Name: La detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por Exon de captura y secuenciación masivamente paralelo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-18T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Aprende a detectar mutaciones somáticas en genes asociados al cáncer mediante secuenciación masivamente paralela con captura de exones. Este método utiliza bibliotecas de ADN con códigos de barras para analizar 279 oncogenes.

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Damos las gracias a la Dra. Agnes Viale y el Laboratorio de Genómica MSKCC para la asistencia técnica. Este protocolo ha sido desarrollado con el apoyo del Centro de Investigación del Cáncer Geoffrey Beene y la Fundación Agricultores familia.

1. ADN y Preparación de los reactivos Nota: Este protocolo describe el procesamiento y el análisis simultáneo de 24 muestras (por ejemplo, 12 pares normales / tumorales), pero puede ser adaptado para lotes más pequeños y más grandes. Las muestras de ADN pueden derivar de FFPE o tejido fresco congelado, especímenes citológicos, o sangre. Típicamente, tanto del tumor y el tejido normal del mismo paciente se perfilan juntos con el fin de distinguir las mutaciones somáticas de los polimorfismos heredados. El protocolo comienza inmediatamente después de la extracción de ADN. <ol><li> Alícuota de 50-250 ng (250 ng recomendado) de ADN extraído por muestra, diluida en 1X Tris-EDTA (pH 8,0) tampón a un volumen final de 50 l, en tubos de fondo redondo Covaris separadas. </li><li> Cortar el ADN en el instrumento Covaris E220 con los siguientes ajustes de corte: 360 segundos a 10 factor de trabajo, 175 de PIP y 200 ciclos por ráfaga. </li><li> Descongele Beads XP AMPure (Tabla 2) a temperatura ambiente. Descongele todos bufertas y enzimas en hielo antes de la etapa apropiada. </li></ol> 2. Módulo Reparación End - Preparación Biblioteca <ol><li> Prepare la mezcla maestra reparación fin en un tubo de microcentrífuga estéril utilizando los siguientes volúmenes por muestra: 10 l de 10x NEBNext End Reaction Buffer Reparación (Tabla 2), 5 l NEBNext End Repair Enzyme Mix (Tabla 2), 35 l de nucleasa estéril libre de H 2 O. </li><li> Alícuota de los 50 l de cada ADN cortado en pocillos separados de una placa de 96 pocillos. Añadir 50 l de la mezcla maestra de reparación final preparado para cada reacción. Incubar en un termociclador durante 30 min a 20 ° C. </li></ol> 3. Mensaje End Repair Limpieza <ol><li> Añadir un volumen de 2x (200 l) de los granos XP AMPure (Tabla 2) a cada muestra y pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces usando una pipeta multicanal. Incubar a TA durante 15 min. </li><li> Coloque en el soporte magnético (Tabla 2 </fuerte&gt;) a TA durante 15 min hasta que la muestra aparece clara. </li><li> Retire con cuidado y deseche toma sobrenadante claro cuidado de no molestar a los granos. Un poco de líquido puede permanecer en los pozos. </li><li> Con tubos en el soporte, agregar suavemente 200 l de etanol recién preparada 80% a cada muestra y se incuba la placa a temperatura ambiente durante 30 seg. Con cuidado, separar el etanol mediante una pipeta. </li><li> Repita el paso 5, para un total de 2 lavados con etanol. Asegúrese de que todo el etanol se ha eliminado. Retirar del soporte magnético y dejar secar a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Resuspender perlas secas con 44,5 l H 2 O. estéril Suavemente, toda pipeta de volumen hacia arriba y hacia abajo 10 veces mezclando bien. Asegurarse de perlas se ya no adheridas al lado del pozo. </li><li> Incubar perlas se resuspendieron a TA durante 2 min. Coloque el soporte magnético durante 5 minutos hasta que la muestra parece clara. </li><li> Transferir suavemente 42 l de sobrenadante claro que contiene la muestra a un nuevo pozo. El procedimiento puede hacerse sin riesgo en este ptep y muestras almacenadas a -20 ° C durante un máximo de 7 días. Para reiniciar, descongelar las muestras congeladas en hielo antes de proceder. </li></ol> 4. Preparación Biblioteca - Módulo dA-tizón <ol><li> Preparar la mezcla maestra dA-tizón en un tubo de microcentrífuga estéril utilizando los siguientes volúmenes por muestra: 5 l de 10x NEBNext Reacción dA-tizón Buffer (Tabla 2), 3 l (3&#39;-5 &#39;exo-) Klenow Fragment (Tabla 2 ). </li><li> Añadir 8 l de la mezcla maestra dA-tizón preparada a cada pocillo que contiene 42 l de ADN reparado en sus extremos. Incubar en un termociclador durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Lleve a cabo un post-dA Tailing limpieza: Repita los pasos 3.1 a 3.8 usando volumen 2x (100 l) de cuentas, pero se vuelve a suspender en H2O estéril hasta un volumen final de 33.75 l. El procedimiento se puede detener de forma segura en este paso y las muestras almacenadas a -20 ° C durante hasta 7 días. Para reiniciar, descongelar las muestras congeladas en hielo antes de continuar. &lt;/ Li&gt; </ol> 5. Preparación Biblioteca - Módulo adaptador de ligadura <ol><li> Preparar la mezcla maestra ligadura en un tubo de microcentrífuga estéril utilizando los siguientes volúmenes por muestra: 10 l de 5x NEBNext Ligadura Quick Reaction Buffer (New England Biolabs, Tabla 2), 5 l Quick T4 ADN ligasa (Tabla 2). </li><li> Añadir 15 l de la mezcla maestra ligadura a cada pocillo que contiene el ADN Colas dA. </li><li> Añadir 1,25 l de la 25 adaptador de código de barras M NEXTflex apropiada (Tabla 2) a cada pocillo. Cada muestra debe recibir un adaptador con código de barras separado. Incubar en un termociclador durante 15 min a 20 ° C. </li><li> Realice una ligadura de adaptador de post limpieza: Repita los pasos 3.1 hasta 3.8 utilizando 1 x volumen (50 l) de cuentas, pero se vuelve a suspender en H2O estéril hasta un volumen final de 50 l. </li><li> Repita los pasos 3.1 a 3.8 para un segundo volumen 1x (50 l) de limpieza, pero se vuelve a suspender en H2O estéril a unavolumen final de 23 l. El procedimiento se puede detener de forma segura en este paso y las muestras almacenadas a -20 ° C durante hasta 7 días. Para reiniciar, descongelar las muestras congeladas en hielo antes de proceder. </li></ol> 6. Amplificación Biblioteca <ol><li> Preparar la mezcla maestra KAPA de alta fidelidad en un tubo de microcentrífuga estéril usando los siguientes volúmenes por muestra: 25 l 2x KAPA alta fidelidad SA RM (Tabla 2), 1 l cada uno de 100 M Cebador 1 y Cebador 2 (Tabla 3). </li><li> Añadir 27 l de la mezcla maestra a cada pocillo que contiene el producto de ligación. Establecer pipeta para 50 l y suavemente con la pipeta el volumen arriba y abajo 10 veces. </li><li> Colocar en el termociclador para los siguientes ciclos de PCR: desnaturalización inicial de 45 segundos a 98 ° C, 10 ciclos de 15 segundos a 98 ° C, 30 seg a 60 ° C, 30 seg a 72 ° C, y extensión final de 1 min a 72 ° C. </li><li> Lleve a cabo una amplificación posterior limpieza: Repita los pasos 3.1 a 3.8 usando1 x volumen (50 l) de los granos AMPure XP, y resuspender en agua estéril a un volumen final de 30 l. </li><li> Cuantificar la concentración de cada biblioteca utilizando Qubit Ensayo de Rango amplio (Life Technologies, Tabla 2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol> 7. Roche Nimblegen SeqCap EZ Biblioteca hibridación, lavado, y amplificación <ol><li> Descongele los bloqueadores de oligonucleótidos universales e índice (Tabla 3), SeqCap EZ Biblioteca y componentes de captura NimbleGen (ADN COT, del tampón de hibridación 2x, y el componente de hibridación A, Tabla 2) en el hielo. Todos los bloqueadores de oligonucleótidos se almacenan en acciones de trabajo de 1 mM. Nuestro SeqCap EZ Library es una piscina de diseño personalizado de sondas de captura que abarcan todos los exones codificantes de proteínas de 279 genes asociados con el cáncer, aunque otros diseños personalizados y catálogos pueden ser utilizados. </li><li> Prepare una piscina de 1 mM de los bloqueadores de oligonucleótidos índice correspondientes a la publicidad con código de barras específicosecuencias Aptor utilizados en la preparación de la biblioteca. Combine 1 l de cada bloqueador, y agitar. </li><li> En un nuevo tubo estéril de 1.5 ml, añadir 5 l de ADN COT 1mg/ml, 2 l de 1 mM bloqueador universal y 2 l de la piscina 1 mM de los bloqueadores de oligonucleótidos índice. </li><li> Piscina 24 bibliotecas con código de barras en una sola reacción. Añade un total de 1-3 g de agrupado, biblioteca de secuencias de código de barras (preparado anteriormente) a la mezcla de la captura. Para 24 muestras, se recomienda 100 ng por muestra. Cuando se combinaron los tumores y las muestras normales emparejados, se recomienda la adición de más biblioteca de tumor (por ejemplo 100 ng por tumor y 50 ng por normal) para que se secuencian a una mayor profundidad de la cobertura. </li><li> Cerrar la tapa del tubo y hacer 15-20 agujeros en la parte superior de la tapa con un 18-20 G o aguja más pequeña. Speed ​​Vac las muestras biblioteca / COT ADN / oligos amplificados en un concentrador de vacío de ADN a temperatura alta (60 ° C). </li><li> Una vez secado completamente abajo, rehidratar con 7,5 l de 2x hibridaciónamortiguar zación y 3 l de hibridación componente A. El tubo ahora debe contener lo siguiente: 5 g de ADN COT, g variable de biblioteca muestra amplificada, 1000 pmol de Universal y Índice Oligos, tampón 7,5 l 2x hibridación, 3 componente l hibridación A en un volumen total de 10,5 l. </li><li> Cubra los orificios de la tapa con un pequeño trozo de cinta de laboratorio. Vortex la muestra durante 10 segundos y se centrifuga a la velocidad máxima durante 10 s. </li><li> Incubar la muestra a 95 ° C durante 10 minutos para desnaturalizar el ADN, seguido por centrifugación a velocidad máxima durante 10 segundos a TA. </li><li> En un nuevo tubo de tiras PCR 0,2 ml, prepare 2,25 l alícuota de SeqCap EZ sondas de captura Biblioteca y 2,25 l de estéril libre de nucleasa H 2 O y añadir los contenidos de la etapa 7.7. Pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces. </li><li> Incubar en un termociclador a 47 ° C durante 48-96 horas. Establecer y mantener la temperatura de la tapa del termociclador a 57 ° C. </li><li> Folbajos pasos del Capítulo 6 de la Guía v3.0 del SR del usuario NimbleGen SeqCap EX Library (Tabla 2) para el lavado y la recuperación del ADN capturado. </li><li> Sigue los pasos en el capítulo 7 del protocolo Roche NimbleGen para la amplificación del ADN capturado con las siguientes modificaciones: <ul type="disc"><li> Utilice 2x KAPA de alta fidelidad de la polimerasa (Tabla 2) en lugar de Phusion de alta fidelidad PCR Master Mix </li><li> Utilice 100 M Primer 1 y 2 Primer listado en la Tabla 3. </li><li> Ejecute las siguientes condiciones de PCR: desnaturalización inicial a 98 ° C durante 30 segundos, 11 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 30 segundos, 72 ° C durante 30 segundos, y de extensión final a 72 ° C durante 5 min . Mantener a 4 ° C. </li></ul></li><li> Cuantificar la concentración del ADN capturado amplificado utilizando alta sensibilidad de ensayo Qubit (Tabla 2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Analizar la calidad del ADN capturado utilizando Agilent Biochip de analizador de ADN HS (Tabla 2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. <ul type="disc"><li> El rendimiento de PCR debe ser de al menos 100 ng (rango de 100-1.000 ng). </li><li> La longitud media de fragmento debe ser de entre 150-400 pares de bases. </li></ul></li></ol> 8. Illumina Hola-Seq Secuenciación <ol><li> Diluir el ADN capturado amplificada a 14:00, y la carga de la muestra en un solo carril de una celda de flujo Illumina HiSeq 2000. Secuencia de extremo emparejado 75 pares de bases lee de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En nuestra experiencia, un carril es suficiente para producir 500-700x única cobertura de secuencia por muestra a través de 279 genes para una piscina de 24 muestras. </li><li> Software Illumina (análisis en tiempo real) convertirá las imágenes de alta resolución para las intensidades de racimo basar las llamadas y sus niveles de calidad. Utilice Casava para demultiplexar datos de acuerdo con la identidad del código de barras y generar archivos de FASTQ individuales para cada muestra. </li></ol> 9. Datos Anallisis <ol><li> Secuencias adaptadoras del ajuste del extremo 3 &#39;de la secuencia se lee en los archivos FASTQ utilizando Cutadapt ( <a href="http://code.google.com/p/cutadapt/">http://code.google.com/p/cutadapt/</a> ). La longitud de solape mínima (-O) es 3 con una tasa de error (-E) de 1%. La longitud mínima de la base para la retención de emparejado lee después del corte es de 25. </li><li> Alinear secuencia lee a los de referencia hg19 genoma humano utilizando la herramienta de Burrows-Wheeler alineador (BWA) 12. Realice los pasos de post-procesamiento, incluyendo el marcado duplicado, múltiples locales secuencia de realineamiento y recalibración puntuación de calidad de base utilizando el kit de herramientas de Análisis Genómico (GATK) de acuerdo con las mejores prácticas estándar ( <a href="http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices">http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? name = mejores prácticas</a> ) 13. Al perfilar varias muestras del mismo paciente (por ejemplo, tumor emparejado y normales), múltiples locales secuencia reajuste debe ser rendimientoMED conjuntamente. La salida de estos pasos de procesamiento posterior es un archivo de BAM diferente para cada muestra, que contiene toda la secuencia, la calidad, y la información de alineación y se puede cargar directamente en la Genómica Integrativa Viewer (IGV) para la visualización de lecturas y variantes de secuencia 14. </li><li> Calcular los parámetros de rendimiento de la secuencia utilizando herramientas Picard ( <a href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a> ). Métricas informativas incluyen tasa de alineación, distribución de tamaño de fragmento, GC-contenido asociado sesgo de cobertura, la especificidad de captura en el blanco, PCR duplica la tasa, la complejidad de la biblioteca, y la media de cobertura objetivo. Los valores representativos se muestran en la Figura 1. Las frecuencias alélicas en sitios de polimorfismo comunes calculados utilizando DepthOfCoverage de GATK se utilizan para controlar la contaminación de ADN ajeno y para garantizar que los diferentes muestras provenían de los mismos pacientes. Los siguientes análisis computacional dependen de la presencia de emparejadomuestras tumorales y normales para la detección de alteraciones genéticas somáticas. Tumores sin igual también se pueden analizar usando una muestra separada de control normal, pero las mutaciones somáticas no pueden más fácilmente ser distinguidos de variantes de la secuencia heredados. </li><li> Llame a variantes de nucleótido único somáticas (SNVS) para cada par de tumor normal usando una persona que llama mutación somática, tal como muTect 15, SomaticSniper 16, o Strelka 17. Utilizamos muTect con criterios de filtrado modificados, lo que permite variantes con bajo (distinto de cero) los recuentos de los alelos en la muestra normal, siempre y cuando la frecuencia del alelo es por lo menos 5 veces mayor en el tumor. Variantes recurrentemente llamados en un panel de ADN normales se eliminan como artefactos sistemáticas probables de la secuenciación o la alineación. Cada SNV pasando filtros es luego revisado cuidadosamente con IGV. </li><li> Llame indeles somáticas para cada par de tumor normal usando algoritmos tales como SomaticIndelDetector 13, Dindel 18, o 19 SOAPindel </sup&gt;. Utilizamos SomaticIndelDetector con los siguientes criterios: al menos 10% frecuencia del alelo con al menos 3 de soporte lee, o al menos 2% Frecuencia de alelo con al menos 10 lecturas de apoyo. Nos permitimos para indeles con bajo (distinto de cero) los recuentos de los alelos en la muestra normal, siempre y cuando la frecuencia del alelo es por lo menos 5 veces mayor en el tumor. Indeles llamados en un panel de ADNs normales se eliminan, como anteriormente. Cada indel pasando filtros es luego revisado cuidadosamente con IGV. </li><li> Extrapolar copia estado número en la secuencia de la cobertura en los exones objetivo. Para cada muestra individual, realizar una normalización loess de la cobertura media de secuencia para todos los exones objetivo, la regresión sobre porcentaje GC. Ajuste los valores de cobertura unnormalized restando el ajuste Loess y la adición de la cobertura promedio en toda la muestra. Calcular la relación de cobertura de secuencia normalizada en todos los exones objetivo para pares de tumor normal. En ausencia de una muestra normal correspondiente y / o para disminuir el ruido, otra diploide género coincide conlos controles normales que carecen de variantes de número de copias de la línea germinal se pueden utilizar. Determinar las ganancias y pérdidas de número de copias somáticas sobre la base de los aumentos o disminuciones en la tasa de cobertura. </li><li> Llame a reordenamientos somáticos relacionados con los genes del cáncer en la que al menos un punto de interrupción genómico cae dentro o cerca de un intervalo específico del genoma. Algoritmos sugeridos incluyen GASV 20, Breakdancer 21, CREST 22 y Dranger 23. Inversiones intracromosomal, deleciones y duplicaciones en tándem se pueden distinguir sobre la base de la posición relativa y la orientación de apoyo lee en pares discordantes. Todos los reordenamientos candidatos deben ser revisados ​​manualmente con IGV. Recomendamos validación experimental por PCR y secuenciación de Sanger a través de los puntos de interrupción de reordenamiento putativos. </li></ol>

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<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+oncology+through+integrative+high-throughput+sequencing%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study.</a> Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).</li>
<li>Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+high+throughput+sequencing+in+clinical+cancer+settings%3A+formaldehyde+fixed-paraffin+embedded+%28FFPE%29+tumor+tissues%2C+input+amount+and+tumor+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity.</a> BMC Med. Genomics. 4, 68(2011).</li>
</ol>

Dr. Berger ha recibido honorarios de consultoría y fondos de investigación de Medicina de la Fundación, una compañía de diagnóstico de cáncer.

Nuestro ensayo IMPACT produce una alta tasa de alineación, la alta tasa en el blanco, la meta de cobertura alta, y alta sensibilidad para detectar mutaciones, indeles y copiar alteraciones numéricas. Hemos demostrado la capacidad de nuestro ensayo IMPACT secuencia de ADN de ambos helado en fresco y archivado muestras de FFPE de entrada de baja ADN. Mediante la realización de secuenciación dirigida exón de los genes clave asociados con el cáncer, se puede lograr una cobertura de secuencia muy profundo para los exones de ...

La identificación de &quot;conductor&quot; eventos genéticos tumorales en oncogenes clave y genes supresores de tumores juega un papel esencial en el diagnóstico y el tratamiento de muchos tipos de cáncer 1. Los esfuerzos de investigación a gran escala que utilizan la secuenciación masiva en paralelo &quot;de nueva generación&quot; han permitido la identificación de muchos de estos genes asociados con el cáncer en los últimos años 2. Sin embargo, estas plataformas de secuenciación típicamente requieren grandes cantidades de ADN aisladas a partir de tejidos congelados frescos, lo que plantea una limitación importante en la caracterización y análisis de mutaciones de ADN de tejidos conservados, tales como parafina fijado con formalina incrustado (FFPE) muestras de tumor. La mejora de los esfuerzos para caracterizar de manera eficiente y confiable de la información genómica &quot;recurribles&quot; de muestras de tumores FFPE permitirán el análisis retrospectivo de muestras previamente caballones y seguir fomentando enfoques individualizados para el manejo del cáncer. Tradicionalmente, d molecularlaboratorios iagnostic se han basado en metodologías de bajo rendimiento que requieren mucho tiempo, como la secuenciación de Sanger y PCR en tiempo real para el perfil de mutación del ADN. Más recientemente, los métodos de mayor rendimiento que utilizan PCR multiplexada o determinación del genotipo de espectrometría de masas se han desarrollado para investigar mutaciones somáticas recurrentes en los genes del cáncer clave 3-5. Estos enfoques, sin embargo, están limitados en que sólo las mutaciones predesignadas &quot;punto caliente&quot; se ensayan, que los hace inadecuados para la detección de mutaciones inactivadoras en los genes supresores de tumores. Secuenciación masiva en paralelo ofrece varias ventajas con respecto a estas estrategias que incluyen la posibilidad de interrogar a los exones enteros para las mutaciones tanto comunes como poco frecuentes, la capacidad de revelar las clases adicionales de alteraciones genómicas tales como las ganancias y pérdidas de número de copias, y una mayor sensibilidad de detección en muestras heterogéneas 6, 7 . La secuenciación del genoma entero representa el enfoque más completo para el descubrimiento de la mutación, aunque es relativamente costoso y incurre grandes demandas computacionales para el análisis y el almacenamiento de datos. Para aplicaciones clínicas, en los que sólo una pequeña fracción del genoma puede ser de interés clínico, dos innovaciones particulares en la tecnología de secuenciación han sido transformadora. En primer lugar, a través de la hibridación con sede en el exón captura, se puede aislar el ADN correspondiente a los genes clave asociados con el cáncer de apuntado perfiles mutación 8,. En segundo lugar, a través de la ligadura de los códigos de barras moleculares (es decir, secuencias de ADN de 6-8 nucleótidos de longitud), se puede agrupar cientos de muestras por corrida secuenciación y aprovechar al máximo la capacidad cada vez mayor de instrumentos de secuenciación masivamente paralelo 10. Cuando se combinan, estas innovaciones permiten que los tumores ser perfilado para un menor coste y con mayor rendimiento, con requisitos de cómputo más pequeños 11. Además, mediante la redistribución de la cobertura de secuencia de sólo los genes más importantes para la aplicación particular, uno puede ACHIEve más a fondo la secuenciación para una mayor sensibilidad de detección para eventos de baja frecuencia de los alelos. Aquí describimos nuestro ensayo IMPACT (Integrated Mutación de perfiles de objetivos de cáncer Actionable), que utiliza la captura de códigos de barras en el exón piscinas biblioteca secuencia mediante hibridación utilizando oligonucleótidos personalizados para capturar todos los exones codificadores de proteínas y seleccione intrones de 279 genes claves asociados con el cáncer (Tabla 1 ). Esta estrategia permite la identificación de mutaciones, indeles, alteraciones del número de copias y seleccione reajustes estructurales que implican estos 279 genes. Nuestro método es compatible con el ADN aislado de tanto tejido congelado y FFPE fresca, así como aspirados con aguja fina y otras muestras de citología.

<table><tbody><tr><td>NEBNext Módulo de reparación final</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs</td><td>E6050L</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext dA-Módulo de relaves</td><td>New England Biolabs</td><td>E6053L</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Módulo de ligadura rápida</td><td>New England Biolabs</td><td>E6056L</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter Genómica&</td><td></td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>NEXTflex Códigos de barras sin PCR &ndash; 24</td><td>Bioo Scientific</td><td>514103</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de amplificación de biblioteca HiFi</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2612</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>COT ADN humano, grado fluorométrico</td><td>Roche Diagnostics</td><td>05 480 647 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NimbleGen SeqCap EZ Kit de hibridación y lavado</td><td>Roche NimbleGen</td><td>05 634 261 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SeqCap EZ Library Cebos</td><td>Roche NimbleGen</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de purificación de PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de amplio rango (BR) Qubit dsDNA</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de alta sensibilidad (HS) Qubit dsDNA</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit Agilent DNA HS</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626, 4627</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Covaris</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soporte magnético-96</td><td>Ambion</td><td>AM10027</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Illumina Hi-Seq 2000</td><td>Illumina</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

la detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por exon de captura y secuenciación masivamente paralelo

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Los esfuerzos para detectar e investigar las mutaciones oncogénicas clave han demostrado su utilidad para facilitar el tratamiento adecuado para los pacientes con cáncer. El establecimiento de alto rendimiento, la secuenciación masiva en paralelo &quot;de nueva generación&quot; ha ayudado al descubrimiento de muchas de estas mutaciones. Para aumentar la utilidad clínica y traslacional de esta tecnología, las plataformas deben ser de alto rendimiento, rentable y compatible con parafina fijado en formol e incrustados (FFPE) muestras de tejido que pueden producir pequeñas cantidades de ADN degradado o dañado. Aquí se describe la preparación de bibliotecas de ADN con códigos de barras y multiplexados seguido de captura basados ​​en la hibridación de los exones específicos para la detección de mutaciones asociadas con el cáncer en los tumores congelados y frescos por FFPE secuenciación masiva en paralelo. Este método permite la identificación de mutaciones en la secuencia, copia alteraciones numéricas y seleccionar reajustes estructurales que involucran todos los genes específicos. Targeted secuenciación del exón ofrece tse beneficia de un alto rendimiento, bajo costo, y la cobertura de secuencia de profundidad, lo que confiere una alta sensibilidad para la detección de mutaciones de baja frecuencia.

Una piscina de 24 bibliotecas de secuencias de código de barras (12 pares-tumorales normales) fue capturado utilizando sondas correspondientes a todos los exones codificantes de proteínas de 279 genes del cáncer y se secuenció como 2 x 75 pb lee en un solo carril de una celda de flujo HiSeq 2000. El tumor y bibliotecas normales se agruparon en una proporción de 2:1. Métricas de rendimiento de la muestra para un grupo de muestras de ADN de tumores congelados se muestran en la Figura 1, incluyendo la tasa...

Se describe la preparación de bibliotecas de ADN con códigos de barras y la posterior basada en la hibridación exón captura para la detección de mutaciones clave asociados con el cáncer en las muestras tumorales clínicos de secuenciación masiva en paralelo de &quot;próxima generación&quot;. Targeted secuenciación exón ofrece los beneficios de alto rendimiento, bajo coste, y la cobertura de secuencia profunda, produciendo de este modo una alta sensibilidad para la detección de mutaciones de baja frecuencia.

La detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por Exon de captura y secuenciación masivamente paralelo

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar mutaciones somáticas en genes asociados al cáncer de células de tejido tumoral mediante el uso de bibliotecas de ADN multiplexadas con códigos de barras, seguidas de secuenciación masiva en paralelo. Esto se logra mediante el primer ligado de adaptadores de secuenciación con códigos de barras a fragmentos de ADN aislados de tumores preservados. El segundo paso del procedimiento es la hibridación a oligonucleótidos biotinilados personalizados, complementarios a todos los exones de recubrimiento proteico de 279 oncogenes y genes supresores de tumores.El tercer paso consiste en realizar una secuenciación paralela masiva de los grupos con códigos de barras de las bibliotecas capturadas. El último paso es buscar en los datos de la secuencia las alteraciones asociadas al cáncer para los 279 genes objetivo. Este procedimiento puede revelar mutaciones de secuencia, pequeñas inserciones, pequeñas deleciones, alteraciones en el número de copias y alteraciones estructurales seleccionadas.Por lo tanto, las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes son que permite investigar exones completos tanto para las mutacion

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este manuscrito describe los protocolos clínicos para dos paneles de secuenciación de próxima generación. Un panel interroga a las neoplasias malignas hematológicas, mientras que el otro panel se centra en los genes comúnmente mutados en tumores sólidos. La clasificación molecular de las mutaciones impulsoras en las neoplasias malignas humanas ofrece información pronóstica y predictiva valiosa.

Siguiente Generación de secuenciación para la detección de mutaciones procesable en tumores sólidos y líquidos

Se describe un sistema integrado para la secuenciación dirigida de próxima generación de muestras oncológicas. Este sistema multiplataforma está optimizado para biopsias tumorales de baja calidad y baja cantidad, se adapta a entradas de ADN bajas, incluye controles multivariantes bien caracterizados y cuenta con un nuevo llamador de variantes que se basa en medidas cuantitativas de control de calidad preanalítico.

Integración de Procesos húmedo y en seco de banco Optimiza Targeted secuenciación de próxima generación de baja calidad y biopsias de tumores de baja cantidad

Este manuscrito describe una técnica para la detección de mutaciones de baja frecuencia en ctDNA, ER-SS. Este método se distingue por su uso único de corrección de errores de bidireccional, un filtro de fondo especial y eficiente adquisición molecular.

Detección de mutaciones raras en CtDNA usando la siguiente secuencia de generación

Obtención de ADN genómico de la alta calidad de los tejidos del tumor es un primer paso esencial para el análisis de alteraciones genéticas mediante la siguiente secuencia de generación. En este artículo presentamos un método simple y rápido para enriquecer las células tumorales y obtener ADN intacto del toque de muestras de citología de impresión.

Método simple y rápido para obtener alta calidad Tumor ADN de especímenes clínicos patológicos mediante citología de impresión táctil

Aquí, presentamos un protocolo para detectar mutaciones somáticas tumorales en el ADN circulante presente en fluidos biológicos del paciente (biofluidos). Nuestro método basado en la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (dPCR) permite cuantificar la frecuencia alélica de la mutación tumoral (MAF), facilitando un complemento mínimamente invasivo para el diagnóstico y el monitoreo temporal de la respuesta tumoral.

Detección y seguimiento del ADN circulante asociado a tumores en biofluidos del paciente

Este artículo describe un método para identificar alteraciones clonales y subclonales entre diferentes especímenes de un paciente dado. Aunque los experimentos descritos aquí se centran en un tipo de tumor específico, el enfoque es ampliamente aplicable a otros tumores sólidos.

Análisis comparativo de lesiones a través de un enfoque de secuenciación dirigida

Este artículo detalla el uso de un kit de preparación de biblioteca sin reacción en cadena de múltiples polimerasas anclada seguido de secuenciación de próxima generación para evaluar las fusiones de genes oncogénicos en muestras de tumores sólidos clínicos clínicos. Se describen los pasos de análisis de datos y de banco húmedo.

Detección de fusión genética oncogénica mediante reacción en cadena de polimerasa múltiplex anclada seguida de secuenciación de próxima generación

Aquí presentamos un protocolo para probar la eficacia de las terapias dirigidas seleccionadas en base a la composición genómica de un tumor. El protocolo describe la identificación y validación de reordenamientos estructurales del ADN, injerto de tumores de los pacientes en ratones y pruebas de respuestas a los fármacos correspondientes.

Pruebas de terapias dirigidas en cáncer mediante análisis de alteración estructural del ADN y xenoinjertos derivados del paciente

El aumento de los biomarcadores moleculares que se deben probar para el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas no escamosas (NS-NSCLC) ha impulsado el desarrollo de métodos de detección molecular rápidos y fiables. Describimos un flujo de trabajo para la evaluación de la alteración genómica en pacientes con NSCLC-NSCLC utilizando un enfoque de secuenciación ultrarrápida de nueva generación (NGS).

Secuenciación ultrarrápida de próxima generación basada en amplicones en el cáncer de pulmón no escamoso y no microcítico

Este protocolo proporciona un método reproducible para visualizar la amplificación de genes en muestras de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE).

Detección robusta de la amplificación génica en muestras fijadas en formol e incluidas en parafina mediante hibridación fluorescente in situ

Este protocolo describe un flujo de trabajo de secuenciación de próxima generación automatizado y acreditado por ISO15189 para detectar alteraciones genómicas dirigidas en tejidos incluidos en parafina fijados en formol de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

Detección de alteraciones dirigidas en el cáncer de pulmón de células no pequeñas mediante secuenciación de próxima generación

Aprende a detectar mutaciones somáticas en genes asociados al cáncer mediante secuenciación masivamente paralela con captura de exones. Este método utiliza bibliotecas de ADN con códigos de barras para analizar 279 oncogenes.

La detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por Exon de captura y secuenciación masivamente paralelo (Video) | JoVE Journal

La detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por Exon de captura y secuenciación masivamente paralelo

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