Visualización de los Efectos de una experiencia inicial positiva, Estímulo Táctil, sobre dendríticas morfología sináptica y la conectividad con Golgi-Cox tinción

El objetivo general de este procedimiento es utilizar técnicas de tinción Gold G Cox para visualizar los cambios morfológicos en las neuronas que siguen a la estimulación táctil temprana en la vida. Esto se logra primero administrando la estimulación táctil tres veces al día desde el tercer día posnatal hasta el día posnatal 21. El segundo paso consiste en perfundir los animales cuando alcanzan la edad de estudio y almacenar sus cerebros en solución Goldy cos.

A continuación, los cerebros se cortan con Aome. El paso final consiste en impregnar los cerebros con la técnica de tinción doble GOGI. En última instancia, el procedimiento GOGI co se utiliza para visualizar neuronas individuales, lo que permite el análisis de los cambios morfológicos.

La belleza de la técnica de Goy Cox es que nos permite cuantificar la estructura de las neuronas y correlacionarla con resultados conductuales. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia los trastornos del desarrollo, ya que se ha demostrado que la estimulación táctil es eficaz tanto en la recuperación conductual como anatómica de estos trastornos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la neuroanatomía de las ratas, también puede aplicarse a otros organismos modelo y al tejido cerebral humano.

Para ayudarnos a profundizar en la comprensión de la plasticidad dependiente de la experiencia, los animales se mantienen en un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, con acceso libre a alimento y agua tras el nacimiento. Cada rata hembra se aloja individualmente con su descendencia. Para evitar el estrés adicional relacionado con el manejo, las crías reciben estimulación táctil a partir del día P3.

Después de pesar a las crías antes de la sesión matutina de estimulación táctil, transporte las crías en sus jaulas de origen a una sala de pruebas separada. Coloque la jaula de origen sobre una almohadilla calefactora ajustada a 24 grados Celsius. Cuando esté listo para la estimulación táctil, retire las madres de su jaula de origen y colóquelas en una jaula temporal con alimento y agua.

Mantenga la presa y la jaula temporal en la sala de cría. A continuación, utilice una tabla rígida para dividir la jaula de cría en dos mitades. Luego asigne aleatoriamente a la mitad de las crías de cada camada para someterlas a estimulación táctil, mientras que la otra mitad servirá como control.

Marque sus patas traseras y cola con un marcador permanente para diferenciar los grupos y coloque las crías del grupo de estimulación táctil en un lado de la jaula y las crías control en el otro. Configure un temporizador de 15 minutos utilizando una pluma suave como un plumero. Cepille todas las crías del grupo de estimulación táctil al mismo tiempo durante 15 minutos consecutivos.

Las crías jóvenes de rata generalmente se agrupan y parecen entrar en un ciclo de sueño profundo, lo que facilita mucho estimular a todas las crías al mismo tiempo. A medida que las crías envejecen, se vuelven más activas, con algunas caminando e investigando. Durante la sesión, mueva cualquier cría errante hacia el grupo para asegurar que cada una reciba una estimulación equitativa.

Después de 15 minutos de estimulación táctil, devuelva a la madre a la jaula y transporte la jaula de regreso a la sala de reproducción. Este proceso se repite tres veces al día durante 19 días. Después de la sesión final de estimulación táctil, separe a las crías de sus madres. Las crías se alojan en jaulas con otros cinco o seis animales destetados del mismo sexo y se dejan las ratas sin perturbar bajo condiciones estándar de alojamiento hasta que alcancen la edad de estudio.

Las muestras se recogen cuando los animales alcanzan los 100 días de edad. Tras la eutanasia y la perfusión intracardiaca, se extrae el cerebro. Teniendo cuidado de mantener el cerebelo intacto.

Coloque los cerebros en un frasco Nalgene opaco lleno con 20 mililitros de solución Goldy Cox, donde se mantendrán durante 14 días. Después de 14 días, sustituya la solución por una solución de sacarosa al 30%. Mantenga los cerebros en la solución de sacarosa durante dos a cinco días antes del corte histológico.

Seque el cerebro antes de fijarlo a una plataforma de corte con pegamento acrílico Sano para evitar desgarros o cortes irregulares; asegúrese de que todo el cerebro esté firmemente sujeto a la plataforma. A continuación, llene el depósito del Vibram con solución de sacarosa al 6 % hasta que cubra la hoja de corte. Ajuste la velocidad y la amplitud del Vibram a cinco.

Corte el cerebro en secciones de 200 micrones y coloque las secciones sobre un portaobjetos microscópico gelatinizado al 2%. Asegúrese de mantener las secciones húmedas durante todo el proceso de corte, una vez que se hayan recolectado todas las secciones de interés. Presione las secciones sobre los portaobjetos aplicando presión con papel absorbente humedecido.

Coloque los portaobjetos en una rejilla para portaobjetos y guárdelos en una cámara de humedad durante al menos 12 horas, pero no más de cuatro días. Para comenzar el procedimiento de tinción, etiquete y prepare 12 recipientes de vidrio para tinción. Primero, sumerja los portaobjetos en agua destilada durante un minuto.

A continuación, coloque los portaobjetos en hidróxido de amonio y déjelos en la oscuridad durante 30 minutos. Después de un minuto adicional en agua destilada, coloque los portaobjetos en el revelador Kodak durante 30 minutos con protección contra la luz. Coloque los portaobjetos nuevamente en agua destilada antes de deshidratarlos en una serie de soluciones alcohólicas de concentración creciente.

Después del último lavado con alcohol, coloque los portaobjetos en una solución de un tercio durante 15 minutos. Por último, coloque los portaobjetos en hemo D durante 15 minutos. Cuando esté listo, use paramount para colocar las cubreobjetos sobre los portaobjetos y deje que sequen al aire antes de examinarlos con un microscopio.

Aquí se muestra una fotografía representativa de una neurona parametal teñida con Golgi Cox en una rata que recibió estimulación táctil durante el desarrollo. Una fotografía ampliada muestra espinas dendríticas en las dendritas terminales. La imagen más clara de la izquierda corresponde a una rata del grupo control y la imagen más oscura corresponde a una rata que recibió estimulación táctil.

Este gráfico representa la complejidad dendrítica apical y basal media de las neuronas en el área CG tres de ratas adultas que recibieron o no estimulación táctil durante el desarrollo. Al seguir este procedimiento, tenemos la ventaja de que, si deseamos formular preguntas adicionales, hemos tincionado todo el cerebro y, por lo tanto, podemos volver a utilizar el mismo tejido cerebral para responder esas preguntas. Al desarrollar estas técnicas, hemos allanado el camino para que los investigadores exploren la utilidad de la estimulación táctil como terapia para el tratamiento del trauma craneal u otras formas de lesión neurológica tras su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en neurociencia exploraran su potencial en la recuperación de traumas cerebrales y trastornos del desarrollo. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo proporcionar a las crías envueltas una experiencia enriquecedora de estimulación táctil, así como de un método para visualizar neuronas y sinapsis individuales.