La detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por Exon de captura y secuenciación masivamente paralelo

El objetivo general de este procedimiento es identificar mutaciones somáticas en genes asociados al cáncer de células de tejido tumoral mediante el uso de bibliotecas de ADN multiplexadas con códigos de barras, seguidas de secuenciación masiva en paralelo. Esto se logra mediante el primer ligado de adaptadores de secuenciación con códigos de barras a fragmentos de ADN aislados de tumores preservados. El segundo paso del procedimiento es la hibridación a oligonucleótidos biotinilados personalizados, complementarios a todos los exones de recubrimiento proteico de 279 oncogenes y genes supresores de tumores.

El tercer paso consiste en realizar una secuenciación paralela masiva de los grupos con códigos de barras de las bibliotecas capturadas. El último paso es buscar en los datos de la secuencia las alteraciones asociadas al cáncer para los 279 genes objetivo. Este procedimiento puede revelar mutaciones de secuencia, pequeñas inserciones, pequeñas deleciones, alteraciones en el número de copias y alteraciones estructurales seleccionadas.

Por lo tanto, las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes son que permite investigar exones completos tanto para las mutaciones comunes como para las raras, así como identificar alteraciones genómicas adicionales, como pérdidas y ganancias de número de copias, y lograr una mayor sensibilidad en muestras heterogéneas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genómica del cáncer, como ¿cuáles son las mutaciones impulsoras clave en varios tipos de cáncer?, ¿se correlacionan estas mutaciones en muestras clínicas con los resultados o la respuesta a las terapias dirigidas? Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico y el tratamiento del cáncer porque las mutaciones se pueden identificar prospectivamente y se pueden usar para ayudar a guiar a los pacientes hacia las terapias y los ensayos clínicos adecuados.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que un paso de limpieza de la abeja es difícil de aprender debido a una técnica de precaución necesaria al lavar y eludir el ADN de las cuentas: prepare la mezcla maestra de reparación final. Mezcle los volúmenes apropiados para obtener 50 microlitros por muestra. Alícuota los 50 microlitros de cada ADN en pocillos separados de una placa de seis pocillos.

A continuación, añada 50 microlitros de la mezcla maestra de reparación de extremos preparada a cada reacción e incube la placa en un termociclador durante 30 minutos a 20 grados centígrados para limpiar la reacción. En primer lugar, añada 200 microlitros de perlas AMP pure XP a cada muestra y pipetee suavemente todo el volumen hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta multicanal. A continuación, incube la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos.

A continuación, mueva las placas al soporte magnético y deje que se aclaren durante 15 minutos a temperatura ambiente. Una vez limpio, retire y deseche suavemente la mayor parte del sobrenadante teniendo cuidado de no alterar las cuentas. Es posible que quede algo de líquido en los pozos.

A continuación, añada suavemente 200 microlitros de etanol al 80% recién preparado a cada muestra e incube la placa a temperatura ambiente durante 30 segundos. Pipetear con cuidado el etanol y repetir el lavado una vez más. A continuación, deja que el plato se seque a temperatura ambiente hasta que se escape todo el alcohol.

Ahora vuelva a suspender las perlas secas en 44,5 microlitros de agua estéril. Fluya suavemente cada muestra a través de la pipeta 10 veces con la última expulsión. Enjuaga las cuentas adheridas al costado del pozo.

Ahora incube las perlas suspendidas en agua a temperatura ambiente durante dos minutos y luego muévalas al soporte magnético durante cinco minutos hasta que los pozos estén limpios. Por último, transfiera suavemente 42 microlitros del sobrenadante transparente en cada pocillo, que contiene la muestra, a un nuevo pocillo. Las muestras ahora se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados hasta por una semana.

Comience preparando la mezcla maestra de relaves D en un tubo de microcentrífuga estéril. Agregue ocho microlitros de la mezcla maestra de relaves DA preparada a cada pocillo de ADN reparado en el extremo. Luego incube la placa en un termociclador durante 30 minutos a 37 grados centígrados para limpiar la reacción.

Utilice el mismo proceso descrito en la sección anterior al doble del volumen y termine Resus suspendiendo las perlas en 33,75 microlitros de agua estéril. En este punto, las muestras se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados durante un máximo de una semana. Para continuar, prepare una mezcla maestra de ligadura para 15 microlitros por reacción.

Agregue 15 microlitros de la mezcla maestra de ligadura a cada pocillo que contenga el ADN de la cola D. A continuación, añade 1,25 microlitros de los 25 micromolares adecuados. Siguiente adaptador flex con código de barras.

Para cada una, bueno, cada muestra debe recibir un adaptador con código de barras por separado. Una vez cargados los adaptadores, incubar la placa durante 15 minutos a 20 grados centígrados. Ahora, utilizando 50 microlitros de perlas, realice una limpieza posterior a la ligadura del adaptador y vuelva a suspender la muestra en agua estéril a 50 microlitros.

Luego haga el proceso de limpieza por segunda vez, terminando con 23 microlitros de agua. En este punto, las muestras se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados durante un máximo de una semana. El siguiente paso es amplificar la biblioteca de cada muestra, que se detalla en el protocolo de texto sobre el deshielo del hielo, los bloqueadores de oligonucleótidos universales e índices, la biblioteca fácil CCAP y los componentes de captura de gen ágiles, que incluyen el tampón de hibridación TNA dos X y el componente de hibridación.

A.Ahora prepare un grupo de un milimolar de bloqueadores de oligonucleótidos índice correspondientes a las secuencias de adaptadores con códigos de barras específicos utilizados en la preparación de la biblioteca. Combine un microlitro de cada bloqueador y únalos durante 10 segundos En un nuevo tubo de 1,5 mililitros, prepare la mezcla de captura que consta de cinco microlitros de conte A a un miligramo por mililitro, dos microlitros de bloqueador universal y dos microlitros del grupo de bloqueadores. Reúna 24 bibliotecas con códigos de barras en una sola reacción.

Agregue un total de uno a tres microgramos de biblioteca de secuencias con códigos de barras agrupados a la mezcla de captura. Perfore de 15 a 20 agujeros en la tapa con una aguja de calibre 20 o más pequeña, aspire la mezcla en un concentrador de vacío de ADN a 60 grados centígrados hasta que esté completamente seca. A continuación, rehidrate la mezcla en el tampón de hibridación y el componente de hibridación A. Cubra los agujeros de la tapa con cinta adhesiva y agite la muestra durante 10 segundos.

A continuación, centrifugar la mezcla a máxima velocidad durante 10 segundos. Ahora, incuba brevemente la mezcla a 95 grados centígrados para desnaturalizar el ADN. A continuación, 10 segundos de centrifugación a máxima velocidad a temperatura ambiente en un tubo de tira de PCR de 0,2 mililitros, mezcla 2,25 microlitros de sondas de captura de biblioteca fácil ccap al mismo volumen de agua estéril libre de nucleasa.

Luego, en la reacción de la centrífuga, mezcle con el tubo y fluya suavemente el volumen total a través de la punta de una pipeta 10 veces. Ahora incube el tubo de 0,2 mililitros en un termociclador a 47 grados centígrados durante 48 a 96 horas. Mantenga la temperatura de la tapa del termociclador a 57 grados centígrados para evitar la evaporación y estabilizar la temperatura de reacción días después.

Utilice los pasos para el lavado y la recuperación del ADN capturado. A continuación, utilice un protocolo de generación ágil de Roche modificado para amplificar el acabado del ADN capturado cuantificando el ADN capturado amplificado mediante el ensayo de alta sensibilidad de qubits. Un grupo de 24 bibliotecas de secuencias con códigos de barras que contenían 12 pares de tumores normales se capturó utilizando sondas de 279 genes de cáncer y se secuenció como dos por 75.

Las lecturas de pares de bases en un solo carril de un tumor de células de flujo HighSeq 2000 y bibliotecas normales se agruparon en una proporción de dos a uno. La imagen IGV muestra la especificidad de la cobertura de la secuencia en los exones de EGFR en un cáncer de pulmón, las barras grises representan lecturas de secuencia únicas. La mutación heterocigota T dos G de la derecha estuvo presente en el 24% de las lecturas, lo que indica que se trata de una sustitución somática del aminoácido L 8 58 R.

Ninguna de las lecturas de tejido pulmonar normal mostró esta mutación TTA G, algunos indels en un tumor de cáncer colorrectal, el par normal mostró una inserción somática de cambio de marco en un PC o una deleción somática de siete pares de bases. En el TP 53 también se observaron alteraciones en el número de copias entre pares tumorales normales. Cada punto de datos representa un único exón de 279 genes diana.

Las ganancias y pérdidas del número de copias se infieren de los aumentos y disminuciones en la secuencia tumoral. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en seis horas y media para la preparación de la biblioteca compartida y de 48 a 96 horas para la hibridación de captura si se realiza correctamente. Si bien es extremadamente importante realizar este ensayo con los contaminantes durante la preparación de la biblioteca, ya que puede confundir el análisis de datos. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la secuenciación de Sanger y el análisis de fragmentos para responder preguntas como, ¿cómo valido una alteración cuestionable? Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar bibliotecas de ADN con códigos de barras y realizar la captura de Exxon en estas bibliotecas agrupadas.