La disección y de montaje lateral de embriones de pez cebra: Análisis para el Desarrollo de la médula espinal

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar y montar embriones de pez cebra para una visualización microscópica óptima de la médula espinal. Esto se logra primero diseccionando y retirando la bola de roble. El segundo paso es eliminar los restos de roble y pipetear los embriones en un portaobjetos.

A continuación, el exceso de líquido se elimina cuidadosamente con una toallita Kim, seguido de la adición de medio de montaje. El paso final es orientar los embriones en el portaobjetos con un atizador de embriones, seguido de la aplicación del cubreobjetos. En última instancia, la fluorescencia o la microscopía de campo claro se utiliza para mostrar la distribución de los cuerpos celulares postmitóticos y la trayectoria de los axones en desarrollo.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, como cuáles son los mecanismos responsables del patrón, la diferenciación y la guía de los axones. Aunque este método puede proporcionar información sobre muchos aspectos del desarrollo del sistema nervioso, también se puede aplicar a otros tejidos, como el músculo en desarrollo. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se requiere una disección bajo un microscopio antes de comenzar el experimento.

Haga un atizador de embriones pegando una punta de pipeta a una pipeta pasada y luego pegando un hilo de pescar a la punta de la pipeta. Para comenzar la disección embrionaria, coloca hasta 30 embriones de pez cebra. Edad 24 horas después de la fertilización en una placa de Petri de 35 milímetros llena de PBS.

Bajo un microscopio de disección, asegura la cabeza de un embrión con un par de pinzas mientras tiras del roble con un alfiler para insectos. Luego use el atizador de embriones para mover los embriones a una parte de la placa de Petri que no tenga muchos restos de yema. A continuación, aspire los embriones en una pipeta de vidrio para pasturas extrayendo la menor cantidad de líquido posible.

A continuación, pipetea suavemente hasta 21 embriones en un portaobjetos. Absorba con cuidado el exceso de líquido con una toallita de laboratorio evitando tocar los embriones, y luego agregue una gota de medio de montaje a los embriones. A continuación, use el atizador de embriones para orientar los embriones de lado en dos o tres filas.

Ahora, agregue un poco de vaselina en cada esquina de un cubreobjetos. Gire el cubreobjetos de modo que el lado con la vaselina quede hacia abajo y coloque el cubreobjetos encima de los embriones. La vaselina actúa para evitar daños en los embriones por una compresión excesiva.

Golpee suavemente el cubreobjetos en cada esquina hasta que el medio de montaje toque el cubreobjetos si es necesario, utilizando una pipeta en el rango de 20 a cien microlitros. Agregue más medios de montaje junto al cubreobjetos y permita que los medios agregados se absorban por debajo del cubreobjetos. Ahora, use una toallita de laboratorio para limpiar completamente alrededor de la cubierta.

No aplique presión sobre el cubreobjetos, ya que esto puede dañar los embriones cuando se limpia adecuadamente, el área está seca y no tiene vaselina ni medios de montaje. Termine usando esmalte de uñas para sellar alrededor de los bordes del cubreobjetos. Después de montar los embriones de pez cebra, se visualizaron varios segmentos HEMI por encima de la extensión del saco de roble.

Esta figura muestra la expresión de NK X 6.1 en la médula espinal ventral del embrión de pez cebra. El ARNm NK X 6.1 se distribuye aproximadamente en la mitad ventral de la médula espinal a las 24 horas después de la fertilización. Dentro del dominio progenitor, las células progenitoras se distinguen de las células postmitóticas debido a la presencia de la placa del suelo, que se encuentra en la parte medial de la médula espinal.

Visto con óptica DIC. Las células individuales se distinguen claramente y es evidente un límite definido entre las células que se expresan y las que no lo expresan. La salida del ciclo celular progenitor se acompaña de cambios en la expresión génica.

Esta imagen muestra la expresión de robo tres en neuronas postmitóticas. La familia de receptores robo son receptores de guía de axones cuya expresión permite recuentos precisos de neuronas postmitóticas. Nótese que la placa del suelo y la zona progenitora no son evidentes en este plano focal más lateral.

Se utilizó microscopía confocal para obtener imágenes de la inmunofluorescencia znp one, que marca los axones motores como se muestra en este embrión montado lateralmente. Las neuronas motoras salen de la médula espinal ventralmente a las 24 horas después de la fertilización para inervar la musculatura circundante en desarrollo. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 minutos si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar preservar la integridad de los tejidos a través de una microdisección cuidadosa. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar las técnicas de microdisección para extraer la yema de embriones de pez cebra para el montaje y la visualización microscópica.