La detección, la visualización y cuantificación de la generación de especies reactivas de oxígeno en un sistema modelo de la ameba

El objetivo general del siguiente experimento es proporcionar una solución fácil y versátil para monitorear varias especies reactivas de oxígeno o ROS y su localización, y proporcionar más información sobre los mecanismos celulares relacionados con las ROS. Esto se logra mediante la realización de tres ensayos diferentes, el primero de los cuales utiliza perlas recubiertas de verde RST u OB G y microscopía en vivo, fluoresceína OB g y Alexa. Fluor 594 se acopla covalentemente a la superficie de perlas de sica de tres micras a través de BSA.

La emisión de fluorescencia de la fluoresceína OBG indica la oxidación por ROS, mientras que la señal de Alexa Fluor 594 ayuda a localizar las perlas y sirve como control para la cuantificación de la fluorescencia. El segundo método utiliza la sonda sensible al superóxido, dihidroetidio o DHE, en un ensayo basado en un lector de placas. Como resultado de la oxidación por superóxido, el etidio es capaz de intercalarse en el ADN nuclear y mitocondrial y ha desplazado los picos de excitación y emisión a 522 nanómetros y 605 nanómetros, respectivamente.

La intensidad de fluorescencia de AUM corresponde a la cantidad de producción de superóxido, lo que permite la medición cuantitativa de la generación de superóxido intracelular en las células. El tercer método también es un ensayo basado en un lector de placas. La sonda sensible al peróxido de hidrógeno plex ultra red o UR se utiliza para medir cuantitativamente la producción de peróxido de hidrógeno extracelular.

La intensidad fluorescente de una UR OX corresponde a la cantidad de peróxido de hidrógeno producido fuera de las células. Se obtienen resultados que muestran la localización de la generación dinámica de ROS a partir de los ensayos O-B-G-D-H-E y a UR. La principal ventaja de esta técnica sobre los otros métodos existentes, como los OB GSA basados en la velocidad de placa, es que visualiza dinámicamente la generación de Al Roth a nivel de una sola celda.

En lugar de reflejar y promediar la señal Roth de una población de células. Tales métodos de promedio de población tienden a oscurecer información crítica debido a la fagocitosis no sincrónica. Para comenzar el procedimiento de codificación de perlas con oxy, Burt Green u OBG, agregue un mililitro de una suspensión de perlas de sílice carboxilada de 3.0 micras en un tubo de 1.5 mililitros.

Gire el tubo rápidamente, retire el sobrenadante. Agregue un mililitro de PBS y vórtice de esta manera. Lave las cuentas tres veces con PBS.

Después del tercer lavado, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas. En un mililitro de PBS que contiene 25 miligramos por mililitro de cianuro, la solución de cianuro debe prepararse recién preparada cada vez antes de su uso e incubarse en una rueda durante 15 minutos. Esto activará las perlas de sílice carboxilada para unirse covalentemente a BSA premarcado después de 15 minutos, centrifugar el tubo y eliminar el sobrenadante.

Agregue un mililitro de tampón de acoplamiento y lave el vórtice tres veces con el tampón de acoplamiento mediante un giro rápido y vórtice para eliminar el exceso de cianuro, mezcle las perlas lavadas con 500 microlitros de tampón de acoplamiento que contiene un miligramo de OBGH dos H-F-F-B-S-A y luego llene el tubo con gas nitrógeno de una lata de gasolina estándar. Después de tapar el tubo incubado en una rueda durante 14 horas a temperatura ambiente en la oscuridad al día siguiente, enfríe el OBG no reactivo lavando las perlas dos veces con un mililitro de tampón de enfriamiento mediante un centrifugado rápido y vórtice, luego lave dos veces con tampón de acoplamiento para eliminar el tampón de enfriamiento. Después de eliminar el sobrenadante, agregue un mililitro de tampón de acoplamiento que contenga 50 microgramos de LOR 594 cin un éster medio para conjugar con BSA.

Llene el tubo con un tapón de nitrógeno e incube en una rueda durante 1,5 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Al final de la incubación de 1,5 horas, detenga la reacción lavando las perlas tres veces con un mililitro de tampón de enfriamiento. A continuación, se lavan las cuentas tres veces con un mililitro de PBS.

Por último, Ray, suspende las cuentas en un mililitro de PBS con dos microlitros de 10%peso por volumen. Azida para almacenamiento a largo plazo. Mida la concentración de perlas en la suspensión con un hemocímetro, generalmente es de una a dos veces 10 a la novena perlas por mililitro.

Llene el tubo con una tapa de nitrógeno y guárdelo a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Comience este procedimiento cosechando células de alio que crezcan exponencialmente de una placa de Petri de 10 centímetros. Diferentes densidades de células en placas de tres centímetros con un fondo de plástico o vidrio ópticamente transparente y las hacen crecer durante la noche a la mañana siguiente.

Elija los platos que tengan aproximadamente un 80% de confluente para su uso en el experimento. Sustituir el medio de cultivo por medio de bajo flujo o LF e incubar durante dos horas antes del experimento con el fin de disminuir la autofluorescencia extracelular e intraendosomal del medio de cultivo HL five C. Derrita 10 mililitros de agar 1.5%BDO en medio LF y vierta el agar sobre una superficie plana para formar una capa de agar de aproximadamente un milímetro de espesor.

Espere de 10 a 15 minutos para que el agar se solidifique. Corta la capa de agar en cuadrados de dos por dos centímetros y colócala en medio LF para más tarde. Uso. Repare el microscopio de campo amplio.

Establezca la temperatura de la cámara ambiental a 22 grados centígrados y ajuste la configuración necesaria para el experimento. Después de dos horas de incubación, aspire el medio LF de la placa de tres centímetros, pero deje la monocapa celular cubierta por una película delgada de medio. Diluya las perlas recubiertas de OBG previamente preparadas a 1,5 veces 10 a la séptima perlas por mililitro y agregue 10 microlitros sobre la capa celular.

Tome una hoja de agar cuadrada y escurra el exceso de líquido, pero mantenga el agar húmedo. Coloque suavemente el cuadrado de agar encima de la capa de celdas. La superposición de agar aumenta el contacto entre las perlas y las células, mejorando así la absorción.

También comprime ligeramente las células, manteniéndolas mejor en el plano focal del objetivo. Coloque la tapa en el plato para el éxito del experimento. No mueva la capa AGA cuando esté cubriendo las células y también es fundamental comenzar el paso de imagen de inmediato.

A continuación, coloque la antena en la platina del microscopio y tome automáticamente imágenes en los canales rojo, verde y de fase cada minuto durante dos horas o más. Para medir la producción de ROS, seleccione y concéntrese en los eventos celulares que contienen todo el proceso de fagocitosis. Con un software profesional de procesamiento de imágenes, combine los tres canales optimizados y ensamble las imágenes en una película.

Cuantifique las intensidades de fluorescencia de cada una de las perlas seleccionadas en los canales rojo y verde. La relación entre el rojo y el verde reflejará la producción dinámica de FOMO R os de las células. Para medir primero la producción de superóxido intracelular, recoja una placa confluente de alium al 180% en 10 mililitros de HL cinco C medio, luego centrifugue las celdas de alium a 850 veces G durante cinco minutos y aspire cuidadosa y completamente el medio resus, resuspenda las celdas en celdas de recuento de tampón SS 6.4 y diluya hasta una densidad final de seis veces 10 a las seis celdas por mililitro.

Agregue 50 microlitros de suspensión celular en cada pocillo de una placa blanca no transparente de 96 pocillos, dihidroetidio diluido o culata DHE 500 veces con tampón SS 6.4. Y, a continuación, utilice una pipeta multicanal para dispensar 50 microlitros de DHE diluido en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. La concentración final de DHE es de 30 micromolares.

La reacción comenzará de inmediato. Se pueden agregar estímulos o inhibidores en este punto o en otros momentos según las necesidades específicas. Incubar las células con agitación media a 22 grados centígrados.

Lea la fluorescencia con un lector de microplacas de fluorescencia cada dos minutos durante una hora. Utilice el modo de lectura superior del punto final con excitación de fluorescencia a 522 nanómetros y emisión a 605 nanómetros. Comience este procedimiento preparando una placa de 96 pocillos con células de dium como se demostró en el segmento anterior.

Prepare peroxidasa de rábano picante diluida o HRP agregando cinco microlitros de caldo de HRP en 10 mililitros de tampón SS 6.4. Invierta el tubo para mezclar bien y mantener el hielo. La solución HRP diluida está a 0,05 unidades por mililitro.

Prepare el plex ultra rojo o una mezcla de reacción UR mezclando el stock de UR y la solución HRP diluida en un tampón SS 6.4 hasta concentraciones finales de 6.25. Micromolar una UR y 0,005 unidades por mililitro. HRP agregue 50 microlitros de una mezcla de UR en cada pocillo.

La reacción comenzará de inmediato. Se pueden agregar estímulos o inhibidores en este punto o en otros momentos según las necesidades específicas. Incubar las células con agitación media a 22 grados centígrados.

Lea la fluorescencia con un lector de microplacas de fluorescencia cada dos minutos durante una hora. Utilice el modo de lectura superior del terminal con excitación de fluorescencia a 530 nanómetros y emisión a 590 nanómetros. La eficiencia del recubrimiento de la fluoresceína OB g se prueba mediante el uso de peróxido de hidrógeno y HRP para oxidar las perlas recubiertas in vitro y verificando el espectro de emisión mediante excitación a 500 nanómetros.

Como se muestra en este gráfico, las perlas oxidadas muestran un pico de emisión significativo a 538 nanómetros en comparación con las perlas no oxidadas con una relación de intensidad de al menos 11 a 12 veces. La generación de ROS en fagosomas en células de dium se puede visualizar cualitativa y dinámicamente por microscopía, como se muestra en esta película representativa de lapso de tiempo grabada durante 40 minutos utilizando seis aumentos durante el primer minuto después del aumento. Por fagocitosis, la fluorescencia de las perlas recubiertas con fluorescente OBG cambió de rojo a naranja brillante, lo que indica que las ROS probablemente se produjeron directamente dentro de los fagosomas.

La producción de superóxido intracelular y peróxido de hidrógeno extracelular se mide cuantitativamente mediante los ensayos DHE y UR, respectivamente. Se muestra un resumen de las reacciones bioquímicas relacionadas con estos dos ensayos. El superóxido se convierte en peróxido de hidrógeno por superóxido dismutasa o SOD y el peróxido de hidrógeno se convierte en agua y oxígeno por catalasa en el ensayo DHE.

Un lector de microplacas se utiliza para la medición cuantitativa de superóxido intracelular de rendimiento medio. Un experimento representativo muestra que cuando se estimula con lipopolisacárido LPSA de E. coli, la producción dinámica de superóxido de dos células AX es significativamente mayor que el nivel basal de dos células AX no estimuladas y el fondo de la reacción en tampón, la disminución de la fluorescencia azul y el aumento de la fluorescencia roja están inversamente correlacionados. Como era de esperar.

La localización de la producción de R os medida por el ensayo DHE se confirma con los siguientes resultados. La adición aditiva de un inhibidor de la superóxido dismutasa con peróxido dismutasa en la membrana D-E-D-T-A aumentó la señal DHE de manera dependiente de la dosis, lo que indica que D-E-D-T-C causó la acumulación del sustrato de superóxido dismutasa. Alternativamente, la adición de un extinguidor de peróxido de hidrógeno IMP de membrana no afectó la producción de superóxido en el ensayo A UR.

Se utiliza un lector de microplacas para la medición cuantitativa de la producción de peróxido de hidrógeno extracelular de rendimiento medio. Un experimento representativo muestra que cuando se estimula con LPS, la producción dinámica de peróxido de hidrógeno de AX dos células es significativamente mayor que el nivel basal de dos células AX no estimuladas y la reacción de fondo cuando se trata con varias concentraciones de D-E-D-T-C o catalasa, la señal A UR disminuye de manera dependiente de la dosis debido a la inhibición de la producción de peróxido de hidrógeno a partir del superóxido intracelular y al agotamiento del peróxido de hidrógeno extracelular, respectivamente. Los tratamientos con D-E-D-T-C y catalasa confirmaron explícitamente que los ensayos DHE y a UR miden específicamente diferentes tipos y localizaciones subcelulares de ROS Indicum siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como el reflejo de la generación de Ross durante la infección con bacterias patógenas o no patógenas, para responder a preguntas adicionales, como cómo responderá el semental Dictal a la infección por diferentes bacterias en términos de generación de pérdidas. Y no olvide que trabajar con bacterias patógenas como las microbacterias marum puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el BSL adecuado, dos medidas al realizar este procedimiento.