La disección y de montaje lateral de embriones de pez cebra: Análisis para el Desarrollo de la médula espinal

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar y montar embriones de pez cebra para lograr una visualización microscópica óptima de la médula espinal. Esto se consigue primero mediante la disección microscópica y la eliminación de la bola de roble. El segundo paso consiste en eliminar los restos de roble y transferir los embriones mediante pipeta a un portaobjetos.

A continuación, se retira cuidadosamente el exceso de líquido con una toallita Kim, seguido por la adición del medio de montaje. El paso final consiste en orientar los embriones sobre el portaobjetos con una aguja para embriones, seguido por la aplicación del cubreobjetos. Finalmente, se utiliza microscopía de fluorescencia o de campo brillante para mostrar la distribución de los cuerpos celulares postmitóticos y la trayectoria de los axones en desarrollo.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, como cuáles son los mecanismos responsables del patrón, la diferenciación y la guía axonal. Aunque este método puede proporcionar información sobre muchos aspectos del desarrollo del sistema nervioso, también se puede aplicar a otros tejidos, como el músculo en desarrollo. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se requiere realizar una disección bajo microscopio antes de comenzar el experimento.

Prepare un punzón para embriones pegando una punta de pipeta a una pipeta usada y luego fijando un hilo de pesca a la punta de la pipeta. Para comenzar la disección del embrión, coloque hasta 30 embriones de pez cebra de 24 horas post-fecundación en una placa de Petri de 35 milímetros llena con PBS.

Bajo un microscopio estereoscópico, sujete la cabeza de un embrión con un par de pinzas mientras retira el tejido circundante con una aguja para insectos. Luego, utilice la varilla para manipular embriones y traslade los embriones a una zona de la placa de Petri que no contenga muchos restos de vitelo. A continuación, aspire los embriones hacia una pipeta Pasteur de vidrio, aspirando la menor cantidad posible de líquido.

Luego, pipetee suavemente hasta 21 embriones sobre un portaobjetos. Retire cuidadosamente el exceso de líquido usando una toallita de laboratorio, evitando tocar los embriones, y añada una gota de medio de montaje sobre los embriones. A continuación, utilice el punzón para embriones para colocarlos de lado en dos o tres filas.

Ahora, agregue una pequeña cantidad de vaselina en cada esquina de un cubreobjetos. Gire el cubreobjetos de modo que el lado con la vaselina quede mirando hacia abajo y coloque el cubreobjetos encima de los embriones. La vaselina actúa para prevenir daños en los embriones causados por compresión excesiva.

Toque suavemente la lámina cubreobjetos en cada esquina hasta que el medio de montaje toque la lámina, si es necesario, utilizando una pipeta en el rango de 20 a cien microlitros. Añada más medio de montaje junto a la lámina cubreobjetos y permita que el medio añadido se extienda por debajo de la lámina. A continuación, use una toalla de laboratorio para limpiar completamente alrededor de la lámina cubreobjetos.

No aplique presión sobre la lámina de cubierta, ya que esto puede dañar los embriones; una vez limpiada adecuadamente, el área debe estar seca y libre de vaselina o medio de montaje. Termine utilizando esmalte de uñas para sellar los bordes de la lámina de cubierta. Después de montar los embriones de pez cebra, se visualizaron varios segmentos HEMI por encima de la extensión del saco de roble.

Esta figura muestra la expresión de NK X 6.1 en la médula espinal ventral del embrión de pez cebra. El ARNm de NK X 6.1 se distribuye aproximadamente en la mitad ventral de la médula espinal a las 24 horas post-fecundación. Dentro del dominio de progenitores, las células progenitoras se distinguen de las células posmitóticas debido a la presencia de la placa del suelo, que se encuentra en la parte medial de la médula espinal.

Observado con óptica DIC. Las células individuales son claramente distinguibles y se aprecia un límite definido entre las células que expresan y las que no expresan. La salida del ciclo celular en las células progenitoras va acompañada de cambios en la expresión génica.

Esta imagen muestra la expresión de robo tres en neuronas posmitóticas. La familia de receptores robo son receptores de guía axonal cuya expresión permite realizar conteos precisos de neuronas posmitóticas. Tenga en cuenta que la placa del suelo y la zona de progenitores no son evidentes en este plano focal más lateral.

Se utilizó microscopía confocal para obtener imágenes de inmunofluorescencia de znp uno, que marca los axones motores como se muestra en este embrión montado lateralmente. Las neuronas motoras salen del cordón espinal por la región ventral a las 24 horas post-fecundación para inervar la musculatura en desarrollo circundante. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 30 minutos si se lleva a cabo correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar preservar la integridad de los tejidos mediante una microdisección cuidadosa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar técnicas de microdisección para eliminar la yema de embriones de pez cebra con el fin de montarlos y visualizarlos mediante microscopía.