Un ensayo de migración celular cuantitativa para murinos entéricas Neuronales Progenitores

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar el potencial de migración de los neuroprogenitores entéricos en presencia de diversos factores de crecimiento. Esto se logra diseccionando primero intestinos delgados embrionarios de ratón poblados por células fluorescentes de la corteza neurológica. El segundo paso es usar un micrótomo vibratorio para hacer rodajas de intestinos de 200 micras de grosor.

A continuación, estas rodajas se incuban encima de un gel de colágeno que contiene factores de crecimiento. El paso final es pelar las rodajas para revelar las células migratorias que se encuentran debajo. En última instancia, la microscopía de fluorescencia se utiliza para mostrar el patrón de migración de las células dentro del gel de colágeno.

Este método puede ayudar a responder una pregunta clave en la biología del desarrollo, como proporcionar una mejor comprensión de la interacción entre varias vías de señalización que subyacen a la formación del sistema nervioso periférico. 12 días después de encontrar un tapón vaginal, eutanasia a la rata hembra y extirpar el útero, colocar el útero en una placa de Petri de vidrio llena de hielo. El PBS frío corta el útero transversalmente entre las hinchazones individuales del deum para aislar cada sitio de implantación del embrión bajo un microscopio de disección, use pinzas finas para eliminar la capa muscular del útero.

Abre el saco vitelino visceral y el amnios para revelar el embrión. Tenga cuidado al cortar los vasos sanguíneos, uniendo el embrión al saco vitelino, ya que están entrelazados con los intestinos en desarrollo. A continuación, inserte pinzas cerradas en la cavidad abdominal justo por encima del hígado de color rojo oscuro y deje que se abran.

Esto crea una abertura transversal en la cavidad del abdomen. Tire de las pinzas abiertas hacia el extremo posterior del embrión para abrir el abdomen por completo. Una vez abierto, agarra el tejido conectivo detrás del hígado y saca las tripas.

Teniendo cuidado de no romper los intestinos. Corta el colon en cualquier lugar para liberar las tripas del resto del embrión. Reserva la parte de la cola para más tarde.

Extraiga el tejido conectivo del ciego y luego los intestinos, trabajando cuidadosamente para no enrollarlos en el extremo rostral del intestino delgado. Cortar el hígado y el estómago, así como el meso, la nefros y las crestas genitales, si están presentes. Por último, aísla el intestino delgado cortando el ciego y el colon, así como el tejido conectivo restante.

Como antes, tenga cuidado de no cortar el intestino. Deje el intestino delgado en PBS a temperatura ambiente durante el menor tiempo posible antes de incrustarlo. Después de cortar el embrión por el cuello, registre el número de somitas de la cola para determinar con precisión la etapa del desarrollo embrionario.

Antes de proceder con las disecciones de embriones, derrita 1,5 gramos de agros en 100 mililitros de PBS y manténgalo a 50 grados centígrados. Prepare el molde de inclusión cortando un tubo de microcentrífuga de dos mililitros a lo largo para extirpar aproximadamente una cuarta parte de la pared del tubo. Vierte los agros derretidos en el molde y deja que se enfríe hasta que esté ligeramente tibio al tacto.

Cuando esté listo, sostenga el intestino con pinzas por el extremo rostral doblado y tire de él muy lentamente a través de los agros, a lo largo del molde. Esto ayuda a mantener el intestino recto mientras que los conjuntos agrícolas liberan el tejido tan pronto como comienza a resistirse a ser movido y realizan un seguimiento de la orientación del mimo rostral del intestino. A continuación, coloque el molde en un refrigerador durante dos o tres minutos para que se asiente por completo.

Una vez cuajados, retira los agros del molde y recorta el exceso de agros por ambos extremos, haciendo cortes perpendiculares al intestino. Pegue el extremo rostral del bloque de agros a la etapa metálica de un micrótomo y recorte el exceso de aros por todos lados. A continuación, monte la platina metálica en la cámara del micrótomo vibratorio.

Si es necesario, ajuste el ángulo de la etapa para que el intestino esté lo más vertical posible. Cubra la muestra con PBS helado antes de bajar la cuchilla de microtono a unos pocos milímetros por debajo de la superficie del tampón. Cuando esté listo, haga cortes transversales de 200 micras del intestino delgado más delgado.

Asegurándose de que cada rebanada de agro contenga una sección intestinal completa. Depositar suavemente las lonchas recién cortadas sobre un gel de colágeno previamente preparado. Colocando una rodaja hacia el centro de cada pocillo para permitir la migración de las células de la cresta neuro fuera de las berenjenas, incube las rodajas durante tres días.

Pasado este tiempo, retira suavemente las rodajas del gel de colágeno con pinzas teniendo cuidado de no dañar el gel que se encuentra debajo. Para garantizar que el patrón de migración celular no se altere, es importante evitar tocar el gel de colágeno directamente durante las etapas posteriores de incubación y lavado. Primero, fije las celdas con 500 microlitros de 4% de PFA por pocillo durante una hora a temperatura ambiente.

A continuación, sustituya el fijador por 500 microlitros de solución DPI por pocillo e incube durante 10 minutos. A temperatura ambiente, retire con cuidado la solución de DPI y lave cada pocillo tres veces con 500 microlitros de PBS durante cinco minutos. Por último, fotografíe las células fluorescentes incrustadas en el gel de colágeno dentro de cada pocillo.

En este ejemplo, se utilizaron factores de crecimiento para estimular la migración de las células de la neurocorteza entérica que expresan GFP. La línea punteada representa el tamaño aproximado y la ubicación de la explicación. Antes de que se retirara del gel, se encontró que el número y la propagación de las células que expresan GFP que migran fuera del intestino son significativamente mayores en las afecciones tratadas que en las no tratadas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar el potencial de migración de los progenitores neurales entéricos mediante la incubación de rodajas intestinales sobre un gel de colágeno que contiene factores de crecimiento.