtex prefrontal medial (CG3), estimulación táctil se tradujo en la proliferación de los parámetros neuronales. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig1.jpg" /> Figura 1. Fotografía A. Representante de Golgi-Cox manchada neurona piramidal de la capa III de la zona CG3 en una rata que recibió estimulación táctil durante el desarrollo. B. Representante amplíe (1.000 X) fotografía de espinas dendríticas en las dendritas de terminales en el campo de la basilar CG3 ; la imagen más clara de la izquierda es para una rata en el grupo de control y la imagen más oscura en la RIght es de una rata que recibió estimulación táctil. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig2.jpg" /> Figura 2. Representación ilustrativa de la complejidad dendrítica apical y basilar media (espinas / m x m) para las neuronas en el área CG3 de ratas adultas que, o bien recibieron estimulación táctil durante el desarrollo o no lo hicieron (* p &lt;0,01).

En este trabajo se describen los procedimientos para la estimulación táctil de crías de rata y la posterior tinción de Golgi-Cox de la morfología neuronal. Estímulo táctil es una experiencia positiva que se administra en el periodo perinatal por acariciar cachorros con un plumero hogar. Tinción de Golgi-Cox es un procedimiento confiable que permite la visualización de las neuronas enteras.

Visualización de los Efectos de una experiencia inicial positiva, Estímulo Táctil, sobre dendríticas morfología sináptica y la conectividad con Golgi-Cox tinción

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar técnicas de tinción Gold G Cox para visualizar los cambios morfológicos en las neuronas que siguen a la estimulación táctil temprana en la vida. Esto se logra primero administrando la estimulación táctil tres veces al día desde el tercer día posnatal hasta el día posnatal 21. El segundo paso consiste en perfundir los animales cuando alcanzan la edad de estudio y almacenar sus cerebros en solución Goldy cos.A continuación, los cerebros se cortan con Aome. El paso final consiste en impregnar los cerebros con la técnica de tinción doble GOGI. En última instancia, el procedimiento GOGI co se utiliza para visualizar neuronas individuales, lo que permite el análisis de los cambios morfológicos.La belleza de la técnica de Goy Cox es que nos permite cuantificar la estructura de las neuronas y correlacionarla con resultados conductuales. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia los trastornos del desarrollo, ya que se ha demostrado que la estimulación táctil es eficaz tanto en la recuperación conductual como anatómica de estos trastornos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la neuroanatomía de las ratas, también puede aplicarse a otros organismos modelo y al tejido cerebral humano.Para ayudarnos a profundizar en la comprensión de la plasticidad dependiente de la experiencia, los animales se mantienen en un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, con acceso libre a alimento y agua tras el nacimiento. Cada rata hembra se aloja individualmente con su descendencia. Para evitar el estrés adicional relacionado con el manejo, las crías reciben estimulación táctil a partir del día P3.Después de pesar a las crías antes de la sesión matutina de estimulación táctil, transporte las crías en sus jaulas de origen a una sala de pruebas separada. Coloque la jaula de origen sobre una almohadilla calefactora ajustada a 24 grados Celsius. Cuando esté listo para la estimulación táctil, retire las madres de su jaula de origen y colóquelas en una jaula temporal con alimento y agua.Mantenga la presa y la jaula temporal en la sala de cría. A continuación, utilice una tabla rígida para dividir la jaula de cría en dos mitades. Luego asigne aleatoriamente a la mitad de las crías de cada camada para someterlas a estimulación táctil, mientras que la otra mitad servirá como control.Marque sus patas traseras y cola con un marcador permanente para diferenciar los grupos y coloque las crías del grupo de estimulación táctil en un lado de la jaula y las crías control en el otro. Configure un temporizador de 15 minutos utilizando una pluma suave como un plumero. Cepille todas las crías del grupo de estimulación táctil al mismo tiempo durante 15 minutos consecutivos.Las crías jóvenes de rata generalmente se agrupan y parecen entrar en un ciclo de sueño profundo, lo que facilita mucho estimular a todas las crías al mismo tiempo. A medida que las crías envejecen, se vuelven más activas, con algunas caminando e investigando. Durante la sesión, mueva cualquier cría errante hacia el grupo para asegurar que cada una reciba una estimulación equitativa.Después de 15 minutos de estimulación táctil, devuelva a la madre a la jaula y transporte la jaula de regreso a la sala de reproducción. Este proceso se repite tres veces al día durante 19 días. Después de la sesión final de estimulación táctil, separe a las crías de sus madres. Las crías se alojan en jaulas con otros cinco o seis animales destetados del mismo sexo y se dejan las ratas sin perturbar bajo condiciones estándar de alojamiento hasta que alcancen la edad de estudio.Las muestras se recogen cuando los animales alcanzan los 100 días de edad. Tras la eutanasia y la perfusión intracardiaca, se extrae el cerebro. Teniendo cuidado de mantener el cerebelo intacto.Coloque los cerebros en un frasco Nalgene opaco lleno con 20 mililitros de solución Goldy Cox, donde se mantendrán durante 14 días. Después de 14 días, sustituya la solución por una solución de sacarosa al 30%. Mantenga los cerebros en la solución de sacarosa durante dos a cinco días antes del corte histológico.Seque el cerebro antes de fijarlo a una plataforma de corte con pegamento acrílico Sano para evitar desgarros o cortes irregulares; asegúrese de que todo el cerebro esté firmemente sujeto a la plataforma. A continuación, llene el depósito del Vibram con solución de sacarosa al 6 % hasta que cubra la hoja de corte. Ajuste la velocidad y la amplitud del Vibram a cinco.Corte el cerebro en secciones de 200 micrones y coloque las secciones sobre un portaobjetos microscópico gelatinizado al 2%. Asegúrese de mantener las secciones húmedas durante todo el proceso de corte, una vez que se hayan recolectado todas las secciones de interés. Presione las secciones sobre los portaobjetos aplicando presión con papel absorbente humedecido.Coloque los portaobjetos en una rejilla para portaobjetos y guárdelos en una cámara de humedad durante al menos 12 horas, pero no más de cuatro días. Para comenzar el procedimiento de tinción, etiquete y prepare 12 recipientes de vidrio para tinción. Primero, sumerja los portaobjetos en agua destilada durante un minuto.A continuación, coloque los portaobjetos en hidróxido de amonio y déjelos en la oscuridad durante 30 minutos. Después de un minuto adicional en agua destilada, coloque los portaobjetos en el revelador Kodak durante 30 minutos con protección contra la luz. Coloque los portaobjetos nuevamente en agua destilada antes de deshidratarlos en una serie de soluciones alcohólicas de concentración creciente.Después del último lavado con alcohol, coloque los portaobjetos en una solución de un tercio durante 15 minutos. Por último, coloque los portaobjetos en hemo D durante 15 minutos. Cuando esté listo, use paramount para colocar las cubreobjetos sobre los portaobjetos y deje que sequen al aire antes de examinarlos con un microscopio.Aquí se muestra una fotografía representativa de una neurona parametal teñida con Golgi Cox en una rata que recibió estimulación táctil durante el desarrollo. Una fotografía ampliada muestra espinas dendríticas en las dendritas terminales. La imagen más clara de la izquierda corresponde a una rata del grupo control y la imagen más oscura corresponde a una rata que recibió estimulación táctil.Este gráfico representa la complejidad dendrítica apical y basal media de las neuronas en el área CG tres de ratas adultas que recibieron o no estimulación táctil durante el desarrollo. Al seguir este procedimiento, tenemos la ventaja de que, si deseamos formular preguntas adicionales, hemos tincionado todo el cerebro y, por lo tanto, podemos volver a utilizar el mismo tejido cerebral para responder esas preguntas. Al desarrollar estas técnicas, hemos allanado el camino para que los investigadores exploren la utilidad de la estimulación táctil como terapia para el tratamiento del trauma craneal u otras formas de lesión neurológica tras su desarrollo.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en neurociencia exploraran su potencial en la recuperación de traumas cerebrales y trastornos del desarrollo. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo proporcionar a las crías envueltas una experiencia enriquecedora de estimulación táctil, así como de un método para visualizar neuronas y sinapsis individuales.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Numerosos estudios recientes han identificado mutaciones en las proteínas sinápticas asociadas a patologías cerebrales. Primaria neuronas corticales cultivadas ofrecen una gran flexibilidad en el examen de los efectos de estas proteínas asociadas a la enfermedad en la morfología y motilidad de la espina dendrítica.

Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

Describimos dos métodos para la visualización y cuantificación de la arborización dendrítica en el hipocampo de modelos de ratón: imágenes en tiempo real y de profundidad de campo extendida. Mientras que el primer método permite un sofisticado trazado topográfico y la cuantificación de la extensión de la ramificación, el segundo permite una visualización rápida del árbol dendrítico.

Evaluación de la arborización dendrítica en el giro dentado de la región del hipocampo en ratones

Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de neuronas en la corteza retroesplenial de ratón utilizando microscopía in vivo de dos fotones en la línea transgénica Thy1-GFP. Este enfoque se combina con la inyección de virus adenoasociados que expresan mCherry en el hipocampo dorsal. Estas técnicas permiten el seguimiento a largo plazo de la plasticidad estructural dependiente de la experiencia en RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

Se presenta un protocolo por el método de tinción de Golgi-Cox en secciones de cerebro de espesor, con el fin de visualizar las neuronas con árboles dendríticos largas contenidos dentro de muestras de tejido individuales. También se presentan dos variantes de este protocolo que implica cresilo contratinción violeta, y la congelación de los cerebros no transformadas para almacenamiento a largo plazo.

Las neuronas de imágenes dentro de las secciones del cerebro gruesas, según el método de Golgi-Cox

Aquí presentamos un protocolo de Golgi-Cox en detalle extenso. Este método fiable de tinción de tejidos permite una evaluación de alta calidad de la citoarquitectura en el hipocampo, ya lo largo de todo el cerebro, con un mínimo de resolución de problemas.

Evaluación de la complejidad dendrítica del hipocampo en ratones envejecidos utilizando el método de Golgi-Cox

Este protocolo describe un método para la proyección de imagen simultánea de talamocorticales axon ramas y sinapsis formación en organotypic cocultures del tálamo y corteza cerebral. Axones individuales talamocorticales y sus terminales presinápticos se visualizan mediante una técnica de electroporación unicelular con DsRed y synaptophysin tagged GFP.

Visualización de axón talamocorticales ramificación y sinapsis formación en Organotypic Cocultures

Aquí describimos un método para visualizar la sinaptogénesis de las neuronas granulares en el cerebelo del ratón durante el curso del desarrollo cerebral postnatal cuando estas células refinan sus estructuras sinápticas y forman sinapsis para integrarse en el circuito cerebral general.

Utilización de electroporación postnatal in vivo para estudiar la morfología de la neurona del gránulo cerebeloso y el desarrollo de la sinapsis

El protocolo describe una modificación del método rápido de Golgi, que se puede adaptar a cualquier parte del sistema nervioso, para teñir las neuronas en el hipocampo y la corteza prefrontal medial de la rata.

Tinción rápida de Golgi para la visualización de la columna dendrítica en el hipocampo y la corteza prefrontal

Describimos aquí los métodos para inducir y analizar la remodelación dependiente de la experiencia olfativa de los glomérulos sinápticos del lóbulo antenal en el cerebro juvenil de Drosophila .

Remodelación dependiente de la experiencia de la conectividad sináptica de las neuronas sensoriales olfativas del cerebro juvenil en un período crítico de la vida temprana

El protocolo presentado describe el uso de microscopía electrónica de transmisión (TEM) para cuantificar los cambios circadianos en la corteza del barril del ratón, centrándose principalmente en el número de sinapsis y la morfología de la columna dendrítica.

Microscopía electrónica de transmisión como técnica de visualización para el análisis de la plasticidad sináptica circadiana en la corteza del barril del ratón

Aprende a visualizar cambios morfológicos neuronales tras estimulación táctil temprana en ratas usando tinción Golgi-Cox. Este método permite analizar complejidad dendrítica y plasticidad cerebral.

Visualización de los Efectos de una experiencia inicial positiva, Estímulo Táctil, sobre dendríticas morfología sináptica y la conectividad con Golgi-Cox tinción (Video) | JoVE Journal

Visualización de los Efectos de una experiencia inicial positiva, Estímulo Táctil, sobre dendríticas morfología sináptica y la conectividad con Golgi-Cox tinción

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