Name: La disección y de montaje lateral de embriones de pez cebra: Análisis para el Desarrollo de la médula espinal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Aprende a disecar y montar embriones de Danio rerio para visualizar el desarrollo de la médula espinal mediante microscopía de fluorescencia y campo claro. Esta técnica permite estudiar la guía axonal y la diferenciación celular en neurobiología.

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Skidmore Facultad Donaciones para el Desarrollo financió la preparación y publicación de este manuscrito.

1. Montaje de los embriones (al término de técnica de visualización seleccionado, como la inmunocitoquímica, hibridación in situ, etc) <ol><li> Coloque los embriones de un plato Petri de 35 mm llena con tampón de elección (Figura 1A). La elección de tampón se basa en el procedimiento de etiquetado. Típicamente tampones basados ​​en PBS son adecuados. </li><li> Bajo un microscopio de disección, y el uso de fórceps, asegurar la cabeza con un par de pinzas mientras tira de la yema de distancia con el otro par (Figura 1B). Alternativamente, use un alfiler de insectos en un soporte de pasador de insectos para tirar suavemente la yema. </li><li> Usando el poker embrión (línea de pesca (0,41 mm de diámetro) pegado a cualquiera de un tubo capilar o una pipeta Pasteur) mover los embriones a una parte de la placa de Petri que no tiene una gran cantidad de restos de yema (figuras 1C-D). </li><li> Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio, aspirar los embriones en tan poco líquido como sea posible, y gtemente pipetear ellos en un portaobjetos (Figura 1E). </li><li> Suavemente absorber y expulsar el exceso de líquido utilizando un laboratorio toallita. Evite el contacto con los embriones. </li><li> Añadir una gota de medio de montaje a los embriones. Para etiquetas fluorescentes, utilice un reactivo Antifade de elección. Para señales colorimétricas, 70% de glicerol se puede utilizar como un medio de montaje. </li><li> Usando el poker embrión, oriente los embriones en sus lados en filas (Figura 1F). </li><li> Añadir una &quot;pizca&quot; de vaselina o grasa de alto vacío a cada esquina de un cubreobjetos (Figura 1G). Esto evita el daño del embrión a partir de una compresión excesiva. </li><li> Coloque el cubreobjetos (lado vaselina hacia abajo) en la parte superior de los embriones (Figura 1H). </li><li> Golpear suavemente el cubreobjetos en cada esquina hasta que los medios de montaje (70% de glicerol o reactivo de montaje anti-fade) está tocando el cubreobjetos (Figura 1H). </li><li> Si es necesario, agregar material de montaje con la pipeta justo al lado del coverslip, usando una pipeta en el intervalo de 20-200 ml. Se mecha bajo. </li><li> El uso de un laboratorio de limpiar, limpiar completamente todo el cubreobjetos. Asegúrese de no aplicar presión en el cubreobjetos, ya que podría dañar los embriones. Esta área debe estar seca y no tienen vaselina o medio de montaje sobre el mismo. </li><li> Utilice el esmalte de uñas para sellar alrededor del borde del cubreobjetos (Figura 1I). </li></ol>

<ol><li>Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+Dbx+genes+in+the+zebrafish+spinal%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal.</a> Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).</li>
<li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midline+crossing+is+not+required+for+subsequent+pathfinding+decisions+in+commissural+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons.</a> Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).</li>
<li>Ross, A. B. J. Activation of Wnt signaling using Lithium Chloride: Inquiry-Based Undergraduate Laboratory Exercises. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoss%2C+ABJ+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , In Press. (2012).</li>
<li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+patterning+are+mediated+independently+in+the+dorsal+spinal+cord+downstream+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proliferation and patterning are mediated independently in the dorsal spinal cord downstream of canonical Wnt signaling.</a> Dev. Biol. 313 (1), 398-407 (2008).</li>
<li>Gribble, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf3+inhibits+spinal+cord+neurogenesis+by+regulating+sox4a+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression.</a> Development. 136 (5), 781-789 (2009).</li>
<li>England, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Hedgehog+pathway+components+and+retinoic+acid+signalling+in+specifying+zebrafish+ventral+spinal+cord+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons.</a> Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).</li>
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<li>Lee, J. S., Ray, R., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+three+zebrafish+roundabout+homologs+suggest+roles+in+axon+guidance+and+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of three zebrafish roundabout homologs suggest roles in axon guidance and cell.</a> 221 (2), 216-230 (2001).</li>
<li>Downes, G. B., Waterbury, J. A., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+labeling+of+identified+zebrafish+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo labeling of identified zebrafish neurons.</a> Genesis. 34 (3), 196-202 (2002).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-regulated+oligodendrocyte+specification+from+radial+glia+in+the+spinal+cord+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Notch-regulated oligodendrocyte specification from radial glia in the spinal cord of zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 237 (8), 2081-2089 (2008).</li>
<li>Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+exposed+to+alcohol+undergo+abnormal+development+of+motor+neurons+and+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).</li>
<li>de Soysa, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macondo+crude+oil+from+the+Deepwater+Horizon+oil+spill+disrupts+specific+developmental+processes+during+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Macondo crude oil from the Deepwater Horizon oil spill disrupts specific developmental processes during zebrafish embryogenesis.</a> BMC Biol. 10 (40), (2012).</li>
<li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).</li>
<li>Deschene, E. R., Barresi, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Targeted+Embryonic+Chimeras%3A+Zebrafish+Gastrula+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (31), (2009).</li>
</ol>

No existen intereses económicos que compiten por cualquiera de autor.

Montaje lateral del pez cebra fija ayudas embriones visualización del desarrollo de la médula espinal. A través de la eliminación de la pelota yema de huevo, se reduce la distancia de trabajo requerido para imágenes microscópicas excepcional. Nuestros resultados representativos se limitan a la etapa 24 HPF, sin embargo, esta técnica se puede utilizar tan pronto como 18 HPF, aunque embriones anteriores son más difíciles de diseccionar debido al tamaño del embrión y la fragilidad del tejido. Esta técnica también es aplicable a los embriones de más de 24 HPF. Ayudado por la claridad óptica de la embriones de pez cebra, la capacidad de realizar pantallas adelante genéticos, genética inversa, y enfoques transgénicos, varios procesos de desarrollo pueden ser investigados. Esto incluye los índices mitóticos de progenitores neuronales con marcadores como BrdU y anti-fosfato histona marzo 4 a 6 y los patrones a través de la expresión de marcadores progenitoras neuronales y gliales en el pax, nkx, dbx, y familie oligs 1,4-6. Los reactivos que reportan determinación glial y neuronal (como la proteína glial fibrilar ácida (GFAP) y HuC / D) 1,4,5,10 se puede utilizar. Diferenciación subtipo neuronal puede ser analizada a través de la expresión de los islotes, vsx, engrailed y genes gata 1,4-6. Y, por último, el análisis de la orientación axón es posible a través de anticuerpos tales como anti-tubulina acetilada, 3A10 y ZNP-1 2,11,12. Aunque otros sistemas modelo de vertebrados (ratón y pollo) se utilizan para estudiar el desarrollo de la médula espinal, sólo el permiso de pez cebra visualización simultánea de todos los ejes de desarrollo en el embrión intacto. La limitación obvia de este enfoque es que los embriones se fijan, que excluye de imágenes en vivo. De hecho, la eliminación de (o daño a) los resultados de yema de huevo en la rápida muerte embrionaria, por lo que no es posible reducir la distancia de trabajo en embriones vivos utilizando esta técnica. Sin embargo, una gran ampliación de la médula coimágenes rd en embriones vivos es posible. Con el fin de preservar la yema durante de imágenes en vivo, los embriones se pueden colocar en las diapositivas de depresión, que proporcionan un espacio más grande entre la muestra y el cubreobjetos. Alternativamente, varios cubreobjetos de 22 mm x 22 mm se pueden pegar a cada diapositiva de un 3 en 1 x en portaobjetos de microscopio. Los cubreobjetos sirven como un &quot;puente&quot; para el cubreobjetos encima. Si los embriones son mayores de 18 HPF, tricaína se utiliza para anestesiar a los embriones para evitar el movimiento. Si bien se requiere una distancia de trabajo de 0,288 mm para los embriones deyolked en 24 HPF, cuando se trabaja con embriones vivos incrustados en agarosa, con yemas intactas, una lente microscópica con una distancia de trabajo de 3,3 mm es suficiente. Alternativamente, cultivos de explantes derivados a partir de embriones deyolked pueden ser visualizados utilizando una técnica de inmovilización coágulo de plasma 13. Varias poblaciones de células se pueden observar a través del uso de proteínas fluorescentes codificadas genéticamente, tales como GFP, mCherry, o el fotoconductortinte convertibles Kaede (por nombrar algunos). Además, las células marcadas con fluorescencia dentro de embriones quiméricos también se pueden ver con este enfoque 14. Una técnica de montaje consistente que es estable durante meses es una herramienta crítica para los biólogos celulares y de desarrollo. Esta técnica sencilla y reproducible, lo que permite una fácil comparación entre los diferentes ensayos experimentales. Además, la alineación de los embriones en filas permite fácilmente la identificación de los embriones específicos para su posterior análisis.

Visualización de la médula espinal en el pez cebra se inhibe por un número de factores. Debido al espesor de los somitas suprayacentes y la ubicación interna de la médula espinal, se requiere una distancia considerablemente larga de trabajo para alta resolución celular. El balón ha yema (que todavía está presente durante las primeras etapas de la neurogénesis) aumenta aún más la distancia de trabajo necesario, y se daña fácilmente con la presión de un cubreobjetos. Además, los restos de yema dañado prohíbe la visualización clara de los tejidos. Aunque son posibles secciones transversales en el eje (DV)-dorso-ventral, que no permiten fácilmente la visualización simultánea en el eje antero-posterior (AP) 1. Para superar estos obstáculos, los embriones se disecan y se montaron en portaobjetos. Este procedimiento proporciona varias ventajas. En primer lugar, embriones de pez cebra se encuentran fácilmente con la cara lateral hacia arriba, lo que facilita la visualización eje AP. En segundo lugar, la eliminación de la yema de BALl disminuye la distancia de trabajo requerido, y limita los escombros. En tercer lugar, este procedimiento de montaje permite por tanto fluorescente y microscopía de campo claro. En cuarto lugar, los embriones montados son estables durante meses a 4 ° C, lo que permite la visualización espécimen prolongado. Por último, la progresión del desarrollo se da en que los segmentos anteriores son más maduros que los segmentos posteriores. Con el fin de asegurar que por etapas hemisegments espinales emparejados se comparan entre embriones, que recubre el tejido somite se utiliza como una guía. Por ejemplo, la décima somite más posterior se superpone a la décima hemisegment espinal, que es equivalente de desarrollo en embriones de etapa con ajuste. Este procedimiento de montaje de los embriones intactos permite una fácil identificación de los somitas. Utilizamos la genética y genes tecnologías knock-down para estudiar los mecanismos de guiado de los axones en la médula espinal en desarrollo. En particular, se ha determinado que se requieren robo2, ROBO3 y DCC para comisural Asce PrimariaNding (COPA) pathfinding axón. Usando el procedimiento de montaje descrito aquí, hemos sido capaces de examinar el crecimiento ventral, cruce la línea media, ancho de comisura, dorsal y anterior 2,3 de crecimiento. Este procedimiento de montaje también se puede aplicar a DV o AP patrón de la médula espinal. Hemos utilizado este procedimiento para determinar los papeles dispares de efectores aguas abajo de Wnt en DV patrón de la médula espinal. El uso de este montaje, hemos sido capaces de obtener la resolución de los marcadores de DV en el nivel de células individuales, y determinar los cambios de modelado minutos como consecuencia de la alteración de recepción de señales Wnt 4,5. Este procedimiento de montaje también permite el cálculo del índice mitótico a través de anti-fosfohistona 3 o etiquetado BrdU (proliferación de progenitores) 5 diferenciación.

<table><tbody><tr><td>Placas de Petri de 35 mm x 10 mm</td><td>VWR</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td> Pinzas Dumont #3 </td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9839169</td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B22X22-1.5</td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td> SlowFade Gold </td><td>Fisher Scientific</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold </td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td> Vaselina </td><td>cualquier tienda de comestibles</td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Soportes de bucle </td><td>VWR</td><td>80094-482</td><td></td></tr><tr><td> Alfileres para insectos </td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td> Soportes de alfileres niquelados </td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>26016-12 </td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico Olympus</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr></tbody></table>

la disección y de montaje lateral de embriones de pez cebra: análisis para el desarrollo de la médula espinal

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

La médula espinal pez cebra es un modelo de investigación eficaz para la investigación del sistema nervioso por varias razones. En primer lugar, genética, transgénicos y de genes enfoques desmontables pueden ser utilizados para estudiar los mecanismos moleculares que subyacen desarrollo del sistema nervioso. En segundo lugar, las grandes garras de embriones de desarrollo sincronizados proporcionan grandes tamaños de muestras experimentales. En tercer lugar, la claridad óptica del embrión de pez cebra permite a los investigadores visualizar progenitoras, gliales, y poblaciones neuronales. Aunque los embriones de pez cebra son transparentes, espesor de la muestra puede impedir la visualización microscópica efectiva. Una razón para esto es el desarrollo en tándem de la médula espinal y el tejido somite suprayacente. Otra razón es la bola yema grande, que todavía está presente durante los períodos de la neurogénesis temprana. En este artículo, nos demuestran microdisección y la eliminación de la yema de embriones fijos, lo que permite la visualización microscópica, preservando el tejido circundante somito. Nosotros also demostrar montaje semipermanente de embriones de pez cebra. Esto permite la observación de neurodesarrollo en los ejes dorso-ventral y anterior-posterior, ya que conserva la tridimensionalidad del tejido.

Cuando elucidar los mecanismos que subyacen a diversos eventos de desarrollo tales como patrón celular, la diferenciación, y guía de axones, es importante ser capaz de visualizar las células en el contexto de su tejido. Defectos dorsoventral de modelado típicamente se presentan como un desplazamiento ventral o dorsal en el dominio de la expresión de factores de transcripción en el pax, nkx o familias dbx 4. A veces, los cambios pueden ser sutiles, que comprende sólo unos diámetros celulares 4. Análisis de corte transversal permite este tipo de análisis. Sin embargo, reactivos con las señales más débiles, o secciones transversales que no son perpendiculares al eje de AP pueden limitar la interpretación. Además, el análisis de la sección transversal no toma en cuenta fácilmente si los cambios persisten en el eje AP, y se basa en la disponibilidad de un criostato. Esta limitación se elude mediante vistas laterales de la médula espinal. Como se observa en la Figura 2B, Nkx6.1 ARNm es dISTRIBUIDO en aproximadamente la mitad ventral de la médula espinal en 24 horas después de la fecundación (HPF), dentro del dominio progenitora. Las células progenitoras son distinguibles de las células mitóticas mensaje debido a la presencia de la placa de piso, que se encuentra en la parte medial de la médula espinal. Visto con la óptica DIC, las células individuales son claramente distinguibles, y un límite definido entre la expresión y nonexpressing células es evidente. La salida del ciclo de células progenitoras se acompaña de cambios en la expresión génica. Por ejemplo, todas las neuronas post-mitóticas expresan HuC / D, que es detectable con 1,5 inmunocitoquímica. sondas de ARNm para los islotes, gata, y la familia VSX etiquetar las neuronas post-mitóticas específicos de posición coherente y número dentro de cada hemisegment médula espinal 6. Además, los receptores de orientación axón tales como los de la familia de robo se expresan en poblaciones restringidas de neuronas postmitóticas (Figura 2C) <sup&gt; 2,7,8. Montaje lateral de embriones permite conteos precisos de las neuronas post-mitóticas. Del mismo modo, los progenitores que continúan dividiendo pueden cuantificarse con anti-fosfato histona 3 inmunocitoquímica, así como el etiquetado BrdU. Además, la muerte celular se puede evaluar con TUNEL etiquetado 4-6. A las 24 HPF, los axones de las neuronas siguientes postmitóticas pueden visualizarse con varios métodos, y se distinguen en el único nivel celular: Dorsal Lateral Ascendente (Dola), comisurales Primaria ascendente (COPA), comisurales Secondary ascendente (COSA), ventral longitudinal Descendente (Veld), Kolmer-Agdur (KA), comisurales bifurcar / longitudinales (COB / L), circunferencial Ascendente (CIA), circunferencial Descendente (CID), y Unipolar comisural Descendente (CM subyacente), Rohon-Barba (RB), las neuronas motoras ( M) 9. Los axones se extienden desde estas neuronas en la parte dorsal, ventral, anterior y posterior direcciones. Ellos rama, cruzan la línea media, y salen tanto de la dorsaly ventral de la médula espinal. Cuando se combina con microscopía confocal de barrido láser, estos diversos comportamientos celulares son evidentes en los embriones montados lateralmente, usando inmunocitoquímica y proteínas fluorescentes codificadas genéticamente, tales como GFP 2. En la Figura 2D, se utilizó ZNP-1 inmunocitoquímica para etiquetar motoneuronas en desarrollo. Motoneuronas salen de la médula espinal ventral para inervar la musculatura que rodea el desarrollo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. La disección y lateral de montaje de embriones de pez cebra. (A) Después del procesamiento para inmunofluorescencia, hibridación in situ, etc, los embriones se colocan en un plato de Petri de 35 mm llena de PBT (PBS con 0,5% de Triton X-100) o PTW (PBS con 0,1% de Tween-20). La yemabola (YB) es evidente. (B) La yema se separa por asegurar la cabeza del embrión seguida de disección cuidadosa. (C) Un póquer embrión (línea de pesca pegado a una pipeta Pasteur) se utiliza para embriones separados y escombros yema de (D). Embriones limpiados se pipetean sobre un portaobjetos de microscopio (E) y alineados (F). Jalea (G) Petróleo se aplica a las esquinas de la cubreobjetos. (H) El cubreobjetos se coloca suavemente en la parte superior de los embriones en medio de montaje. Polaco (I) Nail se utiliza para sellar los bordes del cubreobjetos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2.jpg" width="500px" /> &lt;<html> strong&gt; Figura 2. Análisis de los patrones de expresión de genes y axón pathfinding en montado lateralmente embriones de pez cebra. (A) Dibujo de un embrión de pez cebra en 24 HPF. En BD, aproximadamente cuatro hemisegments por encima de la extensión del saco vitelino se visualizan (área del recuadro). (B) Nkx6.1 se expresa en la médula espinal ventral, incluyendo la placa de piso (FP). (C) ROBO3 se expresa en las neuronas postmitóticas (PMN). La placa de suelo y progenitor zona no es evidente en este plano focal más lateral. En B, C, la médula espinal está delimitado por un soporte en la parte izquierda de la imagen. (D) microscopía confocal se utilizó para la imagen ZNP-1 de inmunofluorescencia, que las etiquetas de los axones motores que salen de la médula espinal ventral. En todas las imágenes, es anterior a la izquierda y dorsal es hacia arriba. A larga distancia de trabajo 40x, la inmersión en agua (NA 0.8) lente se utilizó (3,3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Los procesos de desarrollo tales como la proliferación, el patrón, la diferenciación, y guía de axones se pueden modelar fácilmente en la médula espinal pez cebra. En este artículo se describe un procedimiento de montaje para los embriones de pez cebra, que optimiza la visualización de estos eventos.

La disección y de montaje lateral de embriones de pez cebra: Análisis para el Desarrollo de la médula espinal

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar y montar embriones de pez cebra para lograr una visualización microscópica óptima de la médula espinal. Esto se consigue primero mediante la disección microscópica y la eliminación de la bola de roble. El segundo paso consiste en eliminar los restos de roble y transferir los embriones mediante pipeta a un portaobjetos. A continuación, se retira cuidadosamente el exceso de líquido con una toallita Kim, seguido por la adición del medio de montaje. El paso final consiste en orientar los embriones sobre el portaobjetos con una aguja para embriones, seguido por la aplicación del cubreobjetos. Finalmente, se utiliza microscopía de fluorescencia o de campo brillante para mostrar la distribución de los cuerpos celulares postmitóticos y la trayectoria de los axones en desarrollo.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, como cuáles son los mecanismos responsables del patrón, la diferenciación y la guía axonal. Aunque este método puede proporcionar información sobre muchos aspectos del desarrollo del sistema nervioso, también se puede aplicar a otros tejidos, como el músculo en desarrollo. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se requiere realizar una disección bajo microscopio antes de comenzar el experimento.Prepare un punzón para embriones pegando una punta de pipeta a una pipeta usada y luego fijando un hilo de pesca a la punta de la pipeta. Para comenzar la disección del embrión, coloque hasta 30 embriones de pez cebra de 24 horas post-fecundación en una placa de Petri de 35 milímetros llena con PBS.Bajo un microscopio estereoscópico, sujete la cabeza de un embrión con un par de pinzas mientras retira el tejido circundante con una aguja para insectos. Luego, utilice la varilla para manipular embriones y traslade los embriones a una zona de la placa de Petri que no contenga muchos restos de vitelo. A continuación, aspire los embriones hacia una pipeta Pasteur de vidrio, aspirando la menor cantidad posible de líquido.Luego, pipetee suavemente hasta 21 embriones sobre un portaobjetos. Retire cuidadosamente el exceso de líquido usando una toallita de laboratorio, evitando tocar los embriones, y añada una gota de medio de montaje sobre los embriones. A continuación, utilice el punzón para embriones para colocarlos de lado en dos o tres filas.Ahora, agregue una pequeña cantidad de vaselina en cada esquina de un cubreobjetos. Gire el cubreobjetos de modo que el lado con la vaselina quede mirando hacia abajo y coloque el cubreobjetos encima de los embriones. La vaselina actúa para prevenir daños en los embriones causados por compresión excesiva.Toque suavemente la lámina cubreobjetos en cada esquina hasta que el medio de montaje toque la lámina, si es necesario, utilizando una pipeta en el rango de 20 a cien microlitros. Añada más medio de montaje junto a la lámina cubreobjetos y permita que el medio añadido se extienda por debajo de la lámina. A continuación, use una toalla de laboratorio para limpiar completamente alrededor de la lámina cubreobjetos.No aplique presión sobre la lámina de cubierta, ya que esto puede dañar los embriones; una vez limpiada adecuadamente, el área debe estar seca y libre de vaselina o medio de montaje. Termine utilizando esmalte de uñas para sellar los bordes de la lámina de cubierta. Después de montar los embriones de pez cebra, se visualizaron varios segmentos HEMI por encima de la extensión del saco de roble.Esta figura muestra la expresión de NK X 6.1 en la médula espinal ventral del embrión de pez cebra. El ARNm de NK X 6.1 se distribuye aproximadamente en la mitad ventral de la médula espinal a las 24 horas post-fecundación. Dentro del dominio de progenitores, las células progenitoras se distinguen de las células posmitóticas debido a la presencia de la placa del suelo, que se encuentra en la parte medial de la médula espinal.Observado con óptica DIC. Las células individuales son claramente distinguibles y se aprecia un límite definido entre las células que expresan y las que no expresan. La salida del ciclo celular en las células progenitoras va acompañada de cambios en la expresión génica.Esta imagen muestra la expresión de robo tres en neuronas posmitóticas. La familia de receptores robo son receptores de guía axonal cuya expresión permite realizar conteos precisos de neuronas posmitóticas. Tenga en cuenta que la placa del suelo y la zona de progenitores no son evidentes en este plano focal más lateral.Se utilizó microscopía confocal para obtener imágenes de inmunofluorescencia de znp uno, que marca los axones motores como se muestra en este embrión montado lateralmente. Las neuronas motoras salen del cordón espinal por la región ventral a las 24 horas post-fecundación para inervar la musculatura en desarrollo circundante. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 30 minutos si se lleva a cabo correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar preservar la integridad de los tejidos mediante una microdisección cuidadosa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar técnicas de microdisección para eliminar la yema de embriones de pez cebra con el fin de montarlos y visualizarlos mediante microscopía.

dissection-lateral-mounting-zebrafish-embryos-analysis-spinal-cord

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este vídeo, que muestran un método para analizar el cerebro de los vertebrados en desarrollo en embriones de pez cebra en vivo con una resolución única célula mediante microscopía confocal. Esto incluye el método por el cual se inyecta el embrión del pez cebra de una sola célula y, posteriormente, montar y obtener imágenes del cerebro en desarrollo.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

Después de la transección de la médula, el pez cebra adulto tenga la recuperación funcional a las seis semanas posteriores a la lesión. Para aprovechar las ventajas de la transparencia de las larvas y una recuperación más rápida, se presenta un método para seccionar la médula espinal de las larvas. Después de transección, se observa la recuperación sensorial a partir de los 2 días después de la lesión, y el movimiento C-doble por 3 días después de la lesión.

La transección de la médula espinal en el pez cebra larval

El embrión de pez cebra es un excelente modelo para la investigación de la biología del desarrollo. Durante la embriogénesis, el desarrollo de pez cebra con una masa de yema, que presenta retos en tres dimensiones para la observación de muestras y análisis. Este protocolo se describe cómo crear dos dimensiones planas montar preparaciones de todo el montaje in situ (WISH), teñidas muestras de embriones de pez cebra.

Preparativos Piso en observación y análisis de embrión de pez cebra muestras teñidas por todo el montaje<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

El método aquí descrito permite realizar un análisis cronológico del desarrollo de órganos en embriones de pez cebra mediante el uso de un microscopio de fluorescencia de disección capaces de realizar seccionamiento óptico y estrategias simples de reajuste para corregir la deriva focal y plana.

Análisis para el Desarrollo de riñón de pez cebra con time-lapse de uso de un microscopio de disección equipado para seccionamiento óptico

Aquí, presentamos un método de montaje versátil que permite la obtención de imágenes a largo plazo del desarrollo posterior del cuerpo de embriones vivos de pez cebra sin perturbar el desarrollo normal.

Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra

Este manuscrito describe métodos para registros electrofisiológicos de neuronas espinales de embriones de pez cebra y larvas. La preparación mantiene las neuronas in situ y a menudo implica la disección mínimo. Estos métodos permiten para el estudio electrofisiológico de una variedad de neuronas de la médula, de la adquisición inicial de la excitabilidad eléctrica a través de las primeras etapas larvales.

El pez cebra<em&gt; In Situ</em&gt; Médula Espinal Preparación para Registros electrofisiológicos de Spinal Sensory y neuronas motoras

Aquí, presentamos una serie estandarizada de protocolos para observar el surco ocular superior, una estructura recientemente identificadas, conservadas evolutivamente en el ojo vertebrado. Con larvas de pez cebra, demostramos técnicas necesarias para identificar los factores que contribuyen a la formación y cierre del surco ocular superior.

Visualización del surco Ocular Superior durante la embriogénesis de Danio rerio

Aquí describimos un método para reducir el tamaño de los embriones de pez cebra sin interrumpir los procesos normales de desarrollo. Esta técnica permite el estudio de la escala del patrón y la robustez del desarrollo contra el cambio de tamaño.

Reducción de tamaño quirúrgico del pez cebra para el estudio de la escala de patrón embrionario

Este artículo describe un método para montar embriones frágiles de pez cebra para microscopía confocal de lapso de tiempo extendido. Este método de bajo costo es fácil de realizar utilizando platos regulares de microscopía de fondo de vidrio para obtener imágenes en cualquier microscopio invertido. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones.

Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Aquí, presentamos el protocolo para el cultivo de tejidos 3-D del eje posterior del cuerpo del pez cebra, lo que permite el estudio en vivo de la segmentación de vertebrados. Este modelo de explant proporciona control sobre el alargamiento del eje, alteración de las fuentes de morfógenos y obtención de imágenes vivas a nivel de tejido de resolución subcelular.

Un cultivo de explantes de cola 3-D para estudiar la segmentación de vertebrados en el pez cebra

Aquí, presentamos un método para alinear y crioseccionar múltiples muestras de larvas de pez cebra (Danio rerio) y recolectarlas en un solo portaobjetos para el análisis transcriptómico espacial.

Disposición espacialmente compacta de secciones de larvas de pez cebra para análisis transcriptómico espacial

Aprende a disecar y montar embriones de Danio rerio para visualizar el desarrollo de la médula espinal mediante microscopía de fluorescencia y campo claro. Esta técnica permite estudiar la guía axonal y la diferenciación celular en neurobiología.

La disección y de montaje lateral de embriones de pez cebra: Análisis para el Desarrollo de la médula espinal

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