Name: Un ensayo de migración celular cuantitativa para murinos entéricas Neuronales Progenitores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T15:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprende a cuantificar la migración de progenitores neuronales entéricos en intestino embrionario de ratón mediante microscopía de fluorescencia. Este ensayo ex vivo permite evaluar el efecto de factores de crecimiento en el desarrollo del sistema nervioso entérico.

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Damos las gracias a Denis Flipo consejo de procesamiento de imágenes y análisis, y David W. Silversides en cuyo laboratorio se generó la línea de ratón Gata4p [5 kb]-GFP. La investigación en el laboratorio Pilon es financiado por CIHR, NSERC, FRQS y FRQNT.

Declaración de Ética Los experimentos con ratones se realizaron siguiendo Consejo Canadiense de Cuidado de Animales Directrices para el cuidado y la manipulación de los animales utilizados en la investigación médica. Protocolos que implican la manipulación de los animales fueron aprobados por el comité de ética institucional de la Universidad de Quebec en Montreal (Comité de Protección Institutionnel des Animaux; número de referencia 0512-R3-650-0513). 1. Preparación de geles de colágeno Trabajar de forma estéril, bajo una campana de cultivo de tejidos. <ol><li> Preparar completa 5x DMEM (medio esencial modificado de Eagle) incluyendo antibióticos estándar. Disolver 3,37 g de polvo de DMEM y 0,925 g de NaHCO3 en 20 ml de agua. Esterilizar mediante el paso a través de un filtro de 0,22 micras. Añadir 2,5 ml de penicilina estéril 100x / estreptomicina y 25 ml de suero bovino fetal inactivado por calor estéril. Almacenar a 4 ° C. </li><li> En el hielo, mezclar 800 lde la solución de colágeno I (3,77 mg / ml en 0,02 N de ácido acético, esterilizada por filtración), 600 l de DMEM completo 5x y 17 l de 1 N de NaOH. Se diluye con agua estéril a un volumen final de 3 ml. Incluya factores de crecimiento apropiados en la mezcla. Utilizamos típicamente GDNF a 10 ng / ml para estimular la migración NCC entérico. </li><li> Depósito de unos 480 l en cada pocillo de una sola fila de una placa de 24 pocillos. Evite las burbujas. Las filas restantes se pueden utilizar para probar el efecto de otros factores de crecimiento sobre la migración celular. </li><li> Deje que el colágeno se polimeriza al menos 1 hora en un incubador estéril a 37 ° C. </li></ol> 2. Disección de animales 16 <ol><li> Configure los apareamientos y compruebe si hay tapones vaginales a la mañana siguiente. E0.5 Día siendo el mediodía del día en que el tapón vaginal se encuentra, aislar a la hembra y esperar 12 días hasta E12.5. </li><li> Anestesie ratones preñados con isoflurano y la eutanasia por inhalación de CO2. </li><li> Rocíe el ratón con etanol al 70%. Levante las s abdomenparientes y abrir la cavidad abdominal con tijeras de disección. </li><li> Extirpar el útero en una placa de Petri de vidrio lleno de helado de PBS (solución salina tamponada con fosfato). Cortar el útero transversalmente entre hinchazones deciduum individuales para aislar cada sitio de la implantación del embrión. </li><li> El trabajo en cada lugar de la implantación por separado en otra placa Petri de vidrio lleno de helado de PBS. Bajo un microscopio de disección, utilizar unas pinzas finas para eliminar la capa muscular del útero. </li><li> Abra el saco vitelino visceral y amnios para revelar el embrión. Tener cuidado al cortar los vasos sanguíneos de unirse al embrión a la placenta / visceral del saco vitelino, a medida que se entrelazan con los intestinos en desarrollo. </li><li> Cortar la cabeza del embrión en el cuello. </li><li> Inserte un fórceps cerrados en la cavidad abdominal de un embrión, justo por encima del hígado y de color rojo oscuro y dejar que el fórceps abierto de sí mismo (dejar de aplicar presión) para hacer una abertura transversal en la cavidad abdominal. Saque las pinzas abiertas hacia abajoel extremo posterior del embrión para abrir el abdomen completamente. </li><li> Coge el tejido conectivo detrás del hígado y tire de las tripas del abdomen, con cuidado de no romper el intestino (colon se une al ano). </li><li> Cortar el colon para liberar las agallas del resto del embrión. El corte puede hacerse en cualquier lugar a lo largo del colon. Reserve la parte de cola para más adelante. </li><li> Desentrañar el tejido conectivo desde el ciego, a continuación, el resto de los intestinos. Tenga cuidado de no herir los intestinos mientras lo hace. </li><li> Cortar el hígado y el estómago (en el extremo rostral del intestino delgado), así como los mesonefros y crestas genitales si algunos son presente. </li><li> Aislar el intestino delgado. Una vez más, tenga cuidado de no cortar el intestino. A partir de ahora, la orientación rosrrocaudal del tejido intestinal se puede seguir utilizando la fuerte curvatura presente en el extremo rostral. Deje el intestino delgado en PBS a temperatura ambiente durante un tiempo tan corto como sea posible antes de emRopa de cama (vea el paso 3.3). </li><li> Por último, anote el número de somitas cola para cada embrión para determinar con precisión la etapa de desarrollo embrionario. </li></ol> 3. La sección del embrionarias Intestinos <ol><li> Antes de proceder con disecciones de embriones, se funden 1,5 g de agarosa en 100 ml de PBS (solución salina tamponada con fosfato) y mantenga a 50 ° C. </li><li> Vierta agarosa derretida en un molde de inclusión (por ejemplo, un tubo de microcentrífuga cerrado 2 ml que ha sido cortado a lo largo de extirpar aproximadamente 1/4 de la pared del tubo). Deje que la agarosa se enfríe a aproximadamente 42-45 ° C, debe ser sólo ligeramente caliente al tacto. </li><li> Incrustar el intestino embrionario justo antes de que se solidifique agarosa (esto se puede evaluar con fórceps consejos y 36-38 ° C ocurrir alrededor). Sosteniendo el intestino con fórceps por el extremo rostral plegada, tire de ella muy lentamente a través de la agarosa a lo largo de la longitud del molde. Esto ayuda a mantener el intestino recto, mientras que los conjuntos de agarosa. Suelte el temitir tan pronto como comienza a resistirse a ser movido. No pierda de vista la orientación rostral-caudal del intestino. </li><li> Ponga el molde en la nevera 2-3 minutos, para asegurar que la agarosa se ha establecido por completo. </li><li> Saque la agarosa del molde (deslizándolo fuera del tubo Eppendorf abierto). Con una hoja, sacar el exceso de agarosa en ambos extremos, haciendo cortes perpendiculares al intestino. </li><li> Pegue el extremo rostral del intestino / agarosa bloquear abajo en la escena del metal de un microtomo con cuchilla vibrante. Recorte el exceso de agarosa de los lados del bloque delgado / agarosa. </li><li> Montar el escenario de metal en la cámara de microtomo vibrante. Si es necesario, ajuste el ángulo del escenario para que el intestino es tan vertical como sea posible (por lo tanto perpendicular a la hoja). Cubra la muestra con helado de PBS. Traiga la hoja microtomo hasta unos pocos milímetros bajo la superficie de amortiguación. </li><li> Hacer 200 micras vibratome transversales cortes de intestino-caudal más pequeño, lo que garantiza que el correoach rodaja de agarosa contiene una sección intestinal completa. </li></ol> 4. Cultura de intestinal explantes <ol><li> Depositar suavemente el rodajas delgado / agarosa recién cortadas plana sobre los geles de colágeno con pinzas, colocar una rebanada a la mitad de cada bien. </li><li> Incubar 3 días a 37 ° C, en una atmósfera húmeda al 5% de CO 2, para permitir la migración de NCC fuera del explante. </li><li> Tomar las rodajas delgado / agarosa el gel de colágeno muy suavemente con fórceps. Tenga cuidado de no dañar el gel a continuación. </li><li> Evitar tocar el gel de colágeno directamente durante la incubación y de lavado de los pasos subsiguientes con el fin de garantizar que el patrón de la migración de células no sea perturbada. Fijar con 500 l de 4% de PFA (paraformaldehído) (en PBS) por pocillo 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Reemplazar el fijador con 500 l de DAPI (4 &#39;,6-diamino-2-fenilindol) solución (5 mg / ml en PBS) por pocillo e incubar 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar cada pocillo 3xcon 500 l de PBS durante 5 min. </li><li> Fotografía las células fluorescentes (canales GFP y DAPI) incrustados en el gel de colágeno dentro de cada pocillo. </li></ol> 5. Análisis de Imagen Hemos hecho un amplio uso de ImageJ 17 para procesar y cuantificar las imágenes generadas después del cultivo de explante. <ol><li> Comience por imágenes de un micrómetro de diapositivas con la misma ampliación que las fotografías de células fluorescentes. Medir la longitud de una micra en píxeles (con la función Straight Line). </li><li> Establecer la escala (Analizar / Set Escala; número de entrada de píxeles / micras). </li><li> Para cada fotografía la fluorescencia de GFP, cambiar el formato de la imagen a escala de grises de 8 bits (Image/Type/8-bit). </li><li> Ajusta la intensidad de la señal (Imagen / Ajustar / Brillo / Contraste). </li><li> Reste el ruido de fondo si es necesario (Proceso / Restar fondo, ajustar el radio de la esfera rodante). </li><li> Establecer un umbral para resaltar las celdas y los grupos de células (Imagen / Ajustar / Umbral), lan aplicar una cuenca para dividir a los grupos (Proceso / Binary / Cuenca). </li><li> Analizar las partículas para especificar las regiones de interés (ROI) y generar estadísticas de número de células (Analizar / Analizar Partículas; mínimo el tamaño del conjunto de excluir píxeles restantes). </li><li> Establecer opciones de medición para incluir el diámetro de Feret (Analizar / Medidas Set). </li><li> Grupo ROI y medir en su conjunto para determinar el diámetro de la Feret, una indicación de la propagación de células (Analizar / Herramientas / ROI Gerente / Más / O, entonces Director de ROI / Agregar y ROI Gerente / Measure). </li></ol>

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<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Byth, K. F., Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AZD5438%2C+a+potent+oral+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1%2C+2%2C+and+9%2C+leads+to+pharmacodynamic+changes+and+potent+antitumor+effects+in+human+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts.</a> Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Mostramos cómo nuestro vivo técnica de cultivo ex explante se puede utilizar para cuantificar con precisión entérica potencial de migración NCC en presencia de GDNF. Dicha cuantificación exacta es facilitada en gran medida por el uso de 200 micras de espesor secciones intestinales vibratome lugar de grandes piezas de tamaño aproximado, como se describe anteriormente 11,12,15. De hecho, esto nos permite trabajar con un número razonable de las células en un entorno altamente reproducible. De n...

Células de la cresta neural (CCN) son un tipo de célula transitoria única de vertebrados que forma muchos derivados durante el desarrollo embrionario. Surge Esta población de células en la frontera de la placa neural, adyacente al ectodermo no neurales 1. Durante la neurulación, la flexión de los lugares placa neural NCC lo largo del borde dorsal del tubo neural formando. NCC luego se someten a una transición epitelio-mesenquimal, segregar y migrar lejos del tubo neural. NCC colonizar diversas estructuras embrionarias, incluyendo el tracto digestivo donde forman todo el sistema nervioso entérico (ENS), una red interconectada de los ganglios nerviosos incrustado en la pared intestinal. Tan recientemente revisado 2,3, muchos genes han sido implicados en el desarrollo de esta intrincada estructura. La mayor parte de la ENS se deriva de un pequeño grupo de NCC procedente del tubo neural vagal (es decir, en torno al límite prospectivo posterior del cerebro / médula espinal) 4.Estos progenitores neurales llegan al intestino anterior alrededor del día embrionario (e) 9.0 en ratones y luego migran caudalmente en el mesénquima intestinal hasta aproximadamente e15.0 colonizar todo el intestino embrionarias. Un subconjunto menor de progenitores neurales de colon también es proporcionada por sacra NCC, que invaden el intestino posterior en la dirección opuesta hasta el ciego 4. Tanto vagal y sacral NCC requiere múltiples migración, proliferación, supervivencia y diferenciación de las señales promotoras para asegurar la formación completa de la ENS. En este sentido, los modelos animales - especialmente ratones genéticamente modificados - han sido fundamentales para la identificación de varios ligandos extracelulares esenciales: GDNF (factor neurotrófico derivado de células gliales), la endotelina-3, la neurotrofina-3, (proteínas morfogenéticas óseas) BMP, Netrina , así como Sonic y erizo indio (Shh y Ihh) 5-10. De éstos, el GDNF señalización a través de la RET receptor transmembrana tirosina quinasa (Reordenación durante la transfección) se reconoce como the vía más importante para la atracción y la orientación de NCC y dentro del intestino embrionario. GDNF es secretada por el mesénquima intestino y forma un gradiente de rosrrocaudal espaciotemporalmente controlado que es directamente quimioatrayentes para entérico NCC, que expresan RET 11,12. Entre otras funciones, la ENS regula el movimiento en el tracto digestivo a través de su interacción con el músculo liso de la pared intestinal. Ausencia de los ganglios de los nervios en la región terminal de los resultados del intestino en la enfermedad de Hirschsprung: contracción tónica del segmento afectado conduce a la obstrucción, la acumulación de aguas arriba del material digerido y distensión masiva del intestino y el abdomen. La enfermedad de Hirschsprung ocurre aproximadamente uno de cada 5.000 nacidos vivos. Se cree que el patrón de migración rostro-caudal del entérica NCC siendo el principal factor que contribuye a la etiología de la enfermedad de Hirschsprung. El colon, más alejado de la fuente de la migración de NCC y última porción del bowel ser colonizado, es más susceptible a defectos en la formación ENS. De acuerdo con su papel crucial en la migración NCC entérica, la alteración de la señalización de GDNF / RET es la principal causa genética conocida de la enfermedad de Hirschsprung 13. Para un mejor estudio de NCC y desarrollo ENS, hemos generado una línea de ratones transgénicos - llamado Gata4p [5 kb]-GFP 14 - en la que NCC migratoria están etiquetados con la proteína verde fluorescente (GFP). A continuación perfeccionado un ensayo ex vivo la migración celular, adaptado a partir de los trabajos publicados por otros grupos 11,12,15, que ahora permite la cuantificación precisa de entérica potencial de migración NCC en la presencia de varios factores de crecimiento, tales como el GDNF.

<table><tbody><tr><td>DMEM polvo</td><td>Wisent</td><td>219-010-XK</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de filtración al vacío Steriflip de grado biotecnológico (0,22 micras)</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina, 100x</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Wisent</td><td>095-150</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno I</td> de alta calidad <td>BD biosciences</td><td>354236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Bioshop</td><td>SHY700</td><td>Diluido a partir de stock de 10 N y luego filtrado estéril</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Cedarlane</td><td>CLCYT305</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa Falcon de 24 pocillos</td><td>BD biosciences</td><td>353047</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>Fisher Scientific</td><td>089515</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidrio</td><td>VWR</td><td>89000-306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td> de grado de cultivo celular <td>Leica</td><td>M125</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas</td><td>Herramientas de Ciencia Fina</td><td>11251-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla quirúrgica de</td> grado biotecnológico <td>Feather</td><td>21</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bolígrafo de pegamento Krazy instantáneo para todo uso</td><td>Krazy Glue</td><td>KG824</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HM 650V Microtomo de cuchilla vibratoria</td><td>Thermo Scientific</td><td>920110</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Tabla de reactivos y equipos específicos.</td></tr></tbody></table>

un ensayo de migración celular cuantitativa para murinos entéricas neuronales progenitores

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Células de la cresta neural (CCN) son una población de células multipotentes transitoria y que se origina en el tubo neural dorsal y migra extensamente por todo el embrión de los vertebrados en desarrollo. Además de proporcionar la glía y neuronas periféricas, NCC generar los melanocitos, así como la mayor parte del esqueleto cráneo-facial. NCC la migración y la diferenciación está controlada por una combinación de su origen axial a lo largo del tubo neural y su exposición a las señales extracelulares regionalmente distintas. Tal contribución de ligandos extracelulares es especialmente evidente durante la formación del sistema nervioso entérico (ENS), una compleja red interconectada de los ganglios nerviosos que controla localmente (entre otras cosas) el movimiento del músculo intestinal y la motilidad intestinal. La mayor parte de la ENS se deriva de un pequeño grupo inicial de NCC que emprenda un largo viaje con el fin de colonizar - en una rostral caudal a la moda - la longitud completa del intestino prospectivo. Entre varias vías de señalización que se sabe queinfluir en la colonización entérica NCC, GDNF señalización / RET es reconocido como el más importante. De hecho, la secreción espaciotemporalmente controlada del ligando RET GDNF por el mesénquima intestinal es el principal responsable de la atracción y la orientación de RET-expresando entérica NCC hacia y dentro del intestino embrionario. Aquí, se describe un ensayo ex vivo la migración celular, haciendo uso de una línea de ratón transgénico que posee la etiqueta fluorescente NCC, que permite la cuantificación precisa de entérica potencial de migración NCC en la presencia de varios factores de crecimiento, incluyendo el GDNF.

Los siguientes resultados son representativos de lo que se puede obtener con la técnica descrita aquí (Figura 1). El uso de factores de crecimiento (es decir, GDNF) estimula la migración de expresión de GFP-entérica NCC fuera del explante intestinal y en el gel de colágeno (Figura 2). Aunque algunas células salen del explante en ausencia de factores de crecimiento, éstos en su mayoría no son GFP-etiquetados y representan la entrada pasiva. Es necesario quitar la rebanada intest...

Se presenta un ensayo in vivo la migración ex célula que permite la cuantificación precisa de los nervios potencial de migración de células de la cresta entérica en la presencia de varios factores de crecimiento.

Un ensayo de migración celular cuantitativa para murinos entéricas Neuronales Progenitores

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar el potencial de migración de los precursores neurales entéricos en presencia de diversos factores de crecimiento. Esto se logra primero mediante la disección de intestinos delgados embrionarios de ratón, colonizados por células neurocristales fluorescentes. El segundo paso consiste en utilizar un microtomo vibrante para obtener cortes de intestino de 200 micrones de grosor.A continuación, estas láminas se incuban sobre un gel de colágeno que contiene factores de crecimiento. El paso final consiste en desprender las láminas para revelar las células migratorias situadas debajo. En última instancia, se utiliza microscopía de fluorescencia para mostrar el patrón de células migratorias dentro del gel de colágeno.Este método puede ayudar a responder una pregunta clave en biología del desarrollo, como proporcionar una mejor comprensión de la interacción entre diversas vías de señalización que subyacen a la formación del sistema nervioso periférico. Doce días después de que se encuentre un tapón vaginal, sacrificar al ratón hembra y extraer el útero; colocar el útero en una placa de Petri de vidrio con hielo. Cortar transversalmente el útero en PBS frío entre las hinchazones individuales del decíduo para aislar cada sitio de implantación embrionaria bajo un microscopio estereoscópico; usar pinzas finas para retirar la capa muscular del útero.Abrir la bolsa de vitelo visceral y el amnios para revelar el embrión. Tener cuidado al seccionar los vasos sanguíneos que unen el embrión a la bolsa de vitelo, ya que están entrelazados con los intestinos en desarrollo. A continuación, insertar fórceps cerrados en la cavidad abdominal justo por encima del hígado de color rojo oscuro y permitir que se abran.Esto crea una abertura transversal en la cavidad abdominal. Tire de la pinza abierta hacia el extremo posterior del embrión para abrir completamente el abdomen. Una vez abierto, agarre el tejido conectivo detrás del hígado y extraiga las vísceras.Teniendo cuidado de no romper los intestinos. Corte el colon en cualquier ubicación para separar las entrañas del resto del embrión. Reserve la porción de la cola para usarla posteriormente.Separar cuidadosamente el tejido conectivo del ciego y luego de los intestinos, teniendo cuidado de no lesionarlos en el extremo rostral del intestino delgado. Seccionar el hígado y el estómago, así como el meso, las crestas nefrógenas y las crestas genitales si están presentes. Finalmente, aislar el intestino delgado cortando el ciego y el colon, así como el tejido conectivo restante.Como antes, tenga cuidado de no dañar el intestino. Deje el intestino delgado en PBS a temperatura ambiente durante el menor tiempo posible antes de incluirlo. Después de seccionar el embrión en el cuello, registre el número de somitas caudales para determinar con precisión la etapa de desarrollo embrionario.Antes de proceder con las disecciones de embriones, derrita 1,5 gramos de agros en 100 mililitros de PBS y manténgalos a 50 grados Celsius. Prepare el molde de inclusión cortando longitudinalmente un tubo microcentrífugo de dos mililitros para extraer aproximadamente un cuarto de la pared del tubo. Vierta el agros derretido en el molde y déjelo enfriar hasta que esté ligeramente tibio al tacto.Cuando esté listo, sostenga el intestino con pinzas por el extremo rostral plegado y páselo muy lentamente a través del agros, a lo largo de toda la longitud del molde. Esto ayuda a mantener el intestino recto mientras el agros se endurece; suelte el tejido tan pronto como comience a oponer resistencia al movimiento y mantenga el seguimiento de la orientación rostral del intestino. A continuación, coloque el molde en un refrigerador durante dos o tres minutos para que se endurezca completamente.Una vez fijado, retire los agros del molde y recorte el exceso de agros en ambos extremos, realizando cortes perpendiculares al intestino. Pegue el extremo rostral del bloque de agros a la platina metálica de un microtomo y recorte el exceso de agros por todos los lados. A continuación, coloque la platina metálica en la cámara del microtomo vibrante.Si es necesario, ajuste el ángulo del estadio para que el intestino quede lo más vertical posible. Cubra el espécimen con PBS frío con hielo antes de bajar la hoja del micrótomo a unos pocos milímetros por debajo de la superficie del tampón. Cuando esté listo, realice cortes transversales de 200 micrones del intestino delgado más pequeño. Asegurándose de que cada rebanada agro contenga una sección intestinal completa. Deposite suavemente las rebanadas recién cortadas sobre un gel de colágeno previamente preparado. Coloque una rebanada hacia el centro de cada pocillo para permitir la migración de células de la cresta neural fuera de las berenjenas, e incube las rebanadas durante tres días.Después de este tiempo, retire las secciones del gel de colágeno suavemente con pinzas, teniendo cuidado de no dañar el gel debajo. Para asegurar que el patrón de migración celular no se altere, es importante evitar tocar directamente el gel de colágeno durante la incubación subsecuente y los pasos de lavado. Primero, fije las células con 500 microlitros de PFA al 4 % por pocillo durante una hora a temperatura ambiente.A continuación, sustituya el fijador con 500 microlitros de solución DPI por pocillo e incube durante 10 minutos. A temperatura ambiente, retire cuidadosamente la solución DPI y lave cada pocillo tres veces con 500 microlitros de PBS durante cinco minutos. Por último, fotografíe las células fluorescentes embebidas en el gel de colágeno dentro de cada pocillo.En este ejemplo, se utilizaron factores de crecimiento para estimular la migración de células de la cresta neural entérica que expresan GFP. La línea punteada representa el tamaño y la ubicación aproximados del explante. Antes de retirarlo del gel, se encontró que el número y la dispersión de células que expresan GFP y que migraron fuera del explante intestinal fue significativamente mayor en las condiciones tratadas en comparación con las no tratadas.Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo determinar el potencial de migración de los progenitores neuronales entéricos incubando rebanadas intestinales sobre un gel de colágeno que contiene factores de crecimiento.

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