Name: Nanomecánica de Interacciones con Medicamentos objetivo y detección de resistencia a los antibacterianos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-25T09:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Aprende a cuantificar la resistencia antibacteriana mediante nanomecánica con sensores de palanca, midiendo interacciones fármaco-objetivo en bacterias. Este método facilita el descubrimiento de nuevos agentes antibacterianos.

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Joseph W. Ndieyira fue apoyada por el Consejo de Ingeniería y Ciencias Físicas de Investigación (EPRSC), el Centro Interdisciplinario de Investigación en Nanotecnología (IRC), la Royal Society (RS) y consultoría Biano (BNC). Agradecemos, Alejandra Donoso Barrera, Dejian Zhou, Manuel Vögtli, Matthew Batchelor, Matthew A. Cooper, Torsten Strunz, Trevor Rayment y Gabriel Aeppli útil para los debates.

1. Preparación de Cantilevers <ol><li> Usando unas pinzas de teflón sumerja número seleccionado de fichas en voladizo (cantilever medir cada 500 m de largo, 100 m de ancho y 0,9 m de espesor) en una solución de pirañas recién preparada (en proporción 1:1 H 2 SO 4 y H 2 O 2) durante 20 min . </li><li> Después de aproximadamente 20 min eliminar las fichas en voladizo de la solución de pirañas y enjuague bien con agua desionizada y transferir inmediatamente en una solución recién preparada de pirañas. Repetir el paso por encima de 1,1 si los chips contienen manchas de suciedad proceder de otra manera con el paso siguiente. </li><li> Después de una limpieza a fondo en agua desionizada, enjuague con etanol puro y secar las patatas fritas en voladizo sobre una placa caliente a 75 ° C para eliminar cualquier rastro de agua. Inspeccionar ellos utilizando un microscopio óptico para confirmar su limpieza. </li><li> Transfiera los chips voladizo limpiados a una cámara de evaporación y la bomba de baja, apuntando a lograr un vacíopresión de 10 -7 mbar. </li><li> Una vez que se alcanza la presión de vacío requerido, la capa uno de los lados de cada matriz en voladizo con una de titanio 2 nm primero a actúa como una capa de adhesión antes de una capa adicional de oro de 20 nm de espesor. Para confirmar su grosor, el uso del monitor de cristal de cuarzo se coloca directamente sobre la fuente de destino. </li><li> Deja chips sensores cantilever recubiertos de oro en la cámara durante 1-2 horas para enfriar al vacío antes de abrir. </li><li> Transferencia de las patatas fritas recién evaporadas a un recipiente de almacenamiento vacío, lleno de argón para evitar cualquier forma de contaminación. </li></ol> 2. Cantilever chip funcionalización <ol><li> En primer lugar, disponer de micro-tubos capilares en una etapa de funcionalización 2 de acuerdo con el tamaño de paso voladizo de 250 micras. </li><li> A continuación, inyectar 2 mM soluciones tiol etanólicos de moléculas diana de superficie, es decir, mucopeptides bacterianas (D-Ala y D-Lac), y un &quot;inert &#39;alcanotiol termina en trietilenglicol (PEG) se sabe que resistir biomolecular adsorción. 16 Cada uno de los tubos capilares debe contener una variedad de moléculas de captura de superficie determinadas aleatoriamente para evitar el sesgo de usuario. </li><li> A continuación se incuba durante 20 min los voladizos de la microcapilares lleno de soluciones que contienen tiol moléculas de captura de superficie. Asegúrese de que las soluciones de las moléculas de captura de superficie se limitan a cada sensor en voladizo individuo para evitar o reducir al mínimo la contaminación cruzada. Si este proceso se emplea correctamente, se debe alterar sistemáticamente los voladizos recubiertos de oro recién preparados en sensores químicamente activos formados por lo que permite SAMs de objetivos mucopéptido bacterianas para formar en las superficies recubiertas de oro como receptores. </li></ol> 3. Preparaciones en disolución <ol><li> Disolver 0,1 sales de fosfato de sodio mono-y di-básicos M en agua ultrapura (18,2 mW · cm de resistividad) y la mezcla de la camiseta• Producción en un valor de pH de 7,4. </li><li> Añadir 0,002% de PS80 a las soluciones tamponadas para reducir al mínimo los efectos de agregación provocados por interacciones no específicas de las moléculas de fármaco a la cristalería. </li><li> Diluir medicamentos con soluciones recién buffer a las diferentes concentraciones deseadas que permitan el cálculo de K d. </li><li> Filtrar las soluciones de fármacos recién preparados utilizando filtros de 0,2 micras y someter a ultrasonidos durante 5 min a temperatura ambiente antes de purgar con argón. </li><li> Repita el procedimiento con la droga en el suero tamponada con suero completo. Vórtice suavemente durante 15 minutos con 5 minutos adicionales para asegurar la solubilidad completa. </li></ol> 4. Detección de estrés Superficie <ol><li> Cargar un chip sensor cantilever funcionalizado en una cámara de la celda de flujo líquido. </li><li> Alinear el punto de láser en el extremo libre de cada sensor y confirmar la alineación mediante el calentamiento de la cámara de líquido de 1 ° C. Los ocho conjuntos de sensores recubiertos de oro en voladizo deben someterse Compressive flexión hacia abajo debido al efecto bimetálico causada por las diferencias en las tasas de expansión de silicio y el oro. </li><li> Después de calentar durante aproximadamente 10 min, permiten que los voladizos que se enfríe durante 10 minutos más. </li><li> Calcular la variación de flexión en las señales de máximos de flexión en voladizo entre sensores individuales y si la desviación estándar relativa de las señales de flexión es ≤ 5%, entonces acepta la alineación como deseable repetir lo contrario el proceso. </li><li> A continuación, medir las frecuencias de resonancia de los ocho ménsulas para calcular sus constantes elásticas. Si la variación de la constante entre cada sensor en voladizo dentro de un chip de resorte es ≤ 1%, entonces aceptar el chip como teniendo propiedades mecánicas consistentes de lo contrario sustituir el chip sensor en voladizo. </li><li> A continuación, utilizar un sistema fluídico (Modelo Genie Plus) a través de una válvula de seis vías para lograr el intercambio de líquido dentro de la celda de flujo, mientras que la adquisición de datos puede hacerse utilizando un LabView automatizado por loftware. </li><li> Para supervisar el curvado en voladizo de datos, utilice los siguientes protocolos de medición: i) o bien inyectar solución tampón o suero sin fármaco para la medida de control que dura 5-30 min para establecer una línea de base, ii) inyectar solución de fármaco durante 30-60 min; iii) inyectar HCl 10 mM de lavado para 10-60 min para disociar complejo de fármaco unido; iv) finalmente inyectar otra etapa de lavado con solución tampón para otro 5-30 min para regenerar los péptidos de superficie y para restaurar la señal de línea de base. Siempre asegurarse de que todas las señales se adquieren bajo caudal de líquido constante de 30-180 l / min y a temperatura fija de 25 ° C en un armario de temperatura controlada. </li><li> Las señales de flexión absolutos de los ocho ménsulas deben ser controlados utilizando el tiempo serial multiplexados método de haz óptico con un solo detector sensible a la posición. </li><li> Para analizar las señales de flexión de cada concentración de fármaco, las curvaturas diferenciales resultantes se convierten en un stres diferencialess entre los lados superior e inferior del voladizo utilizando la ecuación de Stoney. </li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de interés se declara

El reconocimiento molecular paradigma sustenta grandes franjas de la biología y la medicina. En farmacología, por ejemplo, el objetivo es interferir con una vía patológica por dirigidas a un participante clave de un proceso bioquímico, tales como transglycoslyation o transpeptidación que cataliza la reticulación de los péptidos de la pared celular bacteriana. Por consiguiente, el diseño de fármacos se reduce a la definición de una molécula adecuada para dirigirse a un sitio específico de acoplamiento bacteriana para inducir un ajuste perfecto. Un ejemplo clásico emulando el éxito de este enfoque es la vancomicina (Van), que se dirige a la pared celular de peptidoglicano, una característica estructural conservada de una bacteria. En una naciente bacteria Gram-positiva, la matriz de peptidoglicano consiste en péptidos que terminan en la secuencia Lisina-D-alanina-D-alanina, atado a través de un enlazador 8-10 C55 lípidos aquí denominados D-Ala. Estos péptidos expuestos en los precursores de peptidoglicano son fundamentales para elprotección mecánica de las células bacterianas contra las fuerzas ambientales duras, y esto es importante, no se encuentra en las células humanas, lo que los objetivos ideales para fármacos antibióticos. Van se une específicamente al extremo C-terminal de los péptidos bacterianos de la pared celular que forman un moderadamente fuerte Van-péptido complejo como se muestra en la Figura 1. Esta interacción entre Van y los péptidos bloques expuestas las acciones de transpeptidases y transglycosylases, que catalizan la reticulación de las paredes de las células 1, detener efectivamente de reticulación y por lo tanto debilita nanomechanically la célula bacteriana que conduce a su muerte por ruptura 1,6, 7. La aparición de Enterococcus resistente a la vancomicina (VRE) es un problema cada vez mayor atención sanitaria 11 y debido a la resistencia bacteriana en enterococos surge debido al cambio sutil de una amida linKage a un enlace éster 8, este cambio estructural aparentemente simple en la superficie de la bacteria elimina un solo enlace de hidrógeno a partir de Van &#39;s sitio de acoplamiento con una modificación posterior del bolsillo de unión. Es importante destacar que este proceso altera el pentapéptido terminal de alanina presente en la vancomicina Enterococcus susceptibles (VSE) a una lisina-D-alanina-D-lactato 10,12, aquí denominado D-Lac, produciendo una reducción significativa en la afinidad de unión de Van-D-Lac por tres órdenes de magnitud prestación Van terapéuticamente eficaces contra las infecciones enterocócicas 1, el crecimiento alarmante de las bacterias resistentes a los antibióticos está conduciendo por lo tanto, el desarrollo de enfoques innovadores para acelerar y restaurar la actividad antibacteriana de los agentes antibacterianos o el descubrimiento de fármacos más potentes contra bacterias resistentes a múltiples fármacos infecciones. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Nuestros experimentos con voladizos exentas se inspira en los sistemas tales como las células que aprovechen la energía química en marcha. La capacidad de los sensores de cantilever para traducir la energía química en movimiento mecánico ellos sondas únicas con ventajas considerables para el seguimiento de las perturbaciones mecánicas de los objetivos de la pared celular bacteriana en tiempo real hace. Los sensores de cantilever requieren &#39;etiquetas&#39; no reportero y biomoléculas se detectan rápidamente en una reacción de un solo paso. Ellos pueden detectar múltiples fármacos en paralelo en ambientes fisiológicos tales como soluciones tampón y suero entero. Además, la tecnología de voladizo utiliza en el referenciado in situ para mediciones diferenciales que les permite detectar específicamente las interacciones fármaco-diana y, en virtud de su fabricación a través de las rutas de procesamiento de semiconductores estándar, que son susceptibles para la producción en masa y paralelización de cribado de alto rendimiento de miles de fármacos por hora. En partilares múltiples matrices de sensores en voladizo son herramientas útiles para el estudio de resistencia a los antibióticos a la vancomicina - porque la resistencia a la vancomicina es esencialmente un problema mecánico 1,6,7. Las reacciones entre un blanco modelo de pared de célula bacteriana y Van en solución pueden ser detectados mediante la supervisión de los cambios en la tensión inducida clínicamente relevante de interacciones de unión fármaco-diana. La tensión generada a partir de reacciones en la superficie que se manifiesta en una señal de flexión en voladizo se analiza ópticamente por los sensores de iluminación con un haz de láser. Además mediante la adaptación de la capa receptiva de bacterias moléculas diana de superficie en la parte superior del sensor en voladizo, cerca de un número ilimitado de analitos (Van), las interacciones bioquímicas específicas y la biomecánica del modelo de matriz de la pared celular bacteriana se controla en tiempo real. Aparte del evento de reconocimiento molecular, hay varios factores que pueden causar sensores de cantilever para deflect, que incluyen - las variaciones de temperatura, de unión no específica o cambios de índice de refracción de la solución. Para tener en cuenta para las señales no específicas, en las mediciones diferenciales in situ se realizan donde la curvatura de tanto la medición y voladizos de referencia se controlan continuamente para analizar las interacciones específicas. Por otra parte, la sensibilidad de detección de los sensores de cantilever que dependen de la química de la superficie y la geometría se pueden mejorar mediante el ajuste de la superficie de la densidad p (donde p se define como la proporción de la superficie ocupada por las moléculas de captura para toda el área de la superficie superior del voladizo cubierto por la población total de moléculas tal como se determina por espectroscopia de rayos X de fotoelectrones (XPS) 1. Aquí este protocolo detalles cómo vancomicina o cualquier otro antibiótico vinculante a los teléfonos análogos de precursores de la pared bacteriana (mucopeptides) a concentraciones clínicamente relevantes en una solución tampónND suero de la sangre puede ser detectado mediante el uso de la tecnología de etiqueta libre de voladizo. Superficies de oro frescas se utilizan porque monocapas auto-ensambladas (SAMs) tienden a formar fácilmente capas estables en el oro limpio 13,14. MCS se compone de moléculas cortas con un resto tiol unido covalentemente a la superficie de oro, mientras que se permite que la unidad de captura deseado en el otro extremo para interactuar libremente con los objetivos de analito en la solución. Los tioles forman un sistema flexible, en particular dado que muchos compuestos de tiol con diferentes grupos terminales químicos están disponibles comercialmente o se sintetizan fácilmente en un laboratorio. Sin embargo, se debe tener cuidado para asegurar que las moléculas con un resto tiol deben tener los grupos terminales correctos, por ejemplo, en una proteína o péptido de la conjugación, el grupo amino debe enfrentarse hacia el interior para la reacción con el grupo carboxílico del resto tiol atado en la la superficie que se produzca. Aquí, los tioles son directamente conjugado con miméticos tripéptido de lípidos bacteriana II de la bpared celular acterial objetivos sintetizado por metodología de fase sólida utilizando comercialmente disponible precargado Wang-D-Ala y resinas Wang-D-Lac y el estándar grupo protector de Fmoc química 15. Aunque esta descripción se enfoca a la vancomicina, es evidente que se puede extender a otros antibióticos y de hecho más estudios son invitados por investigadores de diferentes campos en particular en la bioquímica, la farmacología y la ciencia de los materiales para adoptar fácilmente este protocolo para sus propios experimentos.

<table><tbody><tr><td>Scentris</td><td></td><td>Scentris, Veeco Instruments, Inc</td><td>No está en producción</td></tr><tr><td>Válvula</td><td></td> de seis vías <td>MVP, Hamilton, Reno, NV</td><td>Permite la inyección de concentración múltiple</td></tr><tr><td>Evaporador</td><td></td><td>EB BOC Edwards Auto 500, Reino Unido</td><td>El haz de electrones es preferible debido a la deformación de los voladizos causada por problemas de calentamiento térmico</td></tr><tr><td>Recipiente</td><td></td> de almacenamiento <td>Agar Scientific, Reino Unido</td><td>Mantiene frescas las películas recubiertas de oro</td></tr><tr><td>Capilar</td><td></td> de vidrio <td>King Precision Glass, Claremont, CA, EE. UU</td>. <td>Para la funcionalización capilar de las matrices en voladizo</td></tr><tr><td>Modelo de bomba</td><td></td><td>Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, EE. UU</td>. <td>Bueno para el caudal controlado de muestras líquidas en canales microfluídicos</td></tr><tr><td>0.2-4.5 &mu; m Filtros</td><td>1511940001</td><td>Merck Millipore</td><td>Para el filtrado de muestras</td></tr><tr><td>Virutas</td><td></td> en voladizo <td>Centro de Nanotecnología de Londres (LCN)</td><td>Alta sensibilidad</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>10049-21-5</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>Para la fabricación de soluciones tampón</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>7558-79-4</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>Para la fabricación de soluciones tampón</td></tr><tr><td>Polisorbato 80 (PS80) o Tween 80</td><td>9005-65-6</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>Se utiliza en soluciones tampón para evitar interacciones inespecíficas en</td></tr> el <tr><td>agua</td><td></td> DI de cristalería <td>Millipore Co., Billerica, MA, EE. UU</td>. <td>Se utiliza para hacer soluciones</td></tr><tr><td>Suero entero</td><td>GEM-700-110-H</td><td>Sera Laboratories International Ltd, Reino Unido</td><td>Se utiliza en mediciones que imitan las condiciones fisiológicas</td></tr><tr><td>Vancomicina (Van)</td><td>1404-93-9</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>Droga utilizada</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>7664-93-9</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>Se utiliza para procedimientos de limpieza de cristalería</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>7722-84-1</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>Se utiliza para procedimientos de limpieza de cristalería</td></tr><tr><td>D-Ala y D-Lac</td><td></td><td>Centro de Nanotecnología de Londres (LCN)</td><td>Receptores de superficie recubiertos en el voladizo para detectar interacciones</td></tr> <tr>entre fármacos y dianas<td>LabView</td><td></td><td>National Instruments Co., Austin, TX, EE. UU.</td><td>Software utilizado para la interfaz instrumental para permitir mediciones controladas</td></tr></tbody></table>

nanomecánica de interacciones con medicamentos objetivo y detección de resistencia a los antibacterianos

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

El sensor en voladizo, que actúa como un transductor de reacciones entre el modelo de la pared bacteriana matriz de células inmovilizada en su superficie y fármacos antibióticos en solución, ha demostrado un potencial considerable en aplicaciones de detección bioquímicos con sensibilidad y especificidad 1-5 sin precedentes. Las interacciones fármaco-diana generan estrés superficie, haciendo que el voladizo se doble, y la señal se pueden analizar ópticamente cuando es iluminado por un láser. El cambio en la tensión superficial medida con precisión a escala nanométrica permite las interrupciones de la biomecánica del modelo de la pared celular bacteriana objetivos para ser rastreados en tiempo real. A pesar de ofrecer ventajas considerables, varios conjuntos de sensores cantilever nunca se han aplicado en la cuantificación de las interacciones de unión fármaco-diana. Aquí, se presenta en el uso de silicio varias matrices voladizo revestida con alcanotiol monocapas auto-ensambladas que imitan la matriz de la pared celular bacteriana a los estu cuantitativamenteinteracciones de unión antibióticos dy. Para entender el impacto de la vancomicina en la mecánica de las estructuras de la pared celular bacteriana 1,6,7. Hemos desarrollado un nuevo modelo 1 que propone que la flexión en voladizo puede ser descrita por dos factores independientes; i) a saber, un factor químico, que está dada por una isoterma de adsorción de Langmuir clásica, de la que se calcula el equilibrio termodinámico constante de disociación (Kd) y ii) un factor geométrico, esencialmente una medida de cómo los receptores de péptidos bacterianos se distribuyen en la superficie en voladizo. La distribución de la superficie de receptores de péptidos (p) se utiliza para investigar la dependencia de la geometría y la carga de ligando. Se muestra que un valor de umbral de p ~ 10% es crítica para aplicaciones de detección. Por debajo del cual no hay señal detectable de flexión, mientras que por encima de este valor, la señal de flexión aumenta casi linealmente, revelando que el estrés es un producto de una unión química local FACtor y un factor geométrico combinado con la conectividad mecánica de las regiones han reaccionado y proporciona un nuevo paradigma para el diseño de agentes poderosos para combatir infecciones superbacteria.

El cambio de la tensión medida usando precisión nano-escala con una sensibilidad sin precedentes a una sola deleción enlace de H, es explotado para rastrear las interrupciones de modelo bacterianas biomecánica de la pared celular en tiempo real (figuras 2a-d). El límite de sensibilidad de detección de drogas para Van fue investigado por dilución en serie sus concentraciones en pasos de 1,000 mM a ≤ 10 nM, revelando 10 nM (~ 15 ng / ml) como la concentración más baja detectable dando lugar a un promedio de ~ -9 ± 2 nm como las señales diferenciales de flexión (Figura 2c). La capacidad de detectar antibióticos en el medio fisiológico se investigó más en el suero en un intervalo de concentración clínicamente relevante de 3-27 mM 17. Tras la inyección de 7 mM Van en el suero (90% de suero de ternera fetal más 10% de tampón de fosfato de sodio pH 7,4) a través de todos los voladizos en condiciones idénticas, la señal diferencial paraDAla en el suero fue 105 ± 4 nm, mientras que para voladizos recubiertos DLAC, no se observó la flexión (Figura 3). Las considerables señales de flexión observados para DAla recubierto (vancomicina susceptible) voladizos son causados ​​por las fuertes interacciones de unión de fármacos diana. Sin embargo, para DLAC recubierto (resistentes a la vancomicina) voladizos, la presencia de la repulsión del estado fundamental del oxígeno par solitario y la reducción de NH bonos en el bolsillo de unión vancomicina 10,12 contribuye al debilitamiento de las interacciones de unión fármaco-diana que se traduce en menos o ningún curvado en voladizo, particularmente para concentraciones de vancomicina más bajos (Figura 3). Sin embargo, por una alta concentración de vancomicina, observamos señales de flexión medibles para DLAC. Además, nuestro diseño experimental es importante que en el referenciado situ en todo cantilevers recubiertas con tanto DAla y DLAC están expuestos simultáneamente para el mismo analito en tiempo real. Para entender el papel preciso de la química y la geometría, se diseñó un modelo 1 que describe la correlación entre las interacciones de disolvente y la mecánica de superficie. Esto produce la tensión superficial: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/50719/50719eq1.jpg" /> para p&gt; pc y cero en otro caso (1) El primer término de la ecuación (1) es la isoterma de adsorción Langmuir, que representan eventos de unión fármaco-diana y el segundo término es la forma de ley de potencia que describe las consecuencias mecánicas de gran escala de formación de redes estresado. La constante a corresponde a la tensión máxima de la superficie en que todos los sitios de unión accesibles están ocupados y K d es el equilibrio de disociación superficie constante en el voladizo. El análisis como se muestra en la Figura 4 es el resultado del ajuste global de la ecuación (1) superpuesta a señales de estrés diferencial medida que revelan; un ~ 29,7 ± 1,0 o 14,1 ± 3,0 mN / m y K d ~ 1,0 ± 0,3 800 ± o 310 mM de D-Ala o péptidos DLAC, donde A corresponde a una medida de la tensión superficial cuando todos los sitios de unión accesibles están ocupadas. El aumento de la sensibilidad de voladizo estaba sintonizada variando sistemáticamente la densidad de péptido p, mientras que el seguimiento de los datos de estrés como una función de p, mientras que concentraciones de antibióticos fijan en 10, 100, y 250 mM, respectivamente (Figura 5). El proceso se repitió con el estrés como una función de las concentraciones de Van mientras que las densidades de péptidos fijados en p ~ 100%. &lt;img alt = &quot;Figura 1&quot; fo: content-width = src &quot;5in&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. La detección de antibióticos en voladizo interacciones de unión superficiales. a) Representación esquemática de una matriz de sensores en voladizo y el modo por el cual se detectan las interacciones fármaco-diana nanomechanically. b) interacción de unión química entre una molécula de fármaco (Van) y el análogo mucopéptido bacteriana (D-Ala o D-Lac). c) El mecanismo por el cual una mutación bacterias susceptibles a la vancomicina (VSE) adquiere resistencia a la vancomicina mediante la supresión de un enlace de H solo en el bolsillo de unión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig1large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig2.jpg" /&gt; Figura 2. El seguimiento de las interrupciones de los modelo bacterianas biomecánica de la pared celular en tiempo real. a) Las señales de flexión absolutos de D-Ala, D-Lac y voladizos recubiertos de PEG en tampón fosfato y 250 mM vancomicina. Las señales de referencia de PEG diferenciales se muestran en líneas negras. B) señales diferenciales de flexión de D-Ala y voladizos recubiertos D-Lac en tampón de fosfato y 250 mM vancomicina. C) El diferencial de voladizo de deflexión de una señal dependiente de la dosis como una función de tiempo en la presencia de concentraciones de vancomicina en el orden de 10 nm (línea amarilla), 100 nm (línea roja) y 1.000 nM (línea de color rojo oscuro), respectivamente. d) Las señales de desviación voladizo diferenciales para tres D-Ala sensores de cantilever recubiertos como función del tiempo en la presencia de 10vancomicina nM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig2large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig3.jpg" /> Figura 3. El seguimiento de las perturbaciones de los modelos de la biomecánica de la pared celular bacteriana en tiempo real para un D-Ala y voladizos recubiertos D-Lac en presencia de vancomicina 7 micras de suero fetal bovino. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig4.jpg" /> La Figura 4. La investigación de los nanomecánica de las interacciones fármaco-diana. Gráfico que muestra la respuesta al estrés superficie diferencial medida para D-Ala (círculos negros) y D-Lac (círculos rojos) voladizos recubiertos como una función de la vancomicinaconcentración en solución [Van]. Los datos se describen por la ecuación (1) (líneas continuas). 1 <img alt="La figura 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig5.jpg" /> Figura 5. Optimización de la sensibilidad de detección nanomecánica de las interacciones receptor-ligando por la investigación de la dependencia de la carga del receptor y de la geometría a través de monocapas mixtas. Diferenciales respuestas de estrés superficial medida de sensores en voladizo como una función de D-Ala cobertura de la superficie, p en la presencia de concentraciones de vancomicina en fijos solución a 10 M (línea de color negro), 100 m (línea roja) y 250 m (línea verde).

La resistencia adquirida a los antibióticos es un problema importante de salud pública y está clasificado actualmente por la OMS como una de las mayores amenazas para la vida humana. Aquí se describe el uso de la tecnología de voladizo para cuantificar la resistencia antibacteriana, crítica para el descubrimiento de nuevos agentes y potente contra bacterias resistentes a múltiples fármacos.

Nanomecánica de Interacciones con Medicamentos objetivo y detección de resistencia a los antibacterianos

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

El objetivo general de este procedimiento es medir los cambios en las propiedades mecánicas de los modelos de células bacterianas subyacentes provocados por interacciones de unión al blanco del fármaco, y cuantificar la resistencia antibacteriana. Esto se logra primero depositando una película de oro de 20 nanómetros sobre un lado del arreglo de sensores en voladizo previamente limpiado. El segundo paso consiste en autoensamblar los blancos superficiales apropiados, que imitan fenotipos bacterianos sensibles y resistentes a fármacos, sobre seis de los sensores en voladizo, mientras que los dos sensores restantes se ensamblan con blancos bacterianos modelo irrelevantes para actuar como controles de medición.A continuación, las matrices de sensores en voladizo se cargan en una cámara de flujo de líquidos. El paso final consiste en preparar soluciones de fármacos en rangos de concentración clínicamente relevantes e inyectar secuencialmente cada concentración de fármaco sobre las matrices de sensores en voladizo. En última instancia, se utiliza luz láser enfocada en los extremos libres de la matriz de sensores en voladizo para mostrar las deflexiones del voladizo causadas por los cambios en el esfuerzo superficial que surgen de las interacciones de unión entre el fármaco y su diana.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la resonancia de plasmón superficial y el microbalance de cristal de cuarzo, es que detecta directamente la deformación superficial generada por las interacciones de unión entre fármacos y sus dianas, midiendo fuerzas anomecánicas específicas provocadas por la unión de cada fármaco a los blancos superficiales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la farmacología, como la velocidad, eficiencia y precisión de la administración de dosis. En general, las personas nuevas en este tema tendrán dificultades debido al tedioso alineamiento de muestras.Sin embargo, recientemente hemos innovado un nuevo mecanismo de lectura que no requiere alineación inicial de la muestra, y en el futuro, el uso de este método será mucho más sencillo y fácil de usar. Para comenzar, utilice una pinza de teflón para sumergir un chip de microlímpara en una solución de parama recién preparada durante 20 minutos. Las microlímparas utilizadas en este experimento tienen 500 micrones de largo, 100 micrones de ancho y 0,9 micrones de grosor.Después de 20 minutos, retire el cantilever y enjuáguelo cuidadosamente con agua desionizada. Inspeccione el chip limpio mediante un microscopio óptico para detectar impurezas. Coloque los chips con cualquier residuo de polvo o suciedad en solución de piranha fresca durante 20 minutos adicionales.Después de una limpieza exhaustiva con agua desionizada, enjuague el chip con etanol puro y séquelo en una placa calefactora a 75 grados Celsius durante aproximadamente 30 segundos para eliminar cualquier rastro de agua. A continuación, inspecciónelo nuevamente utilizando un microscopio óptico para confirmar su limpieza. Transfiera el chip de la palanca limpia a una cámara de evaporación cargada con fuentes de titanio y oro.Extraiga el aire hasta alcanzar una presión de vacío de un multiplicado por 10 a la menos siete milibares. Una vez alcanzado el vacío requerido, recubra un lado de cada matriz de micropalancas con una capa de titanio de dos nanómetros de espesor. Luego, prepare el sistema para depositar una capa de oro de 20 nanómetros de espesor sobre el titanio, que actúa como capa de adhesión.Confirme el espesor de cada capa con un monitor de cristal de cuarzo colocado directamente encima de la fuente objetivo. Una vez alcanzado el espesor correcto, deje las láminas de cantiléver recubiertas de oro en la cámara durante una a dos horas para enfriar bajo vacío antes de abrir la cámara. A continuación, transfiera el chip sensor de cantiléver a un recipiente de almacenamiento al vacío lleno con Argonne para prevenir cualquier forma de contaminación.Los chips de la palanca pueden almacenarse aquí indefinidamente. Sin embargo, si no hay disponible un recipiente de almacenamiento, el chip debe utilizarse inmediatamente justo antes del experimento. Organice los tubos capilares microscópicos en canales sobre una plataforma de funcionalización según el tamaño de separación de la palanca de 250 micrones.Luego, alíneelos utilizando una lámina de vidrio y sujételos con una abrazadera para evitar que se muevan durante el experimento. A continuación, prepare soluciones de dos milimoles de receptores de superficie folados, elaboradas a partir de blancos en la pared celular bacteriana sensibles y resistentes a fármacos, utilizando etanol puro. Luego, coloque un cantiléver separado en cada uno de los tubos capilares microscópicos.Asegúrese de que las soluciones de las moléculas captoras de superficie se confinen a cada sensor en voladizo individual para evitar contaminación. Luego, asigne aleatoriamente una mezcla de estas moléculas captoras de superficie a los tubos capilares microscópicos e inyecte ocho microlitros de las soluciones diana de superficie en los tubos asignados. Deje que los voladizos incuben en las soluciones durante 20 minutos.Durante este tiempo, los cantiléver recién preparados recubiertos de oro se convertirán en sensores químicamente activos mediante el ensamblaje espontáneo de dianas peptídicas mucosas bacterianas en una monocapa sobre sus superficies recubiertas de oro. Comience disolviendo sales de fosfato sódico mono y dibásico 0,1 molar en agua ultrapura y mezcle para obtener un valor de pH de 7,4, y use filtros de 0,2 micrones para filtrar la solución. Luego agregue 0,002 % de polisorbato 80 a la solución tamponada.Esto minimizará los efectos de agregación causados por interacciones no específicas de las moléculas del fármaco con el material de vidrio. A continuación, diluya la vancomicina y el orin con soluciones recién tamponadas a la concentración deseada de 100 picomolar a 250 micromolar, lo que permitirá el cálculo de KD. Agite en vórtex y sonicar las muestras para asegurar la disolución completa del fármaco en tampón y suero, con el fin de determinar si la acción del fármaco se modifica por las proteínas séricas. Repita este procedimiento con las mismas concentraciones de fármaco, pero esta vez añádalas a suero completo.Asimismo, agite por vórtice las muestras de suero durante un total de 20 minutos durante la mezcla para asegurar la solubilidad completa de los fármacos. Por último, purgue las soluciones con argón para iniciar la detección del estrés superficial en los micropilares. Primero cargue los ocho sensores de micropilar funcionalizados en el chip dentro de una cámara de flujo líquido.A continuación, alinee el punto láser en el extremo libre de cada sensor. Confirme la alineación calentando la cámara líquida en un grado Celsius. Las ocho matrices de sensores en voladizo recubiertos de oro experimentarán una flexión hacia abajo compresiva debido al efecto bimetálico causado por las diferencias en las tasas de expansión del silicio y el oro.Tras calentar durante aproximadamente 10 minutos, calcule la variación de flexión en las señales máximas de flexión entre los sensores individuales de micropalanca. Si la desviación estándar relativa de las señales es menor o igual al 5%, acepte el alineamiento como deseable. De lo contrario, repita el proceso siguiendo el alineamiento.Deje que los micropalancas se enfríen nuevamente hasta la temperatura ambiente durante 10 minutos para garantizar la equilibración. A continuación, mida las frecuencias resonantes de los ocho micropalancas y calcule sus constantes elásticas. Si la variación de la constante elástica entre cada sensor de micropalanca es menor o igual al 1%, acepte la calibración.De lo contrario, reemplace el sistema fluidico conectivo del sensor de cantilever, como la bomba de jeringa mostrada aquí, conectándolo al chip aceptado mediante una válvula de seis vías. Establezca el caudal del sistema para que funcione a una velocidad constante entre 30 y 180 microlitros por minuto y monte todo el sistema dentro de un gabinete con control de temperatura a 25 grados Celsius. A continuación, comience a inyectar tampón o suero por separado, sin fármaco, para obtener una medición de referencia de control que dure entre cinco y 30 minutos.Inicie el software de vista de laboratorio automatizado para adquirir simultáneamente los datos de deflexión de cada uno de los voladizos. Supervise las señales absolutas de flexión de los ocho voladizos mediante un método de multiplexión temporal en serie con un detector óptico sensible a la posición único. Una vez adquirida la línea base, inyecte una solución del fármaco durante 30 a 60 minutos siguiendo la muestra de prueba.Se inyecta una solución de lavado con HCl 10 milimolar durante 10 minutos a una hora con el fin de disociar cualquier complejo de fármaco unido. Mediante este sistema, es posible alcanzar aquí una precisión a escala nanométrica y una sensibilidad sin precedentes ante la eliminación de un solo enlace de hidrógeno. El cambio en el extremo de una cadena peptídica de D alanina a D lactato provoca una reducción significativa en la unión de la vancomicina, lo que hace que las bacterias con la secuencia DLAC sean resistentes a esta terapia. Cuando se probaron distintas concentraciones del fármaco sobre la cadena peptídica que finaliza en D alanina, se observó que la vancomicina ejerce un efecto dependiente de la dosis, siendo aproximadamente 10 nanomolar la concentración más baja detectable.Se investigó además la capacidad de este sistema para detectar antibióticos en un entorno fisiológico, en suero a una concentración clínicamente relevante de siete micromolares. Mientras que las palancas recubiertas con D alanina aún mostraron una flexión considerable bajo estas condiciones, las recubiertas con DLAC no la presentaron. Utilizando puntos de datos de múltiples concentraciones del fármaco, es posible crear modelos que describan los eventos de unión entre el fármaco y su diana.Las líneas de ajuste mostradas aquí combinan la absorción del langur, el isoterma y un término para describir las consecuencias mecánicas a gran escala de la formación de redes bajo tensión. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en minutos para confirmar la eficiencia y precisión en la dosificación de fármacos, así como cualquier signo de resistencia bacteriana si se realiza adecuadamente.

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