Name: La detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por Exon de captura y secuenciación masivamente paralelo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-18T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Aprende a detectar mutaciones somáticas en genes asociados al cáncer mediante secuenciación masivamente paralela con captura de exones. Este método utiliza bibliotecas de ADN con códigos de barras para analizar 279 oncogenes.

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Damos las gracias a la Dra. Agnes Viale y el Laboratorio de Genómica MSKCC para la asistencia técnica. Este protocolo ha sido desarrollado con el apoyo del Centro de Investigación del Cáncer Geoffrey Beene y la Fundación Agricultores familia.

1. ADN y Preparación de los reactivos Nota: Este protocolo describe el procesamiento y el análisis simultáneo de 24 muestras (por ejemplo, 12 pares normales / tumorales), pero puede ser adaptado para lotes más pequeños y más grandes. Las muestras de ADN pueden derivar de FFPE o tejido fresco congelado, especímenes citológicos, o sangre. Típicamente, tanto del tumor y el tejido normal del mismo paciente se perfilan juntos con el fin de distinguir las mutaciones somáticas de los polimorfismos heredados. El protocolo comienza inmediatamente después de la extracción de ADN. <ol><li> Alícuota de 50-250 ng (250 ng recomendado) de ADN extraído por muestra, diluida en 1X Tris-EDTA (pH 8,0) tampón a un volumen final de 50 l, en tubos de fondo redondo Covaris separadas. </li><li> Cortar el ADN en el instrumento Covaris E220 con los siguientes ajustes de corte: 360 segundos a 10 factor de trabajo, 175 de PIP y 200 ciclos por ráfaga. </li><li> Descongele Beads XP AMPure (Tabla 2) a temperatura ambiente. Descongele todos bufertas y enzimas en hielo antes de la etapa apropiada. </li></ol> 2. Módulo Reparación End - Preparación Biblioteca <ol><li> Prepare la mezcla maestra reparación fin en un tubo de microcentrífuga estéril utilizando los siguientes volúmenes por muestra: 10 l de 10x NEBNext End Reaction Buffer Reparación (Tabla 2), 5 l NEBNext End Repair Enzyme Mix (Tabla 2), 35 l de nucleasa estéril libre de H 2 O. </li><li> Alícuota de los 50 l de cada ADN cortado en pocillos separados de una placa de 96 pocillos. Añadir 50 l de la mezcla maestra de reparación final preparado para cada reacción. Incubar en un termociclador durante 30 min a 20 ° C. </li></ol> 3. Mensaje End Repair Limpieza <ol><li> Añadir un volumen de 2x (200 l) de los granos XP AMPure (Tabla 2) a cada muestra y pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces usando una pipeta multicanal. Incubar a TA durante 15 min. </li><li> Coloque en el soporte magnético (Tabla 2 </fuerte&gt;) a TA durante 15 min hasta que la muestra aparece clara. </li><li> Retire con cuidado y deseche toma sobrenadante claro cuidado de no molestar a los granos. Un poco de líquido puede permanecer en los pozos. </li><li> Con tubos en el soporte, agregar suavemente 200 l de etanol recién preparada 80% a cada muestra y se incuba la placa a temperatura ambiente durante 30 seg. Con cuidado, separar el etanol mediante una pipeta. </li><li> Repita el paso 5, para un total de 2 lavados con etanol. Asegúrese de que todo el etanol se ha eliminado. Retirar del soporte magnético y dejar secar a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Resuspender perlas secas con 44,5 l H 2 O. estéril Suavemente, toda pipeta de volumen hacia arriba y hacia abajo 10 veces mezclando bien. Asegurarse de perlas se ya no adheridas al lado del pozo. </li><li> Incubar perlas se resuspendieron a TA durante 2 min. Coloque el soporte magnético durante 5 minutos hasta que la muestra parece clara. </li><li> Transferir suavemente 42 l de sobrenadante claro que contiene la muestra a un nuevo pozo. El procedimiento puede hacerse sin riesgo en este ptep y muestras almacenadas a -20 ° C durante un máximo de 7 días. Para reiniciar, descongelar las muestras congeladas en hielo antes de proceder. </li></ol> 4. Preparación Biblioteca - Módulo dA-tizón <ol><li> Preparar la mezcla maestra dA-tizón en un tubo de microcentrífuga estéril utilizando los siguientes volúmenes por muestra: 5 l de 10x NEBNext Reacción dA-tizón Buffer (Tabla 2), 3 l (3&#39;-5 &#39;exo-) Klenow Fragment (Tabla 2 ). </li><li> Añadir 8 l de la mezcla maestra dA-tizón preparada a cada pocillo que contiene 42 l de ADN reparado en sus extremos. Incubar en un termociclador durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Lleve a cabo un post-dA Tailing limpieza: Repita los pasos 3.1 a 3.8 usando volumen 2x (100 l) de cuentas, pero se vuelve a suspender en H2O estéril hasta un volumen final de 33.75 l. El procedimiento se puede detener de forma segura en este paso y las muestras almacenadas a -20 ° C durante hasta 7 días. Para reiniciar, descongelar las muestras congeladas en hielo antes de continuar. &lt;/ Li&gt; </ol> 5. Preparación Biblioteca - Módulo adaptador de ligadura <ol><li> Preparar la mezcla maestra ligadura en un tubo de microcentrífuga estéril utilizando los siguientes volúmenes por muestra: 10 l de 5x NEBNext Ligadura Quick Reaction Buffer (New England Biolabs, Tabla 2), 5 l Quick T4 ADN ligasa (Tabla 2). </li><li> Añadir 15 l de la mezcla maestra ligadura a cada pocillo que contiene el ADN Colas dA. </li><li> Añadir 1,25 l de la 25 adaptador de código de barras M NEXTflex apropiada (Tabla 2) a cada pocillo. Cada muestra debe recibir un adaptador con código de barras separado. Incubar en un termociclador durante 15 min a 20 ° C. </li><li> Realice una ligadura de adaptador de post limpieza: Repita los pasos 3.1 hasta 3.8 utilizando 1 x volumen (50 l) de cuentas, pero se vuelve a suspender en H2O estéril hasta un volumen final de 50 l. </li><li> Repita los pasos 3.1 a 3.8 para un segundo volumen 1x (50 l) de limpieza, pero se vuelve a suspender en H2O estéril a unavolumen final de 23 l. El procedimiento se puede detener de forma segura en este paso y las muestras almacenadas a -20 ° C durante hasta 7 días. Para reiniciar, descongelar las muestras congeladas en hielo antes de proceder. </li></ol> 6. Amplificación Biblioteca <ol><li> Preparar la mezcla maestra KAPA de alta fidelidad en un tubo de microcentrífuga estéril usando los siguientes volúmenes por muestra: 25 l 2x KAPA alta fidelidad SA RM (Tabla 2), 1 l cada uno de 100 M Cebador 1 y Cebador 2 (Tabla 3). </li><li> Añadir 27 l de la mezcla maestra a cada pocillo que contiene el producto de ligación. Establecer pipeta para 50 l y suavemente con la pipeta el volumen arriba y abajo 10 veces. </li><li> Colocar en el termociclador para los siguientes ciclos de PCR: desnaturalización inicial de 45 segundos a 98 ° C, 10 ciclos de 15 segundos a 98 ° C, 30 seg a 60 ° C, 30 seg a 72 ° C, y extensión final de 1 min a 72 ° C. </li><li> Lleve a cabo una amplificación posterior limpieza: Repita los pasos 3.1 a 3.8 usando1 x volumen (50 l) de los granos AMPure XP, y resuspender en agua estéril a un volumen final de 30 l. </li><li> Cuantificar la concentración de cada biblioteca utilizando Qubit Ensayo de Rango amplio (Life Technologies, Tabla 2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol> 7. Roche Nimblegen SeqCap EZ Biblioteca hibridación, lavado, y amplificación <ol><li> Descongele los bloqueadores de oligonucleótidos universales e índice (Tabla 3), SeqCap EZ Biblioteca y componentes de captura NimbleGen (ADN COT, del tampón de hibridación 2x, y el componente de hibridación A, Tabla 2) en el hielo. Todos los bloqueadores de oligonucleótidos se almacenan en acciones de trabajo de 1 mM. Nuestro SeqCap EZ Library es una piscina de diseño personalizado de sondas de captura que abarcan todos los exones codificantes de proteínas de 279 genes asociados con el cáncer, aunque otros diseños personalizados y catálogos pueden ser utilizados. </li><li> Prepare una piscina de 1 mM de los bloqueadores de oligonucleótidos índice correspondientes a la publicidad con código de barras específicosecuencias Aptor utilizados en la preparación de la biblioteca. Combine 1 l de cada bloqueador, y agitar. </li><li> En un nuevo tubo estéril de 1.5 ml, añadir 5 l de ADN COT 1mg/ml, 2 l de 1 mM bloqueador universal y 2 l de la piscina 1 mM de los bloqueadores de oligonucleótidos índice. </li><li> Piscina 24 bibliotecas con código de barras en una sola reacción. Añade un total de 1-3 g de agrupado, biblioteca de secuencias de código de barras (preparado anteriormente) a la mezcla de la captura. Para 24 muestras, se recomienda 100 ng por muestra. Cuando se combinaron los tumores y las muestras normales emparejados, se recomienda la adición de más biblioteca de tumor (por ejemplo 100 ng por tumor y 50 ng por normal) para que se secuencian a una mayor profundidad de la cobertura. </li><li> Cerrar la tapa del tubo y hacer 15-20 agujeros en la parte superior de la tapa con un 18-20 G o aguja más pequeña. Speed ​​Vac las muestras biblioteca / COT ADN / oligos amplificados en un concentrador de vacío de ADN a temperatura alta (60 ° C). </li><li> Una vez secado completamente abajo, rehidratar con 7,5 l de 2x hibridaciónamortiguar zación y 3 l de hibridación componente A. El tubo ahora debe contener lo siguiente: 5 g de ADN COT, g variable de biblioteca muestra amplificada, 1000 pmol de Universal y Índice Oligos, tampón 7,5 l 2x hibridación, 3 componente l hibridación A en un volumen total de 10,5 l. </li><li> Cubra los orificios de la tapa con un pequeño trozo de cinta de laboratorio. Vortex la muestra durante 10 segundos y se centrifuga a la velocidad máxima durante 10 s. </li><li> Incubar la muestra a 95 ° C durante 10 minutos para desnaturalizar el ADN, seguido por centrifugación a velocidad máxima durante 10 segundos a TA. </li><li> En un nuevo tubo de tiras PCR 0,2 ml, prepare 2,25 l alícuota de SeqCap EZ sondas de captura Biblioteca y 2,25 l de estéril libre de nucleasa H 2 O y añadir los contenidos de la etapa 7.7. Pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces. </li><li> Incubar en un termociclador a 47 ° C durante 48-96 horas. Establecer y mantener la temperatura de la tapa del termociclador a 57 ° C. </li><li> Folbajos pasos del Capítulo 6 de la Guía v3.0 del SR del usuario NimbleGen SeqCap EX Library (Tabla 2) para el lavado y la recuperación del ADN capturado. </li><li> Sigue los pasos en el capítulo 7 del protocolo Roche NimbleGen para la amplificación del ADN capturado con las siguientes modificaciones: <ul type="disc"><li> Utilice 2x KAPA de alta fidelidad de la polimerasa (Tabla 2) en lugar de Phusion de alta fidelidad PCR Master Mix </li><li> Utilice 100 M Primer 1 y 2 Primer listado en la Tabla 3. </li><li> Ejecute las siguientes condiciones de PCR: desnaturalización inicial a 98 ° C durante 30 segundos, 11 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 30 segundos, 72 ° C durante 30 segundos, y de extensión final a 72 ° C durante 5 min . Mantener a 4 ° C. </li></ul></li><li> Cuantificar la concentración del ADN capturado amplificado utilizando alta sensibilidad de ensayo Qubit (Tabla 2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Analizar la calidad del ADN capturado utilizando Agilent Biochip de analizador de ADN HS (Tabla 2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. <ul type="disc"><li> El rendimiento de PCR debe ser de al menos 100 ng (rango de 100-1.000 ng). </li><li> La longitud media de fragmento debe ser de entre 150-400 pares de bases. </li></ul></li></ol> 8. Illumina Hola-Seq Secuenciación <ol><li> Diluir el ADN capturado amplificada a 14:00, y la carga de la muestra en un solo carril de una celda de flujo Illumina HiSeq 2000. Secuencia de extremo emparejado 75 pares de bases lee de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En nuestra experiencia, un carril es suficiente para producir 500-700x única cobertura de secuencia por muestra a través de 279 genes para una piscina de 24 muestras. </li><li> Software Illumina (análisis en tiempo real) convertirá las imágenes de alta resolución para las intensidades de racimo basar las llamadas y sus niveles de calidad. Utilice Casava para demultiplexar datos de acuerdo con la identidad del código de barras y generar archivos de FASTQ individuales para cada muestra. </li></ol> 9. Datos Anallisis <ol><li> Secuencias adaptadoras del ajuste del extremo 3 &#39;de la secuencia se lee en los archivos FASTQ utilizando Cutadapt ( <a href="http://code.google.com/p/cutadapt/">http://code.google.com/p/cutadapt/</a> ). La longitud de solape mínima (-O) es 3 con una tasa de error (-E) de 1%. La longitud mínima de la base para la retención de emparejado lee después del corte es de 25. </li><li> Alinear secuencia lee a los de referencia hg19 genoma humano utilizando la herramienta de Burrows-Wheeler alineador (BWA) 12. Realice los pasos de post-procesamiento, incluyendo el marcado duplicado, múltiples locales secuencia de realineamiento y recalibración puntuación de calidad de base utilizando el kit de herramientas de Análisis Genómico (GATK) de acuerdo con las mejores prácticas estándar ( <a href="http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices">http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? name = mejores prácticas</a> ) 13. Al perfilar varias muestras del mismo paciente (por ejemplo, tumor emparejado y normales), múltiples locales secuencia reajuste debe ser rendimientoMED conjuntamente. La salida de estos pasos de procesamiento posterior es un archivo de BAM diferente para cada muestra, que contiene toda la secuencia, la calidad, y la información de alineación y se puede cargar directamente en la Genómica Integrativa Viewer (IGV) para la visualización de lecturas y variantes de secuencia 14. </li><li> Calcular los parámetros de rendimiento de la secuencia utilizando herramientas Picard ( <a href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a> ). Métricas informativas incluyen tasa de alineación, distribución de tamaño de fragmento, GC-contenido asociado sesgo de cobertura, la especificidad de captura en el blanco, PCR duplica la tasa, la complejidad de la biblioteca, y la media de cobertura objetivo. Los valores representativos se muestran en la Figura 1. Las frecuencias alélicas en sitios de polimorfismo comunes calculados utilizando DepthOfCoverage de GATK se utilizan para controlar la contaminación de ADN ajeno y para garantizar que los diferentes muestras provenían de los mismos pacientes. Los siguientes análisis computacional dependen de la presencia de emparejadomuestras tumorales y normales para la detección de alteraciones genéticas somáticas. Tumores sin igual también se pueden analizar usando una muestra separada de control normal, pero las mutaciones somáticas no pueden más fácilmente ser distinguidos de variantes de la secuencia heredados. </li><li> Llame a variantes de nucleótido único somáticas (SNVS) para cada par de tumor normal usando una persona que llama mutación somática, tal como muTect 15, SomaticSniper 16, o Strelka 17. Utilizamos muTect con criterios de filtrado modificados, lo que permite variantes con bajo (distinto de cero) los recuentos de los alelos en la muestra normal, siempre y cuando la frecuencia del alelo es por lo menos 5 veces mayor en el tumor. Variantes recurrentemente llamados en un panel de ADN normales se eliminan como artefactos sistemáticas probables de la secuenciación o la alineación. Cada SNV pasando filtros es luego revisado cuidadosamente con IGV. </li><li> Llame indeles somáticas para cada par de tumor normal usando algoritmos tales como SomaticIndelDetector 13, Dindel 18, o 19 SOAPindel </sup&gt;. Utilizamos SomaticIndelDetector con los siguientes criterios: al menos 10% frecuencia del alelo con al menos 3 de soporte lee, o al menos 2% Frecuencia de alelo con al menos 10 lecturas de apoyo. Nos permitimos para indeles con bajo (distinto de cero) los recuentos de los alelos en la muestra normal, siempre y cuando la frecuencia del alelo es por lo menos 5 veces mayor en el tumor. Indeles llamados en un panel de ADNs normales se eliminan, como anteriormente. Cada indel pasando filtros es luego revisado cuidadosamente con IGV. </li><li> Extrapolar copia estado número en la secuencia de la cobertura en los exones objetivo. Para cada muestra individual, realizar una normalización loess de la cobertura media de secuencia para todos los exones objetivo, la regresión sobre porcentaje GC. Ajuste los valores de cobertura unnormalized restando el ajuste Loess y la adición de la cobertura promedio en toda la muestra. Calcular la relación de cobertura de secuencia normalizada en todos los exones objetivo para pares de tumor normal. En ausencia de una muestra normal correspondiente y / o para disminuir el ruido, otra diploide género coincide conlos controles normales que carecen de variantes de número de copias de la línea germinal se pueden utilizar. Determinar las ganancias y pérdidas de número de copias somáticas sobre la base de los aumentos o disminuciones en la tasa de cobertura. </li><li> Llame a reordenamientos somáticos relacionados con los genes del cáncer en la que al menos un punto de interrupción genómico cae dentro o cerca de un intervalo específico del genoma. Algoritmos sugeridos incluyen GASV 20, Breakdancer 21, CREST 22 y Dranger 23. Inversiones intracromosomal, deleciones y duplicaciones en tándem se pueden distinguir sobre la base de la posición relativa y la orientación de apoyo lee en pares discordantes. Todos los reordenamientos candidatos deben ser revisados ​​manualmente con IGV. Recomendamos validación experimental por PCR y secuenciación de Sanger a través de los puntos de interrupción de reordenamiento putativos. </li></ol>

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<li>Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+oncology+through+integrative+high-throughput+sequencing%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study.</a> Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).</li>
<li>Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+high+throughput+sequencing+in+clinical+cancer+settings%3A+formaldehyde+fixed-paraffin+embedded+%28FFPE%29+tumor+tissues%2C+input+amount+and+tumor+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity.</a> BMC Med. Genomics. 4, 68(2011).</li>
</ol>

Dr. Berger ha recibido honorarios de consultoría y fondos de investigación de Medicina de la Fundación, una compañía de diagnóstico de cáncer.

Nuestro ensayo IMPACT produce una alta tasa de alineación, la alta tasa en el blanco, la meta de cobertura alta, y alta sensibilidad para detectar mutaciones, indeles y copiar alteraciones numéricas. Hemos demostrado la capacidad de nuestro ensayo IMPACT secuencia de ADN de ambos helado en fresco y archivado muestras de FFPE de entrada de baja ADN. Mediante la realización de secuenciación dirigida exón de los genes clave asociados con el cáncer, se puede lograr una cobertura de secuencia muy profundo para los exones de ...

La identificación de &quot;conductor&quot; eventos genéticos tumorales en oncogenes clave y genes supresores de tumores juega un papel esencial en el diagnóstico y el tratamiento de muchos tipos de cáncer 1. Los esfuerzos de investigación a gran escala que utilizan la secuenciación masiva en paralelo &quot;de nueva generación&quot; han permitido la identificación de muchos de estos genes asociados con el cáncer en los últimos años 2. Sin embargo, estas plataformas de secuenciación típicamente requieren grandes cantidades de ADN aisladas a partir de tejidos congelados frescos, lo que plantea una limitación importante en la caracterización y análisis de mutaciones de ADN de tejidos conservados, tales como parafina fijado con formalina incrustado (FFPE) muestras de tumor. La mejora de los esfuerzos para caracterizar de manera eficiente y confiable de la información genómica &quot;recurribles&quot; de muestras de tumores FFPE permitirán el análisis retrospectivo de muestras previamente caballones y seguir fomentando enfoques individualizados para el manejo del cáncer. Tradicionalmente, d molecularlaboratorios iagnostic se han basado en metodologías de bajo rendimiento que requieren mucho tiempo, como la secuenciación de Sanger y PCR en tiempo real para el perfil de mutación del ADN. Más recientemente, los métodos de mayor rendimiento que utilizan PCR multiplexada o determinación del genotipo de espectrometría de masas se han desarrollado para investigar mutaciones somáticas recurrentes en los genes del cáncer clave 3-5. Estos enfoques, sin embargo, están limitados en que sólo las mutaciones predesignadas &quot;punto caliente&quot; se ensayan, que los hace inadecuados para la detección de mutaciones inactivadoras en los genes supresores de tumores. Secuenciación masiva en paralelo ofrece varias ventajas con respecto a estas estrategias que incluyen la posibilidad de interrogar a los exones enteros para las mutaciones tanto comunes como poco frecuentes, la capacidad de revelar las clases adicionales de alteraciones genómicas tales como las ganancias y pérdidas de número de copias, y una mayor sensibilidad de detección en muestras heterogéneas 6, 7 . La secuenciación del genoma entero representa el enfoque más completo para el descubrimiento de la mutación, aunque es relativamente costoso y incurre grandes demandas computacionales para el análisis y el almacenamiento de datos. Para aplicaciones clínicas, en los que sólo una pequeña fracción del genoma puede ser de interés clínico, dos innovaciones particulares en la tecnología de secuenciación han sido transformadora. En primer lugar, a través de la hibridación con sede en el exón captura, se puede aislar el ADN correspondiente a los genes clave asociados con el cáncer de apuntado perfiles mutación 8,. En segundo lugar, a través de la ligadura de los códigos de barras moleculares (es decir, secuencias de ADN de 6-8 nucleótidos de longitud), se puede agrupar cientos de muestras por corrida secuenciación y aprovechar al máximo la capacidad cada vez mayor de instrumentos de secuenciación masivamente paralelo 10. Cuando se combinan, estas innovaciones permiten que los tumores ser perfilado para un menor coste y con mayor rendimiento, con requisitos de cómputo más pequeños 11. Además, mediante la redistribución de la cobertura de secuencia de sólo los genes más importantes para la aplicación particular, uno puede ACHIEve más a fondo la secuenciación para una mayor sensibilidad de detección para eventos de baja frecuencia de los alelos. Aquí describimos nuestro ensayo IMPACT (Integrated Mutación de perfiles de objetivos de cáncer Actionable), que utiliza la captura de códigos de barras en el exón piscinas biblioteca secuencia mediante hibridación utilizando oligonucleótidos personalizados para capturar todos los exones codificadores de proteínas y seleccione intrones de 279 genes claves asociados con el cáncer (Tabla 1 ). Esta estrategia permite la identificación de mutaciones, indeles, alteraciones del número de copias y seleccione reajustes estructurales que implican estos 279 genes. Nuestro método es compatible con el ADN aislado de tanto tejido congelado y FFPE fresca, así como aspirados con aguja fina y otras muestras de citología.

<table><tbody><tr><td>NEBNext Módulo de reparación final</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs</td><td>E6050L</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext dA-Módulo de relaves</td><td>New England Biolabs</td><td>E6053L</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Módulo de ligadura rápida</td><td>New England Biolabs</td><td>E6056L</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter Genómica&</td><td></td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>NEXTflex Códigos de barras sin PCR &ndash; 24</td><td>Bioo Scientific</td><td>514103</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de amplificación de biblioteca HiFi</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2612</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>COT ADN humano, grado fluorométrico</td><td>Roche Diagnostics</td><td>05 480 647 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NimbleGen SeqCap EZ Kit de hibridación y lavado</td><td>Roche NimbleGen</td><td>05 634 261 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SeqCap EZ Library Cebos</td><td>Roche NimbleGen</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de purificación de PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de amplio rango (BR) Qubit dsDNA</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de alta sensibilidad (HS) Qubit dsDNA</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit Agilent DNA HS</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626, 4627</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Covaris</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soporte magnético-96</td><td>Ambion</td><td>AM10027</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Illumina Hi-Seq 2000</td><td>Illumina</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

la detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por exon de captura y secuenciación masivamente paralelo

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Los esfuerzos para detectar e investigar las mutaciones oncogénicas clave han demostrado su utilidad para facilitar el tratamiento adecuado para los pacientes con cáncer. El establecimiento de alto rendimiento, la secuenciación masiva en paralelo &quot;de nueva generación&quot; ha ayudado al descubrimiento de muchas de estas mutaciones. Para aumentar la utilidad clínica y traslacional de esta tecnología, las plataformas deben ser de alto rendimiento, rentable y compatible con parafina fijado en formol e incrustados (FFPE) muestras de tejido que pueden producir pequeñas cantidades de ADN degradado o dañado. Aquí se describe la preparación de bibliotecas de ADN con códigos de barras y multiplexados seguido de captura basados ​​en la hibridación de los exones específicos para la detección de mutaciones asociadas con el cáncer en los tumores congelados y frescos por FFPE secuenciación masiva en paralelo. Este método permite la identificación de mutaciones en la secuencia, copia alteraciones numéricas y seleccionar reajustes estructurales que involucran todos los genes específicos. Targeted secuenciación del exón ofrece tse beneficia de un alto rendimiento, bajo costo, y la cobertura de secuencia de profundidad, lo que confiere una alta sensibilidad para la detección de mutaciones de baja frecuencia.

Una piscina de 24 bibliotecas de secuencias de código de barras (12 pares-tumorales normales) fue capturado utilizando sondas correspondientes a todos los exones codificantes de proteínas de 279 genes del cáncer y se secuenció como 2 x 75 pb lee en un solo carril de una celda de flujo HiSeq 2000. El tumor y bibliotecas normales se agruparon en una proporción de 2:1. Métricas de rendimiento de la muestra para un grupo de muestras de ADN de tumores congelados se muestran en la Figura 1, incluyendo la tasa...

Se describe la preparación de bibliotecas de ADN con códigos de barras y la posterior basada en la hibridación exón captura para la detección de mutaciones clave asociados con el cáncer en las muestras tumorales clínicos de secuenciación masiva en paralelo de &quot;próxima generación&quot;. Targeted secuenciación exón ofrece los beneficios de alto rendimiento, bajo coste, y la cobertura de secuencia profunda, produciendo de este modo una alta sensibilidad para la detección de mutaciones de baja frecuencia.

La detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por Exon de captura y secuenciación masivamente paralelo

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar mutaciones somáticas en genes asociados al cáncer de células de tejido tumoral mediante el uso de bibliotecas de ADN multiplexadas con códigos de barras, seguidas de secuenciación masiva en paralelo. Esto se logra mediante el primer ligado de adaptadores de secuenciación con códigos de barras a fragmentos de ADN aislados de tumores preservados. El segundo paso del procedimiento es la hibridación a oligonucleótidos biotinilados personalizados, complementarios a todos los exones de recubrimiento proteico de 279 oncogenes y genes supresores de tumores.El tercer paso consiste en realizar una secuenciación paralela masiva de los grupos con códigos de barras de las bibliotecas capturadas. El último paso es buscar en los datos de la secuencia las alteraciones asociadas al cáncer para los 279 genes objetivo. Este procedimiento puede revelar mutaciones de secuencia, pequeñas inserciones, pequeñas deleciones, alteraciones en el número de copias y alteraciones estructurales seleccionadas.Por lo tanto, las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes son que permite investigar exones completos tanto para las mutaciones comunes como para las raras, así como identificar alteraciones genómicas adicionales, como pérdidas y ganancias de número de copias, y lograr una mayor sensibilidad en muestras heterogéneas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genómica del cáncer, como ¿cuáles son las mutaciones impulsoras clave en varios tipos de cáncer?, ¿se correlacionan estas mutaciones en muestras clínicas con los resultados o la respuesta a las terapias dirigidas? Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico y el tratamiento del cáncer porque las mutaciones se pueden identificar prospectivamente y se pueden usar para ayudar a guiar a los pacientes hacia las terapias y los ensayos clínicos adecuados.La demostración visual de este método es fundamental, ya que un paso de limpieza de la abeja es difícil de aprender debido a una técnica de precaución necesaria al lavar y eludir el ADN de las cuentas: prepare la mezcla maestra de reparación final. Mezcle los volúmenes apropiados para obtener 50 microlitros por muestra. Alícuota los 50 microlitros de cada ADN en pocillos separados de una placa de seis pocillos.A continuación, añada 50 microlitros de la mezcla maestra de reparación de extremos preparada a cada reacción e incube la placa en un termociclador durante 30 minutos a 20 grados centígrados para limpiar la reacción. En primer lugar, añada 200 microlitros de perlas AMP pure XP a cada muestra y pipetee suavemente todo el volumen hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta multicanal. A continuación, incube la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos.A continuación, mueva las placas al soporte magnético y deje que se aclaren durante 15 minutos a temperatura ambiente. Una vez limpio, retire y deseche suavemente la mayor parte del sobrenadante teniendo cuidado de no alterar las cuentas. Es posible que quede algo de líquido en los pozos.A continuación, añada suavemente 200 microlitros de etanol al 80% recién preparado a cada muestra e incube la placa a temperatura ambiente durante 30 segundos. Pipetear con cuidado el etanol y repetir el lavado una vez más. A continuación, deja que el plato se seque a temperatura ambiente hasta que se escape todo el alcohol.Ahora vuelva a suspender las perlas secas en 44,5 microlitros de agua estéril. Fluya suavemente cada muestra a través de la pipeta 10 veces con la última expulsión. Enjuaga las cuentas adheridas al costado del pozo.Ahora incube las perlas suspendidas en agua a temperatura ambiente durante dos minutos y luego muévalas al soporte magnético durante cinco minutos hasta que los pozos estén limpios. Por último, transfiera suavemente 42 microlitros del sobrenadante transparente en cada pocillo, que contiene la muestra, a un nuevo pocillo. Las muestras ahora se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados hasta por una semana.Comience preparando la mezcla maestra de relaves D en un tubo de microcentrífuga estéril. Agregue ocho microlitros de la mezcla maestra de relaves DA preparada a cada pocillo de ADN reparado en el extremo. Luego incube la placa en un termociclador durante 30 minutos a 37 grados centígrados para limpiar la reacción.Utilice el mismo proceso descrito en la sección anterior al doble del volumen y termine Resus suspendiendo las perlas en 33,75 microlitros de agua estéril. En este punto, las muestras se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados durante un máximo de una semana. Para continuar, prepare una mezcla maestra de ligadura para 15 microlitros por reacción.Agregue 15 microlitros de la mezcla maestra de ligadura a cada pocillo que contenga el ADN de la cola D. A continuación, añade 1,25 microlitros de los 25 micromolares adecuados. Siguiente adaptador flex con código de barras.Para cada una, bueno, cada muestra debe recibir un adaptador con código de barras por separado. Una vez cargados los adaptadores, incubar la placa durante 15 minutos a 20 grados centígrados. Ahora, utilizando 50 microlitros de perlas, realice una limpieza posterior a la ligadura del adaptador y vuelva a suspender la muestra en agua estéril a 50 microlitros.Luego haga el proceso de limpieza por segunda vez, terminando con 23 microlitros de agua. En este punto, las muestras se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados durante un máximo de una semana. El siguiente paso es amplificar la biblioteca de cada muestra, que se detalla en el protocolo de texto sobre el deshielo del hielo, los bloqueadores de oligonucleótidos universales e índices, la biblioteca fácil CCAP y los componentes de captura de gen ágiles, que incluyen el tampón de hibridación TNA dos X y el componente de hibridación.A.Ahora prepare un grupo de un milimolar de bloqueadores de oligonucleótidos índice correspondientes a las secuencias de adaptadores con códigos de barras específicos utilizados en la preparación de la biblioteca. Combine un microlitro de cada bloqueador y únalos durante 10 segundos En un nuevo tubo de 1,5 mililitros, prepare la mezcla de captura que consta de cinco microlitros de conte A a un miligramo por mililitro, dos microlitros de bloqueador universal y dos microlitros del grupo de bloqueadores. Reúna 24 bibliotecas con códigos de barras en una sola reacción.Agregue un total de uno a tres microgramos de biblioteca de secuencias con códigos de barras agrupados a la mezcla de captura. Perfore de 15 a 20 agujeros en la tapa con una aguja de calibre 20 o más pequeña, aspire la mezcla en un concentrador de vacío de ADN a 60 grados centígrados hasta que esté completamente seca. A continuación, rehidrate la mezcla en el tampón de hibridación y el componente de hibridación A. Cubra los agujeros de la tapa con cinta adhesiva y agite la muestra durante 10 segundos.A continuación, centrifugar la mezcla a máxima velocidad durante 10 segundos. Ahora, incuba brevemente la mezcla a 95 grados centígrados para desnaturalizar el ADN. A continuación, 10 segundos de centrifugación a máxima velocidad a temperatura ambiente en un tubo de tira de PCR de 0,2 mililitros, mezcla 2,25 microlitros de sondas de captura de biblioteca fácil ccap al mismo volumen de agua estéril libre de nucleasa.Luego, en la reacción de la centrífuga, mezcle con el tubo y fluya suavemente el volumen total a través de la punta de una pipeta 10 veces. Ahora incube el tubo de 0,2 mililitros en un termociclador a 47 grados centígrados durante 48 a 96 horas. Mantenga la temperatura de la tapa del termociclador a 57 grados centígrados para evitar la evaporación y estabilizar la temperatura de reacción días después.Utilice los pasos para el lavado y la recuperación del ADN capturado. A continuación, utilice un protocolo de generación ágil de Roche modificado para amplificar el acabado del ADN capturado cuantificando el ADN capturado amplificado mediante el ensayo de alta sensibilidad de qubits. Un grupo de 24 bibliotecas de secuencias con códigos de barras que contenían 12 pares de tumores normales se capturó utilizando sondas de 279 genes de cáncer y se secuenció como dos por 75.Las lecturas de pares de bases en un solo carril de un tumor de células de flujo HighSeq 2000 y bibliotecas normales se agruparon en una proporción de dos a uno. La imagen IGV muestra la especificidad de la cobertura de la secuencia en los exones de EGFR en un cáncer de pulmón, las barras grises representan lecturas de secuencia únicas. La mutación heterocigota T dos G de la derecha estuvo presente en el 24% de las lecturas, lo que indica que se trata de una sustitución somática del aminoácido L 8 58 R.Ninguna de las lecturas de tejido pulmonar normal mostró esta mutación TTA G, algunos indels en un tumor de cáncer colorrectal, el par normal mostró una inserción somática de cambio de marco en un PC o una deleción somática de siete pares de bases. En el TP 53 también se observaron alteraciones en el número de copias entre pares tumorales normales. Cada punto de datos representa un único exón de 279 genes diana.Las ganancias y pérdidas del número de copias se infieren de los aumentos y disminuciones en la secuencia tumoral. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en seis horas y media para la preparación de la biblioteca compartida y de 48 a 96 horas para la hibridación de captura si se realiza correctamente. Si bien es extremadamente importante realizar este ensayo con los contaminantes durante la preparación de la biblioteca, ya que puede confundir el análisis de datos. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la secuenciación de Sanger y el análisis de fragmentos para responder preguntas como, ¿cómo valido una alteración cuestionable? Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar bibliotecas de ADN con códigos de barras y realizar la captura de Exxon en estas bibliotecas agrupadas.

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Investigación

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Biology

Biología

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La detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por Exon de captura y secuenciación masivamente paralelo (Video) | JoVE Journal

La detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por Exon de captura y secuenciación masivamente paralelo

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