Name: Interrogatorio funcional de adultos hipotalámica neurogénesis con focal Radiológica Inhibición (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-14T22:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Aprende a realizar irradiación focal en modelos animales pequeños mediante tomografía computarizada tridimensional para inhibir neurogénesis hipotalámica. Esta técnica permite estudiar el papel funcional de poblaciones específicas de progenitores neuronales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Damos las gracias a C. Montojo, J. Reyes y M. Armadura de asesoramiento y asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos de subvención F31 NS063550 (a DAL), un premio Basil O&#39;Connor arranque Académico y subvenciones del Fondo Klingenstein y NARSAD (a SB). SB es un WM Keck Distinguido Académico Joven en la investigación médica.

Uso de los Animales Obtener la aprobación del Comité de Cuidado de Animales y el empleo institucional de los protocolos de atención y de uso estándar. El protocolo actual fue desarrollado para estudios de irradiación focales sobre 5.5-10 semanas de edad adultos ratones C57BL6 / J, como se describió previamente (Figura 2) 2. Sin embargo, otras edades y especies de pequeños animales (ratas, hamsters, ardillas de tierra, etc) también pueden utilizarse, siempre que los protocolos de anestesia efectiva y un atlas de referencia radiográficos que permiten la identificación de la región de interés (ROI) se encuentran disponibles. 1. Calibración de guiada por TC Plataforma Radiológica Realice las calibraciones basadas en películas para la dosis de radiación en la plataforma radiológica de antemano para cada tamaño del colimador y el tipo de filtro del tubo de rayos X utilizada. Con el fin de dirigir un haz de arco de la irradiación en el lugar de destino deseado, utilice el software de planificación de la dosis de radiación 49 dise en la mayoría de las plataformas comerciales de radiación para calcular el tiempo de entrega requerido en base a la dosis de radiación, la profundidad de la región de interés (ROI) en base a las tomografías computarizadas del ratón, y la velocidad de rotación de la plataforma robótica; detalles sobre este se quedan fuera de este protocolo, ya que difieren entre las plataformas de radiación. A los efectos de visualizar el hipotálamo ventrobasal 2 (Figura 3) con imagen de CT, operar el tubo de rayos X con un punto focal 0,4 mm y la energía del haz de 100 kVp con 1 mm de Al filtración. Para la irradiación focal de la HPZ, operar el tubo de rayos X a 225 kVp, 13 mA, y un punto focal de 1 mm con la filtración de 0,15 mm de Cu, para entregar 10 Gy de radiación a una profundidad de tejido de 0,6 cm durante un tratamiento tiempo de 4,6 min. Targeting entre diferentes regiones de interés requerirá calcular diferentes parámetros. <ol><li> Si el estudio de los efectos de la dieta rica en grasas sobre la neurogénesis en la eminencia media a lo descrito previamente 2, obtener C57B hembra de cuatro semanas de edad,L6 / J ratones de laboratorios Jackson ratón, y las casas cuatro ratones por jaula. Desconecte la alimentación de pienso normal a una dieta alta en grasa a las cinco semanas de edad. Permitir a los ratones para aclimatarse a la nueva vivienda y alimentación. Realizar el tratamiento CFIR en 5,5 semanas de edad. Transporte somete a la sala de operación que contiene la plataforma radiológica. Minimizar los niveles de estrés durante la transferencia. Prepare la cámara de gas de anestesia isoflurano. A continuación, agregue un solo ratón en la cámara. De forma paralela, preparar almohadilla eléctrica (baja temperatura) para el post-tratamiento. </li><li> Una vez que el ratón está bajo y ya no responde a la compresión del pie-pad, llevar el tema a la plataforma radiológica y colocar sobre la cama inmovilización de la fase de robótica. Coloca la boca del sujeto dentro de la taza anestesia ojiva, y los dientes en el protector bucal (Figura 1D). Acuéstese ratón sobre la cama inmovilización y comprobar para ver si se sigue manteniendo la insensibilidad. Si es así, con cinta adhesiva del ratón a la cama con cinta de gasa. Mientras la grabación pulsado el ratón para la cama, Asegúrese de que la cabeza se nivela a un plano horizontal. Esto se puede determinar tirando hacia arriba de las orejas y viendo si se nivelan. Una vez que el ratón está en la posición correcta, cierre la pantalla protectora de plomo. </li><li> Adquirir la exploración de tomografía computarizada utilizando el software de a bordo de la plataforma radiológica del experimentador (esto será diferente entre las plataformas), que proporcionará un análisis estructural anatómico tridimensional del sujeto ratón. Compruebe si la cabeza del ratón está nivelado con el plano horizontal. Si no, repita los pasos 1.2 a 1.3 hasta que se estabilizó la cabeza del sujeto. </li><li> Identificar el ROI imagen CT. Calcular la distancia de retorno de la inversión a la superficie del cráneo con un ángulo de 45 ° con el plano horizontal como se muestra en la Figura 3E. </li><li> El uso de software de a bordo, toma una placa de rayos X de la asignatura ratón desde arriba, como se muestra en la figura 4A. A continuación, retire el ratón desde la plataforma radiológica, se puso el cojín de la calefacción, y el monitor hasta que activa. </li><li> De las imágenes de TC coronal, el cálculo de la profundidad media anatómica retorno de la inversión de por lo menos tres ratones para determinar la dosificación de entrega. Como un ejemplo de un estudio previo 2 que se administró 10 Gy de irradiación para el hipotálamo ventrobasal, la profundidad de la ROI desde el cráneo (a partir de un ángulo de 45 °) es 0,66 cm (véase la figura 3E). Sabiendo eso, los investigadores utilizaron el software de planificación de dosis (DPS) instalado en su plataforma radiológico para calcular la velocidad de rotación adecuado y la duración del tratamiento para conseguir la dosis deseada al ROI. </li><li> Después de determinar la duración del tratamiento y la velocidad de rotación de la fase de robótica con el software de planificación de dosis, medir distribuciones de dosis de los parámetros calculados con películas sensibles a la radiación Gafchromic incrustados en un modelo de ratón maqueta de plástico-el equivalente en agua. Para ello, insertar tres películas Gafchromic sensibles a la radiación entre los cuatro bloques de plásticos equivalentes a agua apiladas verticalmente 29 comose muestra en la Figura 4B. </li><li> Coloque modelo de ratón maqueta que contiene películas Gafchromic en el escenario robótico, y ejecutar el haz de irradiación focal con los parámetros recién calculados. Por ejemplo, para apuntar el hipotálamo ventrobasal, los parámetros de entrada de 0,15 mm de filtro de Cu, 225 kVp, 13 mA, ajuste de 1 mm de diámetro del haz de radiación, 45 ° ángulo de pórtico, 1,3 ° / seg rotación, y 4,6 min para lograr un retorno de la inversión dosis radiológica de 10 Gy. </li><li> Después de la irradiación, compruebe las películas para el patrón y la intensidad de la dosis de radiación. Para una rotación de ángulo de 360 ​​° con los parámetros enumerados para apuntar el hipotálamo ventrobasal, un anillo oscuro en la película por encima del isocentro, un pequeño punto crujiente en la película isocentro, y un anillo más ligero en la película por debajo de la isocentro correspondiente al cono- administración de haz de la radiación se observó (Figura 4B). </li><li> Superponer isocentro película Gafchromic largo de los rayos X de los sujetos ratón a los que los parámetros eran calcalculado. El punto focal irradiado en el isocentro debe superponerse con la región ROI deseada como se muestra en la Figura 4C. </li></ol> Método alternativo: Si la dificultad en la selección de ROI cerebral persiste, utilice contraste yodado inyectado por vía intratecal para mejorar la visualización de los ventrículos bajo las imágenes de TC. En aras de la brevedad, este procedimiento se deja fuera de este protocolo, pero se describe previamente 35, 50. Contraste de yodo proporcionará hitos ventriculares adicionales (Figura 5A). 2. Determinar la exactitud de irradiación de haz Confirmar aún más la precisión CFIR haz mediante visualización directa del haz de radiación en el tejido 2, 35, 51. Para ello, lleve a cabo la inmunohistoquímica para detectar γH2AX 51, una proteína histona y un marcador precoz de ADN de doble filamento se rompe. Sujetos Ratón deben transcardially perfundidos y fijados dentro de la hora de la irradiación. Después de la irradiaciónación, la reparación del ADN sobreviene rápidamente, y los niveles de ΥH2Ax disminuyen significativamente 35. <ol><li> Repita los pasos 1.1 a 1.3. </li><li> Después de que el destino se identifica en la TC, el tema del ratón se mueve bajo control robótico para alinear este objetivo con el haz de administración de la radiación. Parámetros calculados de entrada (velocidad de rotación y duración del tratamiento para lograr la dosis deseada) desde el paso 1.6 en el software de la dosis de planificación y comenzar el tratamiento. El tratamiento se suministra con el pórtico se refirió a 45 ° respecto a la vertical, mientras que el ratón hace girar alrededor de un eje orientado verticalmente. </li><li> Después de la irradiación, lleve a cabo la perfusión transcardial sobre temas de ratón. Realizar la perfusión dentro de una hora 52. Después de cerebros de perfusión, fix inmersión en el 4% PFA / PBS y mueva suavemente la noche a 4 ° C. </li><li> A la mañana siguiente, lavado de 5 min en PBS 3x para eliminar fijador paraformaldehído. Luego, sumerja en el 30% de sacarosa en PBS 1x en una mecedora a 4 ° C. </li><li> Agite suavemente a 4 º C (usdualmente 12-16 h), hasta que el cerebro se hunde hasta el fondo del tubo. Esto sirve como un paso crioprotección. Una vez que el cerebro se hunden, retire el cerebro con una cuchara perforada para evitar el exceso de 30% sucrose/1x transferencia PBS. Rápidamente incrustar en medio de congelación en hielo seco. Agitar medio de congelación con puntas de pipeta y alinear cerebral en moldes de plástico. </li><li> Una vez completamente congelado, transferir bloques cerebrales a -20 ° C congelador para su almacenamiento. </li><li> El día en que se llevará a cabo la inmunohistoquímica, sección coronal a 40 micras de espesor, y flotan en una placa de 24 pocillos que contenía PBS con un pincel fino. Secciones deben mantenerse en orden serial correcto para inmunotinción para determinar la cobertura de la irradiación de la región de destino. </li><li> Precalentar 0,01 M de solución de citrato de sodio a 80 ° C en baño de agua en preparación para la etapa de recuperación de antígeno. Al mismo tiempo, mientras que el citrato de sodio se está calentando, realice 5 min lavados 3 veces en 0,01 M PBS. </li><li> Una vez solución de citrato de sodio es a 80 ° C, se sumergen secciones de cerebro iN la solución tampón de citrato de sodio. Dejar en baño de agua a 80 ° C durante 1 hora. </li><li> Retire la sección y permita que la solución de citrato de sodio alcance la temperatura ambiente, a continuación, realizar tres lavados de 5 minutos en 0,01 M de PBS. </li><li> Bloquee las secciones del cerebro durante 1 hora en PBS-Triton que contiene 5% de suero normal de cabra. </li><li> Incubar las secciones del cerebro durante la noche en PBS-Triton que contienen 5% de suero normal de cabra con 1:700 concentración de ratón anti-fosfo-H2AX anticuerpo primario a 4 º C. </li><li> Al día siguiente, realizan 15 min lavados 3 veces en 0,01 M PBS-Tritón. </li><li> Incubar las secciones del cerebro de PBS-Triton que contiene 5% de suero normal de cabra con la cabra anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo 488 nm a 1:500 concentración durante 2 horas. </li><li> Efectuar 15 min lavados 3 veces en 0,01 M PBS-Tritón. </li><li> Realizar 4 &#39;,6-diamino-2-fenilindol (DAPI) mancha (1:5.000 en PBS) durante 10 min para visualizar núcleo. A continuación, lavar las secciones del cerebro durante 5 min con PBS. </li><li> Montar en electrostáticamente chmicroscopio arged desliza por la sección flotante en PBS. Limpie el exceso de PBS y permitir que se sequen. Cubreobjetos las diapositivas utilizando medio de montaje y deje que los portaobjetos se sequen en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. </li><li> Tome fotografías de secciones coronales de serie con microscopio de fluorescencia. ΥH2Ax inmunotinción (verde) indica el sitio de la irradiación. DAPI (azul) es un colorante nuclear (Figura 5B). </li></ol> 3. Preparación de Ratón Temas de irradiación focal Examine los resultados de inmunotinción ΥH2Ax. Una vez satisfecho con la calibración y la orientación del haz de irradiación, proceder con el experimento. En este punto, el tiempo total requerido para el tratamiento de un ratón (de la configuración de los animales a la finalización de la entrega de haz) es de aproximadamente 10-15 minutos para un tratamiento de 10 Gy con un haz de 1 mm. <ol><li> Orden de cuatro semanas de edad, los ratones hembras C57BL6 / J de los laboratorios Jackson Ratón. Casa de cuatro ratones por jaula, y cambie la comida de pienso normala una dieta alta en grasa a las cinco semanas de edad. Ratones sacador del oído para darles marcas de identificación únicos. Monitorizar la salud de los ratones diariamente. Nota: marcadores metálicos no pueden ser utilizados, ya que darán lugar a rayas artefactos en la CT. </li><li> Pesar los ratones el día antes de la radioterapia o la farsa. Los ratones se dividieron en dos grupos para la radiación o el tratamiento simulado y asegurar que no hay una diferencia significativa en el peso entre las cohortes. En el día del tratamiento, cuando los ratones tienen seis semanas de edad, pesar de nuevo todos los ratones y registrar su masa. Transportar suavemente ambas cohortes a la plataforma radiológica. Tenga cuidado para reducir al mínimo los niveles de estrés. </li><li> Prepare la cámara de gas de anestesia isoflurano. Anestesie dos ratones, uno en el grupo de irradiación predeterminado, y otro en el grupo de control simulado. Preparar almohadilla térmica en el nivel bajo para el tratamiento postoperatorio. </li><li> Siga los pasos 1.2 a 1.4 para el mouse para recibir irradiación. Para el ratón farsa, mantenga el ratón en la cámara de anestesia mientras que el tratamiento continúa. Hacer sure que cámara de anestesia es cerca de la plataforma CFIR así cualquier efecto sobre la radiación ambiental son factores pulg Después de que el destino se identifica en la TC, mueva el ratón sujetos bajo control robótico para alinear este objetivo con el haz de administración de la radiación. Entrada calcula parámetros (velocidad de rotación y duración del tratamiento) en el software de planificación de dosis. </li><li> Una vez que el tratamiento de irradiación se ha completado, regrese ambos, farsa y ratones irradiados con almohadilla de calefacción, y monitorear hasta que se despiertan. </li><li> Volver tanto farsa y ratones irradiados a las instalaciones de los animales. Supervise todos los días. Pesar los ratones cada media semana. Para confirmar la irradiación de la zona proliferativa específica hipotalámico, administrar inyecciones intraperitoneales de BrdU (50 mg / kg), tres días después del tratamiento y examinar la neurogénesis entre grupos por colabeling de inmunohistoquímica para BrdU y un marcador neuronal un mes después de la exposición inicial de BrdU (Figura 6) 2. </li></ol>

JW tiene una financiación de la investigación y de consulta acuerdos con Xstrahl, Inc.

La irradiación focal guiada por tomografía computarizada (CFIR) es un enfoque novedoso y completo sistema capaz de entregar los campos de radiación a los objetivos en pequeños animales bajo control robótico utilizando CT-guía 32. La capacidad de CFIR para que emita haces altamente enfocados a los pequeños modelos animales proporciona nuevas oportunidades de investigación para colmar la investigación de laboratorio y la traducción clínica. En este trabajo se describe el enfoque CFIR para la entrega precisa de ...

Descubrimientos recientes han demostrado que el cerebro adulto de mamíferos puede someterse a un notable grado de plasticidad. Neuronas adultas nacidas se generan durante la edad adulta en nichos especializados del cerebro de los mamíferos 1. ¿Cuál es la función de estas neuronas adultas nacidas? Y más aún, es lo que desempeñan un papel en la fisiología y el comportamiento? Los estudios sobre este tema se han centrado tradicionalmente en la zona subventricular de los ventrículos laterales y la zona subgranular del hipocampo, sin embargo, estudios recientes han caracterizado la neurogénesis en otras regiones del cerebro tales como el hipotálamo 2 de mamífero. La neurogénesis se ha informado en el posnatal y el hipotálamo adulto 2-10, y la función de estas neuronas hipotalámicas recién nacidos sigue siendo un área activa de investigación. La caracterización funcional de las neuronas adultas nacidas sigue siendo un reto importante para el campo de la neurociencia en general. La inhibición selectiva de especificaciónific poblaciones progenitoras neurales sigue siendo limitada por la falta de marcadores moleculares disponibles que son exclusivos de las poblaciones progenitoras neuronales individuales 11. Por lo tanto, la eliminación selectiva de las neuronas adultas nacidas de estos progenitores neurales a través de modificación genética dirigida sigue siendo difícil. Del mismo modo, la entrega viral para apuntar neuronas adultos nacidos sufre de posibles variables de confusión tales como la introducción de la lesión y la inflamación en el medio ambiente 12. Nuevas herramientas radiológicas están surgiendo, sin embargo, que le permiten a uno evitar estos factores de confusión e investigar estas preguntas a través de la orientación anatómica exacta y precisa en pequeños animales. La radiación ionizante inhibe el nacimiento y la diferenciación de nuevas neuronas, y permite que un método no invasivo para apuntar las poblaciones progenitoras neurales 13-15. Recientemente, hemos descrito una región germinal de la eminencia media del hipotálamo de los mamíferos (ME) que hemos llamado la zona proliferativa hipotalámico (HPZ) 2 </sup&gt;. Hemos encontrado que cuando los jóvenes ratones hembras adultas se les dio una dieta alta en grasas (HFD), los niveles de neurogénesis en ratones alimentados con HFD eran sustancialmente más alto que su pienso normal (NC) controles alimentados en esta región ME 2. Para probar si la neurogénesis adulta en el ME hipotálamo regula el metabolismo y el peso, se trató de interrumpir este proceso. La eminencia media es una pequeña estructura unilateral en la base del tercer ventrículo a partir del cual se liberan hormonas reguladoras. Con el fin de inhibir la proliferación y posterior neurogénesis sin alterar las otras funciones fisiológicas de esta región del cerebro, hemos desarrollado una técnica de irradiación focal no invasivo para inhibir selectivamente el nacimiento de neuronas adultas recién nacidos en la eminencia media del hipotálamo 2. Un número de grupos han empleado la radiación para suprimir la neurogénesis en regiones canónicas 14-28. Sin embargo, los enfoques radiológicos anteriores generalmente se han centrado en grandes áreas, o often involuntariamente también dirigido múltiples áreas del cerebro donde se ha reportado la neurogénesis, por lo que es difícil asociar de forma inequívoca los defectos de comportamiento observados con defectos en poblaciones específicas progenitoras neurales. La capacidad de irradiación más específico es proporcionado por plataformas radiológicos que combinan omputer imagen guiada por tomografía con c f ocal radiación rayos IR (CFIR) entrega para permitir anatómica precisa orientación 29-36. Rayos de la radiación tan pequeñas como de 0,5 mm de diámetro están disponibles para dirigirse a poblaciones progenitoras neurales específicas 35. Esta metodología nos permite apuntar el ME hipotálamo y detener la proliferación y el bloque de la neurogénesis en animales pequeños. Después del tratamiento radiológico en estas poblaciones progenitoras, pruebas fisiológicas y de comportamiento se pueden realizar para iluminar la función potencial de las células adultos nacidos. Focalización focal es especialmente importante para nuestra aplicación, ya que elglándula pituitaria está situada cerca de la eminencia media del hipotálamo; irradiación de la hipófisis puede afectar la función hormonal y posteriormente confundir los resultados. La base biológica para la supresión de la neurogénesis después de la irradiación sigue siendo poco clara. Estudios de radiación previos se han basado en grandes vigas de la zona, y han llegado a la conclusión de que la supresión de la neurogénesis está mediada a través de una respuesta inflamatoria 14, 37. Como tal, no está claro si la irradiación altamente focal podría suprimir la neurogénesis, ya que no provoca una respuesta inflamatoria sustancial. Sin embargo, estudios recientes realizados por nuestro grupo de la región clásico neurogénica en el hipocampo han demostrado que la irradiación altamente focal con una dosis de 10 Gy puede suprimir la neurogénesis durante al menos 4 semanas después de la irradiación 35. Para interrogar a la función de las neuronas hipotalámicas adultos nacidos en la eminencia media, se utiliza una radiación de precisión device capaz de entregar imágenes de TC en combinación con haces de radiación de pequeño diámetro para inhibir ME neurogénesis. El uso de un tubo de rayos X unido a un pórtico que gira sobre un rango de 360 °, ofrecemos arco de haz del haz de micro irradiación con el uso de una etapa espécimen controlado robóticamente que permite la rotación de un sujeto animal durante el tratamiento de radiación (Figura 1) . Un detector de rayos X de alta resolución se utiliza para adquirir imágenes cuando el pórtico se encuentra en la posición horizontal 33. Para este estudio, las imágenes de TC fueron reconstruidos con un tamaño de voxel isotrópico de 0,20 mm. De imágenes de a bordo CT permitió la identificación de un objetivo, mientras que el animal está en la posición de tratamiento. El objetivo fue localizado mediante el software de planificación de la dosis de navegación CT, que estaba incluido en nuestra plataforma radiológica disponible en el mercado. Después de la localización de nuestro ROI por la TC, el animal se mueve a la posición de tratamiento apropiado por la platina robótico que tiene cuatro gradosrees de libertad (X, Y, Z, θ). A través de una combinación de ángulos de pórtico y de la etapa de robot, las vigas pueden ser entregados desde casi cualquier dirección con respecto al animal, y tratamientos de arco estereotácticas son posibles 29. Para estos y todos los otros estudios de imágenes, los ratones fueron colocados en un dispositivo de inmovilización que permite el suministro de gas isoflurano anestésico mientras se restringe el movimiento. La cama inmovilización es compatible CT, y se conecta a la platina robótico 34. Esperamos que CFIR proporcionará avances conceptuales en una serie de áreas de investigación. A pesar de que utiliza la orientación radiológica de la eminencia mediana del hipotálamo como prueba de principio de esta técnica, CFIR se puede utilizar para dirigirse a cualquier región del cuerpo de cualquier organismo modelo pequeño, en principio. En las neurociencias, por ejemplo, prevemos esta técnica podría utilizarse para evaluar la función de las poblaciones progenitoras activamente proliferativas que se ha sugerido que exist en otros órganos circumventricular, tales como el área postrema 38, 39, órgano subfornical 40, y la pituitaria 41. Controversias de larga data en cuanto al papel funcional de la neurogénesis adulta y la identificación de un papel causal en el comportamiento pueden ahora ser mejor atendidos. En cantante, esta técnica podría abordar el papel de la neurogénesis adulta en el mantenimiento de el comportamiento robusto y estacional de canto de los pájaros 42, que ha sido obstaculizado por la capacidad de inhibir selectivamente la neurogénesis en regiones específicas del cerebro. La comprensión de este modelo de comportamiento robusto podría arrojar nueva luz sobre el papel de la neurogénesis adulta en la regulación de otras conductas de dimorfismo sexual. Alternativamente, en el campo metabólico, CFIR podría ser utilizado para explorar aspectos de la función de la proliferación de hepatocitos y su papel en el metabolismo y el balance energético. La posibilidad de que avance conceptual en múltiples disciplinas de investigación se ve reforzada por la introducción de esta técnica. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; En este trabajo se demuestra la capacidad de CFIR para anatómica precisión la orientación de un haz de irradiación focal. A pesar de que inicialmente desarrollado esta plataforma de investigación de la radiación de pequeños animales (SARRP) para nuestros estudios, otros dispositivos similares están ahora disponibles comercialmente que puede lograr la irradiación similares guiada por TC focal 43, 44. Por lo tanto, se generaliza este protocolo CFIR con los pasos necesarios para todas las plataformas de investigación en lugar de los que son específicos para SARRP. Las ventajas de CFIR más de los enfoques radiológicos anteriores para inhibir la neurogénesis son que esta técnica permite la orientación de imagen volumétrica tridimensional para la localización y la orientación de la dosis, la dosis de conformación minimiza la exposición a regiones del cerebro no focalizados, y la geometría del haz de alta precisión permite una distribución de dosis conforme con límites haz afilados. Planteamos cómo utilizar imágenes guiada por TC para apuntar la dosis a una región anatómica específica, y al hacerlo, la forma de visualizar la radiaciónDistribución de la dosis directamente en el tejido mediante la tinción inmunohistoquímica para γ-H2AX, un marcador de roturas de doble cadena de DNA 35, 45-48. El uso de este enfoque para la irradiación selectiva de nichos neurogénicos puede tener implicaciones significativas en cuanto a revelar el papel funcional de las nuevas neuronas adultas nacidas en la fisiología y la enfermedad.

<table><tbody><tr><td>Plataforma de investigación SARRP</td><td>Xstrahl</td><td>RS225A</td><td><a href="http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm" target="_blank">http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm</a></td></tr><tr><td>SARRP búnker de irradiación</td><td>Xstrahl</td><td></td><td>Opcional, pero la exposición a la radiación debe limitarse con un blindaje de plomo alternativo</td></tr><tr><td>Película crómica GAF IPS</td><td></td><td>GAFchromic ETB2</td><td></td></tr><tr><td>Fantoma de ratón</td><td>Gammex</td><td>457</td><td>Compre losas de agua sólida de 0.5 cm x 30 cm x 30 cm de Gammex y córtelas al tamaño deseado.</td></tr><tr><td>Anticuerpo antifosfohistona H2AX Ser139 para ratones</td><td>Millipore, Inc.</td><td>05-636</td><td>clon JBW301</td></tr><tr><td>Dieta alta en grasas para roedores</td><td>Dietas de investigación</td><td>D12492i</td><td>60% de las calorías en forma de grasa, los alimentos deben ser irradiados</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>10019-360-40</td><td></td></tr><tr><td>0.01 M Citrato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>1.471 g de citrato de sodio disuelto en 500 ml de agua desionizada</td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td><td>diapositivas Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>contratinción nuclear</td></tr><tr><td>Se prefiere el medio de montaje</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>, Vectashield o Gelvatol</td></tr></tbody></table>

interrogatorio funcional de adultos hipotalámica neurogénesis con focal radiológica inhibición

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

La caracterización funcional de las neuronas adultas nacidas sigue siendo un reto importante. Enfoques para inhibir la neurogénesis adulta a través de la entrega viral invasivo o animales transgénicos tienen potenciales factores de confusión que hacen que la interpretación de los resultados de estos estudios sean difíciles. Nuevas herramientas radiológicas están surgiendo, sin embargo, que le permiten a uno investigar de forma no invasiva la función de grupos selectos de las neuronas adultas nacidas a través de la orientación anatómica exacta y precisa en pequeños animales. La radiación ionizante focal inhibe el nacimiento y la diferenciación de neuronas nuevas, y permite la orientación de las regiones específicas progenitoras neurales. Con el fin de iluminar el papel funcional potencial que la neurogénesis adulta hipotálamo desempeña en la regulación de procesos fisiológicos, hemos desarrollado una técnica de irradiación focal no invasivo para inhibir selectivamente el nacimiento de neuronas adultas nacidas en la eminencia media del hipotálamo. Se describe un método para C omputer guiada por tomografíaf ocal ir radiación (CFIR) entrega para permitir anatómica precisa y exacta orientación en pequeños animales. CFIR utiliza guía de imagen volumétrica tridimensional para la localización y la orientación de la dosis de radiación, minimiza la exposición a la radiación de las regiones del cerebro no focalizados, y permite la distribución de la dosis de conformación de haz con límites afilados. Este protocolo permite a uno a preguntarse cuestiones relativas a la función de las neuronas adultos nacidos, sino que también abre las áreas a las preguntas en las áreas de la radiobiología, la biología del tumor, y la inmunología. Estas herramientas radiológicas facilitará la traslación de los descubrimientos en el laboratorio a la cabecera del paciente.

Evaluar Targeting guiada por TC y Precisión La calibración mecánica del sistema es crítica para asegurar que los haces de todos los varios ángulos se cruzan en un solo punto. La calibración se lleva a cabo con un método basado en la formación de imágenes semiautomático, donde la precisión de alineación de extremo a extremo se ha medido para ser de 0,2 mm 29. Esta precisión es muy crítico como el volumen de la estructura de la eminencia mediana del hipotálamo es pequeña 2. ...

La función de las neuronas de mamíferos adultos nacidos sigue siendo un área activa de investigación. La radiación ionizante inhibe el nacimiento de nuevas neuronas. Usando el ordenador guiada por tomografía irradiación focal (CFIR), la orientación anatómica tridimensional de poblaciones específicas progenitoras neurales ahora se puede utilizar para evaluar el papel funcional de la neurogénesis adulta.

Interrogatorio funcional de adultos hipotalámica neurogénesis con focal Radiológica Inhibición

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

El objetivo general de este procedimiento es describir una técnica radiológica avanzada que permite realizar irradiación focal en modelos animales pequeños y posteriormente inhibir la proliferación con resolución específica anatómicamente. Esto se logra primero mediante el uso de imágenes volumétricas tridimensionales guiadas por tomografía computarizada para la localización de la región de interés. El segundo paso del procedimiento consiste en calcular la administración y duración del tratamiento radiológico en la región de interés.El tercer paso consiste en realizar la calibración basada en películas para la dosis de radiación. El paso final es determinar la precisión del haz de radiación mediante la visualización directa del haz de radiación en el tejido. En última instancia, los resultados de estos estudios pueden demostrar el papel funcional potencial de poblaciones seleccionadas de progenitores neurales en proliferación mediante el análisis post-tratamiento de la fisiología y el comportamiento.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes para suprimir la neurogénesis, como la irradiación amplia del cerebro, es que utiliza haces de radiación tan pequeños como 0,5 milímetros de diámetro para dirigirse a poblaciones neurogenerativas específicas. Esto permite asociar de forma inequívoca defectos conductuales o fisiológicos con las funciones específicas de las poblaciones neurogenerativas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos para configurar el haz de radiación son difíciles de aprender al principio debido al gran número de procedimientos implicados en el uso tanto del hardware como del software para la localización del prop y la dosificación. Prepare una cámara de anestesia con gas fluoruro iso, luego introduzca un solo ratón en la cámara.Paralelamente, prepare una almohadilla térmica en la configuración baja para el cuidado del animal después del tratamiento. Cuando el ratón ya no responda a la compresión de la planta del pie, llévelo a la plataforma radiológica y colóquelo sobre la camilla de inmovilización del estadio robótico. Coloque su boca en la boquilla del cono de anestesia y sus dientes en el protector bucal.Coloque al ratón plano sobre la camilla de inmovilización. Si permanece inmóvil, sujete al ratón con cinta de gasa. Asegúrese de que la cabeza esté nivelada respecto a un plano horizontal tirando suavemente de las orejas hacia arriba.Una vez que el ratón esté en la posición correcta, cierre el escudo protector de plomo. A continuación, adquiera una tomografía computarizada utilizando el software integrado de la plataforma radiológica para obtener un escaneo tridimensional de la estructura anatómica del ratón a partir de las imágenes. Verifique que la cabeza esté nivelada con respecto al plano horizontal.Si no es así, continúe ajustando la cabeza del ratón hasta lograrlo. Ahora identifique la región de interés (ROI) en las imágenes de TC para visualizar el hipotálamo basal ventral mediante imágenes de tomografía computarizada. Opere el tubo de rayos X según se indica.Calcule la distancia desde la ROI hasta la superficie del cráneo utilizando un ángulo de 45 grados respecto al plano horizontal. Mediante el software integrado, tome una radiografía del ratón desde arriba. Luego retire al ratón de la plataforma radiológica.Colóquelo sobre la almohadilla calefactora y monitórelo hasta que esté activo. A partir de las imágenes coronales de TC, calcule la profundidad anatómica promedio de la ROI en al menos tres ratones para determinar la dosis de administración. Como ejemplo de un estudio previo en el que se administraron 10 gray de radiación I al hipotálamo ventral basal, la profundidad de la ROI desde el cráneo con un ángulo de 45 grados es de 0,66 centímetros.Una vez conocido el valor, utilice un software de planificación de dosis para calcular la rotación, velocidad y duración del tratamiento adecuados para la dosis deseada en la ROI. A continuación, mida las distribuciones de dosis de los parámetros calculados. Incruste tres películas sensibles a la radiación GAF crómicas en un falso ratón de plástico equivalente al agua.Colóquelos entre cuatro bloques de plástico equivalentes al agua apilados verticalmente. Coloque el modelo de ratón sobre la plataforma robótica y ejecute el haz de irradiación focal con los parámetros recién calculados. En este ejemplo, se prueba una dosis de radiación de 10 grados en el hipotálamo basal ventral. Tras la irradiación, verifique el patrón e intensidad de la dosis en las películas para una rotación de 360 grados, dirigiendo al hipotálamo basal ventral, el haz en forma de cono.Una radiación produce un anillo oscuro en la película por encima del centro ISO, un pequeño punto definido en la película del centro ISO y un anillo más claro en la película por debajo. El centro ISO ahora se superpone al centro ISO de la película GA FCH Chromic sobre los rayos X. El punto focal irradiado en el centro ISO debería solaparse posteriormente con la ROI deseada.La precisión del haz de irradiación puede evaluarse en el tejido visualizando un marcador de roturas de ADN de doble cadena. Una vez satisfecho con la calibración y el enfoque del haz de irradiación, continúe con el experimento. En este ejemplo, ratones hembra C 57 black six J de cinco semanas de edad recibieron una dieta alta en grasas durante una semana antes del tratamiento.El día anterior al tratamiento, se pesaron los ratones y se dividieron en dos cohortes sin diferencias significativas en el peso entre ellas. El día del tratamiento, los ratones se volvieron a pesar y luego se transportaron suavemente hasta la plataforma radiológica y se anestesiaron dos ratones, uno del grupo experimental y otro del grupo control. También se ajustó la almohadilla térmica a la configuración baja para el tratamiento postoperatorio.Coloque el ratón para recibir la irradiación tal como se describió anteriormente. Mientras dura el tratamiento, mantenga el ratón de control en la cámara de anestesia cerca de la plataforma CFIR, para que se tengan en cuenta los posibles efectos de la radiación ambiental. Una vez identificado el objetivo en la TC, mueva al ratón sujeto bajo control robótico para alinear el objetivo con el haz.Luego, introduzca el ajuste de dosis calculado y administre la radiación. Después de la irradiación, coloque ambos ratones sobre la almohadilla calefactora y obsérvelos hasta que despierten. Una vez que todos los ratones hayan sido irradiados, revíselos diariamente y péselos dos veces por semana.Tres días después del tratamiento, para confirmar la irradiación, administre inyecciones intraperitoneales de BRDU un mes después. Identifique la neurogénesis en células con BRDU y un marcador neuronal. Las distribuciones de dosis se midieron con GAF crómico.Películas sensibles a la radiación incrustadas en un ratón simulado. El cono de radiación tenía un ancho total a la mitad del máximo de 2,31 milímetros. El haz focal demuestra la alineación precisa de haces provenientes de diferentes direcciones.Esta película puede superponerse sobre una radiografía del ratón real para demostrar la posición y precisión del haz. Si la delimitación de la región de interés no es suficiente con los puntos de referencia anatómicos, puede utilizarse una inyección de contraste de yodo intratecal para mejorar la precisión del posicionamiento. Los ventrículos laterales y el tercer ventrículo se visualizan claramente en las tomografías computarizadas adquiridas en la plataforma radiológica A-C-F-I-R, lo que permite confirmar aún más la delimitación guiada por tomografía computarizada del me hipotalámico.La ubicación del haz en el tejido se visualizó a partir de las roturas de ADN de doble cadena; la tinción gamma H2A.x demostró un direccionamiento preciso con un borde extremadamente definido del haz. El tratamiento con arco de tipo estereotáctico, que consistía en un arco a 45 grados respecto a la vertical, dirigió eficazmente el haz al hipotálamo basal ventral sin irradiar otras nichos neurogénicos.Se investigó el efecto de la irradiación sobre la neurogénesis en ratones adultos alimentados con dieta alta en grasas. Hubo aproximadamente un 85 % de inhibición de la neurogénesis en comparación con los controles tratados con simulacro. En cambio, en una estructura adyacente que limita con el sitio de irradiación, no hubo diferencias estadísticamente significativas entre los animales irradiados y los controles simulados.Los ratones irradiados que consumieron dietas altas en grasas antes del tratamiento tuvieron una ganancia de peso reducida después del tratamiento en comparación con el grupo tratado con placebo. En contraste, los ratones control alimentados con pienso normal, que presentaron niveles significativamente más bajos de neurogénesis que sus contrapartes alimentados con alta grasa, no mostraron una diferencia significativa en el peso entre los grupos placebo y irradiados. Además, esta menor ganancia de peso en los ratones irradiados alimentados con alta grasa va acompañada de cambios en el metabolismo y la actividad una vez dominado.Esta técnica puede realizarse en aproximadamente 15 minutos por ratón si se lleva a cabo correctamente. Solo no olvide que trabajar con radiación puede ser extremadamente peligroso y que siempre deben tomarse precauciones, como el uso de blindaje de plomo, detectores de radiación y capacitación adecuada en el manejo de radiación, antes y durante la realización de este procedimiento.

functional-interrogation-adult-hypothalamic-neurogenesis-with-focal

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

El video ilustra un método de tinción de inmunofluorescencia utilizado para examinar la neurogénesis en el hipocampo adulto. Inicialmente, una sección del cerebro de un ratón se somete a un tratamiento con anticuerpos primarios dirigidos a las proteínas marcadoras asociadas con la neurogénesis en las células progenitoras neuronales. A continuación, se marca con anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos. A continuación, se observa la sección del cerebro bajo un microscopio confocal para...

Una técnica de tinción de inmunofluorescencia para detectar la neurogénesis del hipocampo adulto

A pesar de la importancia clínica y funcional del...

La manipulación genética del ratón en desarrollo a través de Hipotálamo<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

La actividad de las neuronas individuales de ratones adultos en edad puede ser estudiado por disociar las neuronas de regiones específicas del cerebro y el uso de membrana fluorescente potencial de formación de imágenes de colorante. Por respuestas de prueba a cambios en la glucosa, esta técnica se puede utilizar para estudiar la sensibilidad a la glucosa de las neuronas del hipotálamo ventromedial adultos.

Potencial de Membrana Tinte Imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el Estudio de la glucosa Sensing

Se describen métodos para la manipulación y análisis de NF-kappa B dependiente de neurogénesis en el hipocampo adulto. Un protocolo detallado se presenta para una prueba de comportamiento circunvolución dentada-dependiente (denominado el patrón espacial de separación-Barnes laberinto) para la investigación de resultado cognitivo en ratones. Esta técnica también debería ayudar a permitir investigaciones en otros parámetros experimentales.

Los métodos para la modulación y Análisis de NF-KB dependiente de la neurogénesis adulta

El mecanismo subyacente a los efectos terapéuticos de la cirugía de Estimulación Cerebral Profunda (DBS) necesita investigación. Los métodos presentados en este manuscrito describen un enfoque experimental para examinar los eventos celulares desencadenados por la ECP mediante el análisis del perfil de expresión génica de los genes candidatos que pueden facilitar la neurogénesis después de la cirugía de ECP.

Análisis de los cambios de expresión génica en la Rata Hippocampus Después de la estimulación cerebral profunda del tálamo anterior Núcleo

Este protocolo muestra cómo establecer un método confiable de HFS en ratones. Las neuronas en el hipocampo giro dentado son estimuladas eléctricamente por HFS directamente e indirectamente en vivo. La actividad neuronal y señalización molecular son examinados por c-fos y coloración inmunofluorescente de Notch1, respectivamente; la neurogénesis se cuantifica por bromodeoxiuridina etiquetado ensayo.

Un método invasivo para la activación de la convolución del cerebro dentada de ratón por el estímulo de alta frecuencia

El objetivo de este protocolo es describir un enfoque para analizar el comportamiento de las células madre/progenitoras neurales adultas en respuesta a la manipulación quimiogenética de un circuito neural local específico.

Regulación específica del circuito de ensayo de células precursoras neuronales hipocampales adultas

Aquí se describe un procedimiento estereotáctico que puede apuntar a regiones cerebrales desafiantes y difíciles de alcanzar (debido a limitaciones espaciales) utilizando un enfoque coronal en ángulo. Este protocolo es adaptable tanto a modelos de ratón como de rata y se puede aplicar a diversas aplicaciones neurocientíficas, incluida la implantación de cánulas y microinyecciones de construcciones virales.

Enfoque estereotáctico en ángulo adaptable para técnicas versátiles de neurociencia

Este artículo demuestra la preparación de una ventana de encargo de la proyección de imagen complementada con la cánula de la infusión y su implantación sobre la región CA1 del hipocampo en ratones.

Procedimiento De Craneotomía Para La Visualización De Las Actividades Neuronales En El Hipocampo De Comportarse Ratones

Aquí se presenta un método para secuenciar núcleos individuales aislados del giro dentado de ratón que excluye la mayoría de las neuronas a través de la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FAN). Este enfoque genera perfiles de expresión de alta calidad y facilita el estudio de la mayoría de los otros tipos de células representadas en el nicho, incluidas las poblaciones escasas, como las células madre neurales.

Clasificación negativa de neuronas de núcleos activados por fluorescencia combinada con secuenciación de ARN de núcleos únicos para estudiar el nicho neurogénico del hipocampo

Aquí presentamos un protocolo para cultivar subtipos específicos de células hipotalámicas en cultivo. Las células pueden seleccionarse en función de marcadores de membrana oportunos/únicos y utilizarse en muchas aplicaciones, como inmunofluorescencia, ensayos electrofisiológicos y bioquímicos.

Aislamiento de neuronas hipotalámicas diana para estudios de regulación hormonal, metabólica y eléctrica

Aprende a realizar irradiación focal en modelos animales pequeños mediante tomografía computarizada tridimensional para inhibir neurogénesis hipotalámica. Esta técnica permite estudiar el papel funcional de poblaciones específicas de progenitores neuronales.

Interrogatorio funcional de adultos hipotalámica neurogénesis con focal Radiológica Inhibición

Explorar más videos