Name: Aislamiento de tejido adiposo células inmunes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Aprende a aislar células inmunes de tejido adiposo mediante digestión con colagenasa y centrifugación diferencial. Este método permite cuantificar macrófagos y linfocitos T por citometría de flujo para estudiar enfermedades inmunometabólicas.

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JSO se apoya en un NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), Alaska con el apoyo de una beca posdoctoral de la Asociación Americana de Diabetes (7-10-MI-05), y AHH se apoya en un American Heart Association Fundada Investigator Award (12EIA8270000). Experimentos de citometría de flujo se realizaron en el Flujo VMC Citometría de recursos compartidos. El VMC Citometría de flujo de recursos compartidos con el apoyo del Centro de Investigación de Enfermedades Digestivas Vanderbilt (DK058404).

1. Reactivos y suministros Antes de iniciar este protocolo experimental, se preparan los siguientes reactivos: <ol><li> Etanol al 70% </li><li> 1X PBS </li><li> 1X DPBS (sin Ca y Mg) suplementado con 0,5% de BSA </li><li> Tampón FACS: 1X DPBS (sin Ca y Mg), 2 mM de EDTA, y 1% de FCS </li><li> Tampón ACK: 150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO3, y 0,1 mM Na 2 EDTA en agua </li></ol> 2. Recolección y Preparación de tejido adiposo <ol><li> La eutanasia a los ratones de acuerdo con los procedimientos aprobados IACUC específicos de cada institución. </li><li> Mojar bien la piel con etanol al 70%. </li><li> Hacer una incisión a nivel de la apófisis xifoides (parte inferior del esternón) y abrir la cavidad torácica para exponer el corazón, con cuidado de no romper los vasos sanguíneos principales. </li></ol> Nota: En este punto, también es útil para salir de la membrana intacta tanto comoposible y para cortar una muesca de la parte derecha de la caja torácica para permitir que la sangre y el líquido de perfusión a fluir fuera de la cavidad torácica. <ol start="4"><li> Clip de la aurícula derecha para permitir que la sangre y el líquido de perfusión para escapar del sistema circulatorio. </li></ol> Nota: Cuando se trata de ratones obesos, el exceso de pericardio AT puede necesitar ser retirado para permitir el acceso al corazón. <ol start="5"><li> Sujete el corazón con pinzas e inserte suavemente una aguja en el ventrículo izquierdo a través del ápice. Lentamente perfundir el ratón con 15 ml de PBS estéril. </li></ol> Nota: Reducir la tasa de perfusión si los pulmones comienzan a llenarse y ampliar. <ol start="6"><li> Abra la cavidad peritoneal y eliminar las bolsas de grasa perigonadal con cuidado para evitar cualquier tejido gonadal. </li><li> Colocar almohadillas de grasa en un barco pesan en hielo que contiene 2 ml de 1X DPBS (sin Mg o Ca) suplementado con 0,5% de BSA, y pelos en el AT en trozos finos. </li></ol>Nota: Limite la cantidad de AT por barco pesa 1,2 g. Si la cantidad de AT supera 1,2 g, se divide en partes iguales entre dos barcos pesan. <ol start="8"><li> Mantenga AT muestras en hielo y preparar 3 ml de solución de digestión colagenasa por AT muestra formada por 1X DPBS complementado con 0,5% de BSA, 10 mM CaCl 2 y 4 mg / ml de colagenasa tipo II. </li></ol> 3. Digestión con colagenasa <ol><li> Transferencia de AT a tubos cónicos de 50 ml mediante el vertido de la homogeneizado y enjuagar el barco sopesar con 1 ml de DPBS (0,5% de BSA) y 3 ml de solución de digestión de colagenasa II. </li><li> Incubar a homogeneizado en un agitador rotatorio (200 rpm) a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Añadir 10 ml de DPBS (0,5% BSA) para tubos cónicos y colocar en hielo. </li><li> Se tritura homogeneizado numerosas veces usando una pipeta de 10 ml serológica, y pasar las suspensiones celulares a través de filtro de 100 micras para un nuevo tubo cónico de 50 ml. </li><li> Centrifugar la suspensión de células a 500 xg durante 10 min a 4 y dpor ejemplo, C. </li><li> Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células SVF en 3 ml de tampón de lisis ACK de eritrocitos contaminantes. </li><li> Añadir 12 ml de tampón FACS y la suspensión de células se centrifuga a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células SVF en tampón FACS. </li></ol> Nota: Utilice el tamaño del sedimento celular como una guía para la cantidad de tampón FACS para volver a suspender pulg Si el sedimento celular cubre la parte inferior del tubo de 50 ml cónico, utilizar 0,5-1 ml de tampón FACS, de lo contrario, volver a suspender en 0.25-0.5 ml. <ol start="9"><li> Colocar las muestras en hielo y se preparan partes alícuotas de la dilución 1:10 de cada muestra para recuento de células mediante la mezcla de 40 l de tampón FACS, 50 l solución de azul de tripano (0,2%), y 10 l de suspensión celular. </li><li> Contar las células viables basándose en la exclusión de azul de tripano y se diluye suspensiones de células a una concentración final de 5-10 x 10 6 células / ml. </li></ol> 4. La tinción de antígenos de superficie celular <ol&gt; <li> Añadir anti-ratón CD16/CD32 anticuerpo (Fc bloque) a una concentración final de 0,5-1 μg/10 6 células, y se incuba en hielo durante 10 min. </li><li> Muestras de Transferencia (≥ 10 6 células) a 12 tubos de fondo redondo de 75 mm de poliestireno. Preparar tubos separados que si el análisis de las células T y cajeros automáticos, y combinar células adicionales para preparar un número suficiente de tubos para acomodar la compensación requerida y la fluorescencia modificado menos uno (FMO) controles. </li></ol> Nota: Como un ejemplo, cuando la cuantificación de la proporción de cajeros automáticos basado en F4/80 y CD11b, la siguiente compensación y controles FMO tendrá que ser preparado: - Unstained (células) - DAPI o yoduro de propidio (PI) de manchas individuales (células; no agregan tintes viabilidad hasta el paso 5.1) - F4/80 APC (células o perlas de compensación) individuales mancha - FITC células individuales o mancha (CD11bcuentas de compensación) - FMO 1 (células): rata IgG2a κ isotipo de control APC + CD11b FITC + tinte viabilidad (añadido en el paso 5.1) - FMO 2 (células): F4/80 APC + rata IgG2b κ isotipo de control FITC + tinte de viabilidad (añadido en el paso 5.1) <ol start="3"><li> Añadir anticuerpos primarios conjugados con fluoróforo y / o controles de isotipo a la concentración apropiada (véase la Tabla de reactivos y materiales). </li><li> Proteger muestras de la luz y se incuba a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Añadir 2 ml de tampón FACS y la suspensión de células se centrifuga a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Se decanta el sobrenadante y resuspender el pellet de células SVF en 2 ml de tampón FACS. </li><li> Centrifugar la suspensión celular 500 xg durante 5 min a 4 ° C, y resuspender el sedimento celular en SVF ≥ 400 l de tampón FACS. </li><li> Transferir las muestras a 12 mm de poliestireno x 75 tubos de fondo redondo equipado con un 35 blusas de tubo colador de células m.</li><li> Proteger de la luz, y las muestras se almacenan a 4 ° C hasta el análisis FACS. </li></ol> Nota: Para obtener resultados óptimos, las células deben ser analizados Golden Retriever, sin embargo, el análisis FACS con este protocolo se ha realizado con éxito en células marcadas almacenadas en tampón FACS durante 1-2 horas a 4 ° C. Si las células necesitan para ser fijado a aumentar el tiempo de almacenamiento, las células marcadas pueden ser fijadas con paraformaldehído al 2% a 4 ° C durante 24 horas antes del análisis FACS. Empresas anticuerpos sugieren que las células marcadas se pueden almacenar durante hasta una semana, sin embargo, esto no ha sido probado en el marco de este procedimiento. 5. Análisis FACS <ol><li> Antes del análisis FACS, añadir colorante viabilidad de las muestras y los controles adecuados para permitir la discriminación de células vivas / muertas. </li></ol> Nota: Numerosos colorantes de viabilidad están disponibles comercialmente, pero DAPI y PI se recomiendan en función de la prof excitación / emisiónIles de los anticuerpos conjugados con fluoróforo se utilizan. DAPI y yoduro de propidio se añadieron a cada muestra a una concentración final de 0,2 mg / ml. <ol start="2"><li> Utilice una muestra de control negativo sin teñir, preferiblemente células aisladas a partir del mismo tejido que las muestras experimentales, para ajustar la dispersión lateral (SSC) y la dispersión hacia adelante (FSC) de modo que la población de células (s) de interés están en escala. </li></ol> Nota: Para el análisis de AT células SVF, se recomienda que la CSS se muestra en una escala logarítmica frente a FSC en una escala lineal. El uso de una escala logarítmica para SSC es especialmente importante en el análisis de los cajeros automáticos, que a menudo son muy grandes y granulares. <ol start="3"><li> Dibuja una puerta de dispersión de la luz inicial basada en el tipo de célula (s) que se analiza, y ajustar el tubo fotomultiplicador (PMT) de ganancia para que las células no teñidas se encuentran en el extremo izquierdo de un histograma de un solo parámetro (aproximadamente centrado en 10 2) por los cauces adecuados. &lt;/ Li&gt; </ol> Nota: Se recomienda que los linfocitos y los macrófagos (u otras células mieloides) se analizaron por separado debido a las diferencias en la autofluorescencia. <ol start="4"><li> Utilice los controles de manchas individuales o anticuerpos cuentas de compensación de captura para realizar la compensación de varios colores. </li></ol> Nota: Se recomienda el uso de cuentas de compensación, sin embargo, se debe garantizar la compatibilidad de cada anticuerpo. Por ejemplo, los granos de compensación pueden no reaccionar de forma cruzada con anticuerpos de conejo, en cuyo caso se requieren células aisladas para obtener un control de mancha única apropiada. <ol start="5"><li> Establezca puertas experimentales basados ​​en controles FMO modificados. </li><li> Ajuste el citómetro de flujo para recoger la cantidad apropiada de eventos en función de la prevalencia de la población de interés y registrar los datos experimentales. </li><li> Exportar archivos de datos FCS para el análisis fuera de línea. Existen numerosos programas disponibles para cytometr flujoy análisis de datos. Recomendamos Cytobank, una plataforma basada en la web que permite a los investigatores para almacenar y analizar datos y generar datos desde cualquier computadora con acceso a Internet 18. Además, Cytobank ofrece la posibilidad de poner a disposición pública los datos o restringir el acceso a los colaboradores. </li></ol>

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</ol>

No tenemos nada que revelar.

El creciente interés en el papel del sistema inmune en las consecuencias metabólicas de la obesidad ha llevado al uso generalizado de citometría de flujo para caracterizar las células inmunes de la AT. Aunque el protocolo exacto varía entre los laboratorios en base a su propia experiencia y los equipos disponibles, los pasos críticos incluyen la digestión colagenasa, centrifugación diferencial, y la superficie de la célula etiquetado antígeno. El objetivo del presente artículo es proporcionar un protocolo detallado y gu...

Históricamente, el tejido adiposo (AT) ha sido considerada como un órgano inerte de almacenamiento de lípidos, que se expande y contrae en respuesta al balance energético. Ahora entendemos que AT representa un órgano endocrino que segrega dinámica activamente una serie de hormonas, que influyen directamente en el comportamiento de alimentación y sistémicos homeostasis de la glucosa. Además, durante la última década ha habido un reconocimiento creciente de los numerosos poblaciones de células inmunes residentes en el AT fracción del estroma vascular (SVF), así como su contribución a la homeostasis de AT. La capacidad de separar la AT adipocitos y SVF usando una colagenasa digestión seguido de centrifugación diferencial fue descrito por primera vez por Rodbell en 1964 1. Colagenasa II es la más utilizada para la separación de los adipocitos y SVF debido al mantenimiento de los receptores de insulina adipocitos 1. Desde el principio, el fraccionamiento enzimático de AT fue empleado principalmente para estudiar AdipoCYTE metabolismo y aislar preadipocitos. Más recientemente, esta técnica, combinada con la disponibilidad generalizada de citómetros de flujo y el cada vez mayor número de anticuerpos conjugados con fluoróforo disponibles comercialmente, ha facilitado la caracterización de AT células inmunes. Aunque la presencia de células inmunes en inflamado AT había sido descrito previamente 2, los papeles seminales por Weisberg et al. y Xu et al. publicado en 2003 fueron los primeros en documentar la acumulación de macrófagos AT (cajeros automáticos) de la obesidad, que secretan citoquinas inflamatorias y se correlaciona con AT-específica y la resistencia a la insulina sistémica 3,4. Estas observaciones sirven como la base de un nuevo campo de investigación acuñado recientemente, &quot;immunometabolism,&quot; 5 y han sido objeto de seguimiento por estudios que implican diversas poblaciones de células inmunes, incluyendo células dendríticas 6, mastocitos, células T 7 8 -10, 11 las células B, células NKT 12, 13, eosinófilos y neutrófilos 14,15 en el desarrollo de la obesidad resistencia a la insulina asociada. El objetivo de este artículo es proporcionar una descripción detallada de la técnica de digestión de colagenasa utilizado para aislar las células de la AT SVF y para caracterizar los cajeros automáticos y AT células T a través de citometría de flujo. Este protocolo ha sido optimizado para ratón AT, sin embargo, los espectadores pueden beneficiarse de la lectura de un artículo excelente que proporciona una descripción más detallada en la optimización de esta técnica para el consumo humano a los 16 años. El público objetivo de este artículo incluye investigadores con poca experiencia de trabajo con el ratón AT y la realización de citometría de flujo. Varias consideraciones prácticas para equilibrar el rendimiento y la viabilidad celular con el tiempo y los recursos se presentan, así como controles de citometría de flujo óptimas para la caracterización de las poblaciones de células inmunes. Además de nuestro protocolo, los lectores son referred a un reciente artículo de Jove por Basu et al. para una excelente discusión sobre algunos de los aspectos técnicos de la citometría de flujo para incluir controles adecuados y compensaciones 17.

<table><tbody><tr><td>DPBS (sin Ca o Mg) 10 x 500 ml</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>colagenasa</td><td>Sigma</td><td>C6885-5G</td><td></td></tr><tr><td>solución de yoduro de propidio</td><td>Sigma</td><td>P4864-10 ml</td><td></td></tr><tr><td>pila estable 20 microlitros</td><td>Rainin</td><td>SS-L10</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de filtro de 20 microlitros</td><td>Rainin</td><td>SRL10F</td><td></td></tr><tr><td>pila estable Puntas de 250 microlitros</td><td>Rainin</td><td>SS-L250</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de 1000 microlitros</td><td>Rainin</td><td>GPS-L1000</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de filtro de 1000 microlitros</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td></td></tr><tr><td>250 puntas de filtro de microlitros</td><td>Rainin</td><td>SR-L200F</td><td></td></tr><tr><td>FC Block</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>fisher 100mn coladores</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>plato de peso mediano</td><td>Fisherbrand</td><td>02-202B</td><td></td></tr><tr><td>papel de aluminio</td><td>Fisherbrand</td><td>1213100</td><td></td></tr><tr><td>tijeras de picar</td><td>Fisherbrand</td><td>089531B</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>tapa filtrante Tubos FACS</td><td>BD FALCON</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>10 ml estuche de pipetas 200</td><td>BD Falcon</td><td>1367520</td><td></td></tr><tr><td>tubos de fondo redondo</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 5 ml</td><td>BD Falcon</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>V Placas Inferiores</td><td>Costar</td><td>07-200-107</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de bulbo de transferencia</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-711-22</td><td></td></tr><tr><td>Agitador</td><td>Thermo Scientific</td><td>11 676 071</td><td></td></tr><tr><td>Estera adhesiva</td><td>Thermo Scientific</td><td>1368750</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga de cultivo celular</td><td>Sorvall</td><td>75253839</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Adaptadores Sorvall</td><td>75003723</td><td></td></tr><tr><td>Rata antiratón CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Concentración: 0,5 - 1 &mu; g/ 106 células</td></tr><tr><td>Rata anti-ratón F4/80</td><td>eBioscience</td><td>17-4801</td><td>Conjugado con fluoróforo: APC Concentración: 0,2 &mu; g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: 17-4321</td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD11b</td><td>eBioscience</td><td>11-0112</td><td>Conjugado fluoróforo: FITC Concentración: 0,5 &mu; g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: 1/11/4031</td></tr><tr><td>Hámster Armenio anti-ratón CD11c</td><td>eBioscience</td><td>12-0114</td><td>Conjugado de fluoróforo: PE Concentración: 0,8 &mu; g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: Dic-88</td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón MGL1/2</td><td>R& D Systems</td><td>FAB4297P</td><td>Conjugado de fluoróforo: PE Concentración: 0,1 &mu; g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: IC108P</td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón CD206</td><td>R& D Systems</td><td>FAB2535P</td><td>Conjugado de fluoróforo: PE Concentración: 0,1 &mu; g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: IC108P</td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CCR2</td><td>R& D Systems</td><td>FAB5538P</td><td>Conjugado de fluoróforo: PE Concentración: 0,1 &mu; g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: IC013P</td></tr><tr><td>Hámster Armenio anti-ratón TCR&#946;</td><td>BD Biosciences</td><td>553174</td><td>Conjugado de fluoróforo: APC Concentración: 0,2 &mu; g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo:</td></tr><tr><td>553956 Rata anti-ratón CD8a BD</td><td>Biosciences</td><td>552877</td><td>Conjugado de fluoróforo: PE-Cy7 Concentración: 0,8 &mu; g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: 552784</td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>557956</td><td>Conjugado con fluoróforo: Alexa Fluor 700 Concentración: 0,2 &mu; g/ 106 celdas Número de catálogo de control de isotipo: 557963</td></tr><tr><td colspan="4">Tabla 1. Lista de Materiales y Reactivos.</td></tr></tbody></table>

aislamiento de tejido adiposo células inmunes

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

El descubrimiento de aumento de la infiltración de macrófagos en el tejido adiposo (AT) de los roedores y los seres humanos obesos ha dado lugar a una intensificación de interés en la contribución de células inmunes a la resistencia a la insulina local y sistémica. Aislamiento y cuantificación de diferentes poblaciones de células inmunes en magra y obesos AT es ahora una técnica comúnmente utilizada en los laboratorios immunometabolism; todavía extrema se debe tener cuidado tanto en el aislamiento de células del estroma vascular y en el análisis de citometría de flujo, de modo que los datos obtenidos es fiable e interpretables . En este video se demuestra cómo pica, digerir, y aislar la fracción vascular estromal enriquecida con células inmunes. A continuación, mostramos cómo los macrófagos etiqueta de anticuerpos y los linfocitos T y la forma de la puerta correctamente en los experimentos de citometría de flujo. Se proporcionan flujo representativos parcelas citometría de bajos magras y grasa de alto ratones obesos alimentados con grasa alimentados. Un elemento crítico de este análisis es el uso de anticuerpos que hacenno fluorescencia en los canales donde AT macrófagos son naturalmente autofluorescente, así como el uso de los controles de compensación adecuados.

Digestión con colagenasa de AT seguido de centrifugación diferencial se utilizó para aislar el SVF de almohadillas de grasa del epidídimo de ratones macho C57BL/6J alimentados con una baja en grasas (10% kcal de la grasa) o alta en grasas (60% kcal de la grasa) dieta (LFD y HFD , respectivamente) durante 16 semanas. Las células de la SVF fueron etiquetados con anticuerpos primarios conjugados con fluoróforo para cuantificar la proporción de cajeros automáticos viables (Figura 1) y AT células T (...

El tejido adiposo (AT) es un sitio de activación de células inmunes y la interacción intensa. Casi todas las células del sistema inmune están presentes en AT y sus proporciones se alteran por la obesidad. Aislamiento adecuado, cuantificación y caracterización de las poblaciones de células inmunes son fundamentales para la comprensión de su papel en la enfermedad immunometabolic.

Aislamiento de tejido adiposo células inmunes

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células inmunitarias del tejido adiposo. Esto se logra retirando primero las almohadillas de grasa epidérmica. En el segundo paso, el tejido adiposo se digiere con colagenasa.A continuación, se aísla la fracción de vasculatura estromal del tejido adiposo mediante centrifugación diferencial. En el paso final, las células inmunitarias del tejido adiposo se marcan con anticuerpos primarios conjugados con fluoro cuatro. En última instancia, la proporción de macrófagos viables y células T que residen en el tejido adiposo se puede cuantificar mediante citometría de flujo.Hola, soy Alyssa Hasty. Hoy te mostraremos cómo aislar y cuantificar células inmunitarias a partir de tejido adiposo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del metabolismo inmunológico, como cómo cambian las poblaciones de células inmunitarias en el tejido adiposo después de la manipulación genética, farmacológica o nutricional.Hoy demostrarán el procedimiento Arian Kennedy y Jeb, o becarios postdoctorales en mi laboratorio. Después de humedecer completamente el pelaje del animal sacrificado con etanol al 70%, haga una incisión a nivel de la apófisis xifoides y abra la cavidad torácica para exponer el corazón, teniendo cuidado de no cortar ningún vaso sanguíneo importante. A continuación, corte la aurícula derecha para permitir que la sangre y el perfu ocho salgan del sistema circulatorio.Luego, use un par de fórceps para agarrar el corazón e inserte suavemente una aguja a través del ápice hasta el ventrículo izquierdo. Ahora perfunda lentamente el ratón con 15 mililitros de PBS estéril. A continuación, abra la cavidad peritoneal y retire las almohadillas de grasa pereg gonadal con cuidado para evitar cualquier tejido gonadal.Coloque las almohadillas de grasa en un bote de suero sobre hielo que contenga dos mililitros de DPBS libre de magnesio y calcio suplementado con 0.5% de BSA, y luego pique el tejido adiposo en trozos finos. Este es el aspecto que debe tener la grasa al finalizar el picado. Ahora vierta el homogeneizado de tejido adiposo picado en un tubo cónico de 15 mililitros.Enjuague el webo con un mililitro de DPBS suplementado con BSA y vierta el lavado en el tubo cónico. A continuación, enjuague el bote de WHE con tres mililitros de solución de colagenasa y vierta el lavado en el tubo. Incubar el homogéneo en un agitador rotacional durante 20 minutos a 200 RPM y 37 grados centígrados.A continuación, añada 10 mililitros de DPBS suplementado con BSA al homogeneizado utilizando una pipeta serológica de 10 mililitros. A continuación, repita el homogeneizado digerido varias veces y coloque el tubo en hielo. Pase la suspensión celular a través de un filtro de 100 micrómetros a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.Después de girar las células, decantar el snat y luego piojos los eritrocitos contaminantes dentro de la célula de la fracción vascular estromal. Con tres mililitros de un tampón CK. Agregue rápidamente el búfer de fax para neutralizar el búfer A CK.Después de lavar y repre peletizar las celdas, vuelva a suspender el pellet en el tampón de fax. A continuación, cuente las células viables por exclusión de azul de trian y diluya aún más la suspensión celular hasta una concentración final de cinco a 10 veces 10 por las seis células por mililitro. Comience la tinción incubando las células con el anticuerpo bloqueante anti-US CD 16, CD 32 FC hasta una concentración final de 0,5 a un microgramo por 10 a las seis células durante 10 minutos en hielo.A continuación, divida las celdas en mayores o iguales a 10 a las seis alícuotas y transfiera las alícuotas a tubos de poliestireno de 12 por 75 milímetros de fondo redondo. Combine las celdas adicionales en un número adecuado de tubos para acomodar la compensación requerida y los controles de fluorescencia modificada menos uno. A continuación, añada anticuerpos primarios conjugados con flúor cuatro y controles de isotipo a los tubos apropiados a las concentraciones adecuadas.Después de incubar las muestras en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante 30 minutos, lavar las muestras dos veces en dos mililitros de tampón de fax Resus suspendiendo los pellets en tampón de fax mayor o igual a 400 microlitros de tampón de fax Después del segundo lavado, transfiera las muestras a nuevos tubos de poliestireno de fondo redondo de 12 por 75 milímetros equipados con tapas de tubo de filtro de celdas de 35 micrómetros. Justo antes del análisis, agregue un dado de viabilidad para la discriminación de células muertas vivas a las muestras apropiadas. A continuación, utilice un control negativo sin manchas para ajustar la dispersión lateral en una escala logarítmica y la dispersión directa en una escala lineal.A continuación, dibuje una puerta de dispersión de luz inicial basada en el tipo de celda que se está analizando y ajuste la ganancia del tubo fotomultiplicador de modo que las celdas no teñidas estén en el extremo izquierdo de un histograma de un solo parámetro aproximadamente centrado en la tendencia de las dos marcas para los canales apropiados. Utilizando perlas de compensación de captura de anticuerpos, realice la compensación multicolor y, a continuación, configure las puertas experimentales en función de los controles de fluorescencia menos uno modificados previamente preparados. Por último, recopile el número adecuado de eventos en función de la prevalencia de la población de interés y registre los datos experimentales.En esta primera serie de gráficos de densidad, las células de la fracción vascular estromal aisladas del tejido adiposo epidérmico de la orina se tiñeron para F 4 80 y CD 11 B para la identificación de macrófagos del tejido adiposo. Estos tres primeros paneles demuestran la estrategia inicial de compuertas, incluida la dispersión de la luz, la discriminación de dobletes y las puertas de viabilidad. En los dos paneles siguientes, se pueden observar controles representativos de fluorescencia modificada menos uno utilizados para establecer las puertas experimentales.En este ejemplo, los anticuerpos F 4 80 y CD 11 B se reemplazaron con controles de isotipo apropiados para tener en cuenta la autofluorescencia y la unión inespecífica. A continuación, se dibujaron las puertas del cuadrante para identificar los macrófagos viables del tejido adiposo F four 80 CD 11 B positivos. A continuación, se pudo comparar la proporción de macrófagos de tejido adiposo F 4 80 positivos CD 11 B positivos aislados de ratones alimentados con bajo contenido de grasa y con alto contenido de grasa, tal como se muestra en estos gráficos de densidad representativos.En esta siguiente serie de paneles, la puerta de dispersión de luz inicial se restringió a la población de linfocitos para evitar la inclusión de células mieloides autofluorescentes. En estos dos últimos pares de paneles, se muestra la compuerta representativa de los linfocitos T de tejido adiposo CD cuatro positivos y CD ocho positivos. Los linfocitos viables del tejido adiposo se seleccionaron primero para TCR R beta tcr.A continuación, se seleccionaron los linfocitos T de tejido adiposo R beta positivos para la expresión de CD cuatro y CD-ocho. A continuación, se pudo comparar la proporción de linfocitos T beta positivos para TCR y de linfocitos T CD cuatro positivos y CD ocho positivos aislados del tejido adiposo de ratones alimentados con alto y bajo contenido de grasa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar las células inmunitarias del tejido adiposo.

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video demuestra una técnica para aislar y cultivar células madre adiposas (ADSC) derivadas de la cresta neural marcadas con fluorescencia a partir de tejido adiposo del arco periaórtico murino. Tras el aislamiento, las NCADSC se detectan, se clasifican mediante la clasificación celular activada por fluorescencia y, posteriormente, se cultivan en una placa, lo que promueve la proliferación celular.

Aislamiento de células madre derivadas del tejido adiposo periaórtico murino

En 2001, investigadores de la UCLA describen el aislamiento de una población de células madre adultas, denominada células madre o las ASC derivadas de tejido adiposo, a partir de tejido adiposo. En este artículo se describe el aislamiento de las ASC de lipoaspirates utilizando un protocolo de digestión manual, enzimática utilizando colagenasa.

Aislamiento Manual de células madre derivadas de tejido adiposo de Lipoaspirates Humanos

Debido a la conexión drástico y negativo entre la obesidad y otras comorbilidades, la investigación sobre el papel adiposo desempeña en la enfermedad y la salud en general se justifica. Se presenta un protocolo para el aislamiento y la escisión de los depósitos de tejido adiposo que permitan el estudio de tejido adiposo usando in situ y métodos in vitro.

Localización, identificación y Escisión de depósitos adiposos murino

Presentamos las técnicas necesarias para aislar la fracción vascular estromal (FSV) de los depósitos de tejido adiposo inguinal (subcutáneo) y perigonadal (visceral) de ratón para evaluar su expresión génica y actividad colagenolítica. Este método incluye el enriquecimiento de células madre derivadas de alto tejido adiposo (ASC) Sca1 mediante separación celular inmunomagnética.

La separación inmunomagnética de Sca1 depósitos de grasa específica<sup&gt; alta</sup&gt; Células Madre derivadas de tejido adiposo (ASC)

Esta publicación describe un protocolo para el aislamiento de núcleos de adipocitos maduros, purificación por clasificación activada por fluorescencia y transcriptómica a nivel de una sola célula.

Aislamiento de núcleos de tejido adiposo para aplicaciones genómicas de una sola célula

Este protocolo describe el enfoque técnico para aislar subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos murinos de tejido adiposo blanco intraabdominal (WAT) mediante clasificación celular activada por fluorescencia o separación inmunomagnética de perlas.

Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos

Presentamos un método simple para aislar células progenitoras adiposas altamente viables de las almohadillas de grasa epidídmica del ratón usando clasificación celular activada por fluorescencia.

Preparación de células progenitoras adiposas de tejidos adiposos epidídicos del ratón

Este protocolo proporciona un método eficiente de digestión de colagenasas para el aislamiento de adipocitos viables y células de la fracción vascular estromal-SVF de grasa visceral humana en un solo proceso, incluida la metodología para obtener ARN de alta calidad de los adipocitos y la fenotipificación de los macrófagos SVF mediante la tinción de múltiples marcadores unidos a la membrana para su análisis por citometría de flujo.

Aislamiento de adipocitos viables y fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo visceral humano adecuado para análisis de ARN y fenotipado de macrófagos

Este protocolo describe el aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y lograr la diferenciación de los adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa reduce la variación experimental y aumenta la reproducibilidad.

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

Aquí presentamos un método estándar para aislar de forma eficiente células madre y adipocitos derivados del adiposo, caracterizado por una reducción del &gt; del 90% en el tiempo de procesamiento, alta viabilidad celular y amplia compatibilidad.

Aislamiento eficiente de células madre y adipocitos derivados del adiposo a partir de tejido adiposo porcino

Aprende a aislar células inmunes de tejido adiposo mediante digestión con colagenasa y centrifugación diferencial. Este método permite cuantificar macrófagos y linfocitos T por citometría de flujo para estudiar enfermedades inmunometabólicas.

Aislamiento de tejido adiposo células inmunes

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