Name: La detección, la visualización y cuantificación de la generación de especies reactivas de oxígeno en un sistema modelo de la ameba (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 41 s
Description: Aprenda a detectar y cuantificar especies reactivas de oxígeno en amebas mediante microscopía en vivo, sondas fluorescentes y lectura en placa. Estos métodos permiten analizar la localización y dinámica del estrés oxidativo celular.

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Agradecemos a los Dres Karl-Heinz Krause y Vincent Jaquet ayuda y consejo para establecer estos protocolos, y también gracias a Christoph Bauer y Jérôme Bosset de la Plataforma Bioimaging del NCCR y el Dr. Navin Gopaldass por su apoyo técnico. La investigación es apoyada por una beca ProDoc de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza.

1. La visualización y valoración cualitativa de ROS producción en Fagosomas Las perlas recubiertas con OBG deben estar preparados de antemano. Los procedimientos de revestimiento cuentas y técnica de superposición de agar fueron adaptadas de referencias publicadas 5,14. <ol><li> Añadir 1 ml de suspensión de 3,0 micras perlas de sílice carboxilados (alrededor de 1,8 x 10 9 bolas) a un tubo de 1,5 ml, se lavan las perlas 3 veces con 1 ml de PBS por vuelta rápida y vórtex. </li><li> Resuspender las perlas en 1 ml de PBS que contenía 25 mg / ml de cianamida (para activar las perlas de sílice carboxilados unen covalentemente a premarcan BSA), incubar en una rueda durante 15 min. </li><li> Lave 3 veces con 1 ml de tampón de acoplamiento (0,1 M de borato de sodio, pH 8,0) por vuelta rápida (centrifugar a toda velocidad en una mini centrífuga de sobremesa durante 5 segundos o bien se centrifuga a 2000 × g durante 1 min en una centrífuga de mesa) y vortex para eliminar el exceso de cianamida. </li><li> Mezclar las perlas lavadas con 500 l de coupling tampón que contiene 1 mg de OxyBurst Green (OBG) H2HFF (dihidro-2 &#39;, 4,5,6,7,7&#39;-hexafluorofluorescein)-BSA, llenar el tubo con gas nitrógeno a partir de un estándar de gas-can antes de la limitación, y incubar en una rueda de 14 horas (durante la noche) a TA en la oscuridad. </li><li> Lavar las perlas 2X con 1 ml de tampón de enfriamiento (250 mM de glicina en PBS) para eliminar sin reaccionar OBG, y dos veces con tampón de acoplamiento para eliminar el tampón de enfriamiento rápido por vuelta rápida y agitación en vórtex. </li><li> Añadir 1 ml de tampón de acoplamiento que contienen 50 g de Alexa Fluor 594 éster de succinimidilo para conjugar a BSA. Llenar el tubo con nitrógeno antes de la limitación, e incubar en una rueda durante 1,5 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Lave las perlas 3 veces con 1 ml de tampón de extinción por vuelta rápida y un vórtex para detener la reacción, después se lavan las perlas 3 veces con 1 ml de PBS por vuelta rápida y vórtex. </li><li> Finalmente, resuspender las perlas en 1 ml de PBS con 2 l de 10% w / v de azida para el almacenamiento a largo plazo. Mida la concentration de cuentas en la suspensión con un hemocitómetro (generalmente alrededor de 1-2 x 10 9 cuentas / ml), llenar el tubo con nitrógeno antes de la limitación, y se almacena a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> La eficacia del recubrimiento de la fluoresceína OBG se puede probar mediante la comprobación del espectro de emisión usando excitación a 500 nm. Cuando se oxida por H 2 O 2 en la presencia de peroxidasa de rábano picante (HRP), la intensidad de fluorescencia de perlas oxidados, en el pico de emisión (538 nm), es 11-12x mayor que el de perlas recubiertas no oxidado. </li><li> Cosecha en crecimiento exponencial Dictyostelium células de una placa de Petri de 10 cm, la placa de diferentes densidades de células de 3 cm de platos con un plástico ópticamente transparente o con fondo de cristal, y crecer durante la noche. Elija los platos que son aproximadamente el 80% de confluencia para el experimento. Un protocolo detallado para el cultivo de células de Dictyostelium ha sido publicada 15. </li><li> Sustituya el medio de cultivo con medio LoFlo (medio LF), incubar2 horas antes del experimento con el fin de disminuir la autofluorescencia extracelular y intraendosomal del medio de cultivo HL5C. </li><li> En paralelo, derretir 10 ml de 1,5% de agar Bacto en medio LF, verter el agar en una superficie plana (es decir, una placa de vidrio de 10 cm x 10 cm) con el fin de formar una capa de agar sobre 1 mm de espesor, esperar a 10-15 min se solidifique. Cortar la capa de agar en 2 cm x 2 cm cuadrados y colocar en medio de LF para su uso posterior. </li><li> Mientras tanto, preparar el hilado de disco o ancho microscopio de campo, ajuste la temperatura de la cámara climática a 22 ° C y ajuste la configuración para este experimento. (Ver comentarios adicionales en la discusión). </li><li> Después de 2 horas de incubación, aspirar el medio de LF desde el plato de 3 cm, pero la monocapa de células todavía debería estar cubierta por una película fina de medio. Diluir las perlas recubiertas con 1,5 x 10 7 perlas / ml, y añadir 10 l en la capa de células. </li><li> Tome una hoja de agar cuadrado, drenar el exceso de líquido, pero mantener húmeda. Coloque cuidadosamente the cuadrada de agar en la parte superior de la capa de células. No mueva la plaza agar cuando se está tumbado en las células. La capa de agar se utiliza para aumentar el contacto entre los granos y las células, mejorando de este modo la absorción, y también comprime ligeramente las células, manteniéndolos mejor en el plano focal del objetivo. </li><li> Coloque la tapa sobre el plato, colóquelo en la platina del microscopio, y automáticamente tomar fotos en los canales rojo, verde y fase cada 1 min durante 2 horas o más. </li><li> Seleccione y centrarse en los eventos celulares que contienen todo el proceso de fagocitosis. Combinar los 3 canales optimizados y montar las imágenes en una película utilizando el software profesional de procesamiento de imágenes. Cuantificar intensidades de fluorescencia de cada uno de los granos seleccionados en los canales rojo y verde, y la proporción de verde / rojo reflejará la phagosomal dinámica de ROS producción de las células. </li></ol> 2. Cuantitativa y Medianas rendimiento Medición de la Producción intracelular superóxido <ol><li> Recoger oNE 80% plato confluente de Dictyostelium en 10 ml de medio HL5C. Centrifugar las células de Dictyostelium a 850 xg durante 5 min, con cuidado y exceso de medio completamente aspirado. Resuspender las células en tampón de SS6.4 [sorbitol 0,12 M en tampón de Sorensen (14,69 mM KH 2 PO 4 y 6,27 mM de Na 2 HPO 4), pH 6,4], contar las células y diluir hasta una densidad final de 6 x 10 6 células / ml (ver comentarios adicionales en la discusión). </li><li> Añadir 50 l de suspensión celular en cada pocillo de una placa de 96 pocillos no transparente blanco (ver comentarios adicionales en la discusión). </li><li> Diluir DHE de stock (30 mM en DMSO) 500 veces con SS6.4, pipeta de 50 l de DHE diluido en cada pocillo usando una pipeta multicanal si es necesario. La concentración final de DHE es 30 mM. La reacción se inicia inmediatamente. </li><li> Los estímulos o inhibidores se pueden añadir en este punto, o en otros puntos de tiempo de acuerdo a las necesidades específicas. </li><li> Utilice el punto de &quot;la lectura y # top final34; modo de un lector de microplacas de fluorescencia, con excitación de fluorescencia / emisión a 522 nm/605 nm, leer cada 2 min durante 1 h, medio batido de 5 seg / min, a 22 º C. </li></ol> 3. Cuantitativa y de alto rendimiento La medición de extracelular H 2 O 2 de producción <ol><li> Siga los mismos pasos que se describen en el punto 2.1 y 2.2. </li><li> Preparar HRP diluido añadiendo 5 l de HRP de valores (100 U / ml en agua destilada) en 10 ml de SS6.4, vórtice o invertir el tubo para mezclar bien y mantener en hielo para su uso posterior. La solución de HRP diluida es a 0,05 U / ml. </li><li> Preparar la mezcla de reacción AUR mediante la mezcla de la población de AUR (mM AUR 10 en DMSO) y la solución de HRP diluida en tampón de SS6.4 a las concentraciones finales de 6,25 mM, y 0,005 U / ml, respectivamente. Como un ejemplo, para preparar la mezcla de reacción para 40 reacciones, mezclar 1,600 l de SS6.4 con 400 l de HRP diluido y 2,5 l de solución madre de AUR. </li><li> Añadir 50 l de mezcla AURtura en cada pocillo usando una pipeta multicanal si es necesario. Ahora comienza la reacción. </li><li> Los estímulos o inhibidores se pueden añadir en este punto, o en otros puntos de tiempo de acuerdo a las necesidades específicas. </li><li> Utilice el punto de modo extremo &quot;top lectura&quot; de un lector de placas de micro fluorescencia, con la excitación de fluorescencia / emisión a 530 nm/590 nm, leer cada 2 min durante 1 hora, medio batido 5 s / min, a 22 º C. </li></ol>

<ol><li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li>
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<li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li>
<li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li>
<li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-overlay+immunofluorescence%3A+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li>
<li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li>
<li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li>
<li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T. Autophagosomes and Phagosomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDieckmann%2C+R+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Deretic, V. 445, Humana Press. Totowa, NJ. 317-328 (2008).</li>
<li>Amir, Y., Edward, O. -A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proto.+Exch%22%5BJournal%5D)">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li>
<li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En comparación con los métodos descritos anteriormente, el ensayo de OBG visualiza dinámicamente el proceso de phagosomal la generación de ROS en el nivel de células individuales, en lugar de medir una señal promedio de ROS de una población de células. Tales métodos población de promediación tienden a oscurecer la información crítica causada por la fagocitosis no sincrónico. Se adaptó con éxito los ensayos DHE y AUR a Dictyostelium y optimizado los protocolos. Lo más importante es que hemos especificado los tip...

Especies reactivas de oxígeno (ROS) están involucrados en una amplia variedad de procesos biológicos tales como la defensa del huésped, señalización, el desarrollo del tejido y la respuesta a la lesión, así como la hipertensión y el cáncer. La maquinaria de la oxidasa NADPH phagosomal bien estudiado se dedica a la generación de ROS rápida, conocida como la explosión oxidativa, para matar las bacterias ingeridas en los fagosomas neutrófilos &#39;1. Además, la fuga de electrones como un subproducto de la cadena respiratoria mitocondrial se pensaba que ser responsable sólo de una fuente no regulada de ROS. Sin embargo, recientemente, se identificó como un importante mecanismo para contribuir a la muerte intraphagosomal de bacterias en macrófagos de ratón 2. En los últimos años, la ameba sociales, Dictyostelium, se ha convertido en un modelo de gran alcance y popular para estudiar mecanismos celulares intrínsecas de la respuesta inmune innata. De hecho, Dictyostelium y fagocitos humanos comparten un sorprendente alto nivel de conservación en moleculamaquinarias r responsables de las bacterias de detección, inmersión y matando a 3,4. Los homólogos de proteínas y enzimas relacionadas con la producción o la desintoxicación de ROS, tales como NADPH oxidasas, catalasas, superóxido dismutasas, se pueden encontrar en humanos y Dictyostelium. A medida que la ameba mejor estudiado, Dictyostelium presenta varias ventajas únicas sobre modelo de sistema de los mamíferos. Crecen a temperatura ambiente sin la necesidad de CO 2, con un tiempo de duplicación de 8-10 horas. Se pueden mantener fácilmente como cultivos adherentes o de suspensión. Además, gracias a su genoma haploide totalmente secuenciado y anotado, y a la manipulación genética fácil, Dictyostelium se ha convertido en un muy atractivo organismo modelo experimental. En estudios anteriores, diversos derivados clorados y fluorados de fluoresceína (conocidos colectivamente como OxyBurst verde, OBG) que emite fluorescencia después de la oxidación por ROS, se han utilizado como un reportero de ROS. Est Cell-permeantderivados erified se utilizan para medir citoplasmática de ROS, mientras que o dextrano-derivados de células impermeable acoplados a proteínas se utilizan para medir extracelular ROS. En particular, perlas recubiertas con BSA OBG ya han sido utilizados para detectar la producción de ROS en células de mamífero phagosomal 5. Sin embargo, el enfoque basado en el lector de microplacas sólo puede dar una curva de generación de ROS promedio de una población de células. Con el presente protocolo, mediante el uso de Dictyostelium, un fagocito profesional, y condiciones experimentales optimizadas, obtenemos la fagocitosis estable y eficiente, sin conjugar cualquier opsonina sobre las perlas. DHE se ha utilizado en diversos sistemas modelo, como los neutrófilos y los macrófagos de mamíferos, para detectar la producción de ROS 6-9. Mientras tanto, existen algunas controversias acerca de la especificidad y sensibilidad del método de 8,10. Como una versión mejorada de Amplex Red, la intensidad de fluorescencia de AUR es menos sensible al pH, que lo hace más adecuado para medirROS en ambientes no neutrales o ligeramente ácidos. AUR se ha aplicado recientemente en varios sistemas de mamíferos 11,12, pero su uso en modelos no mamíferos, que muy a menudo requieren medios de crecimiento débilmente ácido, no se ha informado todavía. Además, no hay ningún protocolo publicado para medir cuantitativamente y dinámicamente la producción de ROS y la localización en la ameba social de Dictyostelium. El objetivo del conjunto de protocolos presentado es proporcionar una solución sencilla y versátil para controlar diversos ROS y su localización, y además dar una visión de los mecanismos celulares relacionados con el ROS. Para el ensayo de OBG, se utilizó la microscopía en vivo para supervisar todo el proceso de generación de ROS phagosomal después de la absorción de perlas revestidas de OBG por células de Dictyostelium, y nos proporcionó un nuevo enfoque para estudiar el mecanismo de la muerte intraphagosomal de bacterias. Hemos optimizado DHE y AUR ensayos de mediano rendimiento en Dictyostelium, para medir superóxido intracelularIDE y H extracelular 2 O 2 de producción, respectivamente, mediante el uso de LPS como un estimulador potente de ROS. Tenga en cuenta que el LPS se demostró recientemente para aumentar la actividad bactericida de Dictyostelium hacia bacterias fagocitadas 13. Además, el tratamiento con DEDTC y catalasa confirmó explícitamente que estos dos métodos de medir específicamente los diferentes tipos y localizaciones subcelulares de ROS en Dictyostelium. Por último, el ensayo de OBG se puede adaptar a cualquier célula fagocítica adherente, por opsonizantes aún más las perlas con ligandos para receptores de células fagocíticas animales. En principio, los ensayos DHE y AUR también puede ser ajustado para mediciones en cualquier celular adherente o no adherente en condiciones experimentales adecuadas.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>REACTIVOS</fuerte></td></tr><tr><td>OxyBURST Verde H2HFF BSA</td><td>Invitrogen</td><td>O-13291</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de sílice carboxilada</td><td>Kisker Biotech</td><td>PSi-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>HL5C medio</td><td>ParaMedio HLC0102</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LoFlo Medio</td><td>ParaMedio</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>204010</td><td></td></tr><tr><td>Dihidroetidio</td><td>Sigma</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed</td><td>Invitrogen</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidasa de rábano picante</td><td>Roche</td><td>10108090001</td><td></td></tr><tr><td>Dietilditiocarbamato (DEDTC)</td><td>Sigma</td><td>D3506-100G</td><td></td></tr><tr><td>Catalasa</td><td>Sigma</td><td>C9322-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cianamida</td><td>Sigma</td><td>187364-25G</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacáridos</td><td>Sigma</td><td>L2630-25G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>ibidi &mu;-Plato 35 mm, alto</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td>Fondo de plástico ópticamente transparente</td></tr><tr><td>Plato MatTek 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Fondo hecho de un cubreobjetos</td></tr><tr><td>de vidrio Scepter Cell Counter Merck</td><td>Millipore</td><td>PHCC00000</td><td></td></tr><tr><td>Blanco Placa de 96 pocillos</td><td>Nunc</td><td></td> 236108 <td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>SORVALL</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas</td><td>BioTek</td><td>Synergy Mx</td><td></td></tr></tbody></table>

la detección, la visualización y cuantificación de la generación de especies reactivas de oxígeno en un sistema modelo de la ameba

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Especies reactivas de oxígeno (ROS) comprenden una gama de, moléculas que contienen oxígeno reactivas y de corta duración, que se interconvertir o eliminarse ya sea catalíticamente o espontáneamente dinámicamente. Debido a los cortos ciclos de vida de la mayoría de ROS y la diversidad de sus fuentes y localizaciones subcelulares, una imagen completa se puede obtener sólo por medio de mediciones cuidadosas usando una combinación de protocolos. A continuación, presentamos un conjunto de tres protocolos diferentes utilizando OxyBurst Green (OBG) recubierto con perlas, o dihydroethidium (DHE) y Amplex UltraRed (AUR), para controlar cualitativa y cuantitativamente diferentes ROS en fagocitos profesionales como Dictyostelium. Hemos optimizado los procedimientos de revestimiento cuentas y perlas revestidas de OBG usados ​​y microscopía en vivo para visualizar dinámicamente intraphagosomal la generación de ROS en el nivel de células individuales. Se identificaron lipopolisacárido (LPS) de E. coli como un potente estimulador de la generación de ROS en Dictyostelium. Además, Dtiempo real eveloped, ensayos de mediano rendimiento utilizando DHE y AUR para medir cuantitativamente superóxido intracelular y extracelular H 2 O 2 de producción, respectivamente.

La generación de ROS en los fagosomas se puede visualizar cualitativa y dinámicamente por microscopía (S1 del archivo). La fluorescencia roja emitida por Alexa Fluor 594-es insensible al pH y se mantiene constante en el medio ambiente phagosomal, mientras que la oxidación de OBG aumenta su fluorescencia en el canal verde. Los espectros de emisión de in vitro oxida y perlas recubiertas con OBG no oxidado se comparan en la Figura 1B, que muestra un aumento significativo de la int...

Se adaptó un conjunto de protocolos para la medición de especies reactivas de oxígeno (ROS) que se pueden aplicar en varios modelos celulares de ameba y de mamíferos para estudios cualitativos y cuantitativos.

La detección, la visualización y cuantificación de la generación de especies reactivas de oxígeno en un sistema modelo de la ameba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en proporcionar una solución sencilla y versátil para monitorear diversas especies reactivas de oxígeno o ROS, así como su localización, y obtener mayores conocimientos sobre los mecanismos celulares relacionados con las ROS. Esto se logra mediante la realización de tres ensayos diferentes, el primero de los cuales utiliza perlas recubiertas con RST verde u OB G y microscopía en vivo, en el que la fluoresceína OB G y el Alexa Fluor 594 se acoplan covalentemente a la superficie de perlas de sílice de tres micrones mediante BSA.La emisión de fluorescencia del OBG fluoresceína indica la oxidación por ERO, mientras que la señal del Alexa Fluor 594 ayuda a localizar las perlas y sirve como control para la cuantificación de fluorescencia. El segundo método utiliza la sonda sensible al anión superóxido dihidroetidio o DHE en un ensayo basado en un lector de placas. Como resultado de la oxidación por superóxido, la etidio puede intercalarse en el ADN nuclear y mitocondrial y presenta picos de excitación y emisión desplazados a 522 nanómetros y 605 nanómetros, respectivamente.La intensidad de fluorescencia de AUM corresponde a la cantidad de producción de superóxido, lo que permite la medición cuantitativa de la generación de superóxido intracelular en las células. El tercer método es también un ensayo basado en lector de placas. La sonda sensible al peróxido de hidrógeno plex ultra red o a UR se utiliza para medir cuantitativamente la producción extracelular de peróxido de hidrógeno.La intensidad fluorescente de un UR OX corresponde a la cantidad de peróxido de hidrógeno producido fuera de las células. Se obtienen resultados que muestran la localización de la generación dinámica de ERO basada en los ensayos O-B-G-D-H-E y UR. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos existentes, como los ensayos OB GSAs basados en placas, es que visualiza dinámicamente la generación de Al Roth a nivel de célula individual.En lugar de reflejar y promediar la señal Roth de una población de células. Dichos métodos de promediado poblacional tienden a ocultar información crítica debido a la fagocitosis no sincrónica. Para comenzar el procedimiento de codificación de perlas con oxígeno, Burt Green u OBG, agregue un mililitro de una suspensión de perlas de sílice carboxiladas de 3,0 micrones en un tubo de 1,5 mililitros.Centrifugar el tubo rápidamente y eliminar el sobrenadante. Añadir un mililitro de PBS y mezclar mediante vortex de esta manera. Lavar las perlas tres veces con PBS.Después del tercer lavado, elimine el sobrenadante y resuspenda las perlas. Incube durante 15 minutos en un rotador con un mililitro de PBS que contenga 25 miligramos por mililitro de cianuro, debiendo prepararse la solución de cianuro recién cada vez antes de usarla. Esto activará las perlas de sílice carboxiladas para unirse covalentemente a la BSA previamente marcada. Pasados los 15 minutos, centrifugue el tubo y elimine el sobrenadante.Añada un mililitro de tampón de acoplamiento y vortexee, lavando tres veces con tampón de acopl游戏副本Llene el tubo con tapón de nitrógeno e incube en una rueda durante 1,5 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Al final de la incubación de 1,5 horas, detenga la reacción lavando las perlas tres veces con un mililitro de tampón amortiguador. A continuación, lave las perlas tres veces con un mililitro de PBS.Finalmente, Ray, suspenda las perlas en un mililitro de PBS con dos microlitros de azida al 10% peso por volumen para almacenamiento a largo plazo. Mida la concentración de perlas en la suspensión con un citómetro de hemocitómetro, que generalmente es de uno a dos veces 10 a la novena perlas por mililitro.Llene el tubo con tapa de nitrógeno y almacénelo a cuatro grados Celsius en la oscuridad. Comience este procedimiento recolectando células de alium en crecimiento exponencial de una placa de Petri de 10 centímetros. Siembre diferentes densidades de células en placas de tres centímetros con fondo de plástico o vidrio ópticamente transparente y cultívelas durante la noche al día siguiente por la mañana.Seleccione las placas que tengan aproximadamente un 80 % de confluencia para usarlas en el experimento. Reemplace el medio de cultivo por medio de bajo flujo o medio LF e incube durante dos horas antes del experimento con el fin de reducir la autofluorescencia extracelular e intraendosomal del medio de cultivo HL five C. Derrita 10 mililitros de agar al 1,5 % BDO en medio LF y vierta el agar sobre una superficie plana para formar una capa de agar de aproximadamente un milímetro de espesor.Espere de 10 a 15 minutos para que el agar se solidifique. Corte la capa de agar en cuadrados de dos por dos centímetros y colóquelos en medio LF para uso posterior. Repare el microscopio de campo amplio.Establezca la temperatura de la cámara ambiental a 22 grados Celsius y ajuste la configuración necesaria para el experimento. Tras dos horas de incubación, aspire el medio LF de la placa de tres centímetros, pero deje la monocapa celular cubierta con una fina película de medio. Diluya las perlas recubiertas con OBG previamente preparadas a 1,5 veces 10 a la séptima perlas por mililitro y agregue 10 microlitros sobre la capa celular.Tome una lámina cuadrada de agar y elimine cualquier líquido en exceso, pero mantenga el agar húmedo. Coloque suavemente la porción cuadrada de agar encima de la capa celular. La superposición de agar aumenta el contacto entre las perlas y las células, mejorando así la absorción.También comprime ligeramente las células, manteniéndolas mejor en el plano focal del objetivo. Coloque la tapa sobre el recipiente para el éxito del experimento. No mueva la superposición de AGA cuando esté cubriendo las células y también es fundamental comenzar inmediatamente el paso de adquisición de imágenes.A continuación, coloque la placa sobre la platina del microscopio y tome automáticamente imágenes en los canales rojo, verde y de contraste de fase cada minuto durante dos horas o más. Para medir la producción de ERO, seleccione y enfoque eventos celulares que contengan todo el proceso de fagocitosis. Mediante software profesional de procesamiento de imágenes, combine los tres canales optimizados y ensamble las imágenes en una película.Cuantifique las intensidades de fluorescencia de cada una de las perlas seleccionadas en los canales rojo y verde. La relación entre rojo y verde reflejará la producción dinámica de FOMO R de las células. Para medir la producción intracelular de superóxido, primero recolecte una placa al 180 % de confluencia de alium en 10 mililitros de medio HL cinco C; a continuación, centrifugue las células de alium a 850 ×g durante cinco minutos y aspire cuidadosa y completamente el medio, resuspenda las células en tampón SS 6.4, cuente las células y dilúyalas hasta una densidad final de seis × 10⁶ células por mililitro.Añada 50 microlitros de suspensión celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos blanca y opaca. Diluya el stock de dihidroetidio o DHE 500 veces con tampón SS 6.4. Luego, utilice una pipeta multicanal para dispensar 50 microlitros del DHE diluido en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. La concentración final de DHE es de 30 micromolar.La reacción comenzará inmediatamente. Los estímulos o inhibidores pueden añadirse en este momento o en otros momentos según las necesidades específicas. Incube las células con agitación suave en medio a 22 grados Celsius.Lea la fluorescencia cada dos minutos durante una hora con un lector de microplacas con fluorescencia. Utilice el modo de lectura superior en el punto final con excitación de fluorescencia a 522 nanómetros y emisión a 605 nanómetros. Comience este procedimiento preparando una placa de 96 pocillos con células dium como se demostró en el segmento anterior.Prepare la peroxidasa de rábano picante diluida o HRP añadiendo cinco microlitros de la solución stock de HRP a 10 mililitros de tampón SS 6.4. Invierta el tubo para mezclar bien y manténgalo en hielo. La solución diluida de HRP tiene una concentración de 0,05 unidades por mililitro.Prepare la mezcla de reacción plex ultra red o una mezcla UR mezclando la solución stock UR y la solución de HRP diluida en tampón SS 6.4 hasta alcanzar concentraciones finales de 6,25 micromolares de UR y 0,005 unidades por mililitro de HRP. Añada 50 microlitros de la mezcla UR a cada pocillo.La reacción comenzará inmediatamente. Los estímulos o inhibidores pueden agregarse en este momento o en otros puntos de tiempo según las necesidades específicas. Incube las células con agitación suave del medio a 22 grados Celsius.Lea la fluorescencia cada dos minutos durante una hora con un lector de microplacas con fluorescencia. Utilice el modo de lectura superior en el punto final con excitación de fluorescencia a 530 nanómetros y emisión a 590 nanómetros. La eficiencia del recubrimiento de la fluoresceína OB se evalúa utilizando peróxido de hidrógeno y HRP para oxidar las perlas recubiertas in vitro y comprobando el espectro de emisión mediante excitación a 500 nanómetros.Como se muestra en este gráfico, las perlas oxidadas presentan un pico de emisión significativo a 538 nanómetros en comparación con el de las perlas no oxidadas, con una relación de intensidad de al menos 11 a 12 veces. La generación de ERO en fagosomas de células dium puede visualizarse cualitativa y dinámicamente mediante microscopía, como se muestra en esta película representativa de lapso de tiempo registrada durante 40 minutos usando un aumento de seis x durante el primer minuto tras la incorporación. Mediante fagocitosis, la fluorescencia de las perlas recubiertas con fluoresceína OBG cambió de rojo a naranja brillante, lo que indica que es probable que las ERO se produjeran directamente dentro de los fagosomas.La producción de superóxido intracelular y de peróxido de hidrógeno extracelular se mide cuantitativamente mediante los ensayos DHE y UR, respectivamente. Se muestra un resumen de las reacciones bioquímicas relacionadas con estos dos ensayos. El superóxido se convierte en peróxido de hidrógeno mediante la superóxido dismutasa o SOD, y el peróxido de hidrógeno se convierte en agua y oxígeno mediante la catalasa en el ensayo DHE.Un lector de microplacas se utiliza para la medición cuantitativa de flujo medio de superóxido intracelular. Un experimento representativo muestra que, cuando se estimulan con lipopolisacárido de E. coli (LPSA), la producción dinámica de superóxido a partir de células AX dos es significativamente mayor que el nivel basal de células AX dos no estimuladas y que el fondo de la reacción en tampón; la disminución de la fluorescencia azul y el aumento de la fluorescencia roja están inversamente correlacionados. Como era de esperar.La localización de la producción de ROS medida mediante el ensayo con DHE se confirma por los siguientes resultados. La adición adicional del inhibidor permeable a la membrana de superóxido dismutasa D-E-D-T-C-A incrementó la señal de DHE de manera dependiente de la dosis, lo que indica que D-E-D-T-C provocó la acumulación del sustrato de superóxido dismutasa. Alternativamente, la adición de un eliminador de peróxido de hidrógeno permeable a la membrana no afectó la producción de superóxido en el ensayo A UR.Un lector de microplacas se utiliza para la medición cuantitativa de producción de peróxido de hidrógeno extracelular con un rendimiento medio. Un experimento representativo muestra que, al estimularse con LPS, la producción dinámica de peróxido de hidrógeno a partir de células AX dos es significativamente mayor que el nivel basal de células AX dos no estimuladas y que la reacción de fondo. Cuando se tratan con diversas concentraciones de D-E-D-T-C o catalasa, la señal A UR disminuye de forma dependiente de la dosis debido a la inhibición de la producción de peróxido de hidrógeno a partir de superóxido intracelular y al agotamiento del peróxido de hidrógeno extracelular, respectivamente. Los tratamientos con D-E-D-T-C y catalasa confirmaron explícitamente que los ensayos DHE y A UR miden específicamente diferentes tipos y localizaciones subcelulares de ERO Indicum siguiendo este procedimiento.Otros métodos, como reflejar la generación de Ross durante la infección con bacterias patógenas o no patógenas, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como cómo responderá el caballo Dictal a diferentes infecciones bacterianas en términos de generación de pérdida. Y no olvide que trabajar con bacterias patógenas como Microbacteria marum puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como las medidas adecuadas de nivel de seguridad biológica 2 (BSL 2), al realizar este procedimiento.

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