Name: Móvil en vivo de imágenes de Alphaherpes Virus Transporte anterógrada y Propagación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: Aprende a visualizar el transporte anterógrado del virus herpes en cultivos neuronales primarios mediante proteínas fluorescentes. Esta técnica permite estudiar la propagación viral en tiempo real con mínimo daño celular.

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LSA y RK son apoyados por los EE.UU. Institutos Nacionales de Salud subvenciones NS033506 R37-16 y R01 NS060699-03. MPT fue apoyada por una beca de investigación postdoctoral Sociedad Americana del Cáncer (PF-10-057-01-MPC). El asesoramiento y el conocimiento del Dr. Matthew Lyman y el Dr. Oren Kobiler fueron fundamentales en el diseño de la configuración del microscopio y los métodos de imágenes de células vivas. También extendemos gracias a Neal Barlow y Brian T. Kain de Nikon instrumentos para su asistencia técnica en la adquisición, instalación y funcionamiento del microscopio.

Sección 1 - Condiciones de Control Ambiental para microscopía de fluorescencia en vivo de células <ol><li> 30 min antes de cualquier experimento de imágenes conectar y empieza a calentarse el microscopio etapa superior incubadora. <ol><li> Encienda el microscopio, las fuentes de luz transmitida y epifluorescencia y controles de hardware automatizado. Abra el software de control de microscopio, los elementos de NIS, para conectar con el microscopio y empiece a enfriarse la cámara EM-CCD. </li><li> Coloque la lente más caliente al objetivo correspondiente (60X o 100X de inmersión en aceite) Nota:. Seleccione lente objetivo según el tipo de experimento. El contraste de interferencia diferencial 100X (CID) es mejor para el seguimiento de conjuntos de virión transporte anterógrado mientras que la fase de objetivo 60X es adecuado para visualizar propagación anterógrada. Bajo aumento, objetivos de inmersión no petroleras no requieren una lente más caliente, ya que no entran en contacto directo con la muestra. </li><li> Conecte la etapa superior incubadora en la platina motorizada de mi<html> copio. Asegurar la inserción adecuada que mantenga la muestra está en su lugar. Conecte la línea de aire húmedo desde el control de la incubadora al puerto de entrada de la etapa superior incubadora. </li><li> Encienda la incubadora y la lente de controles más cálidos y ajustar la configuración de temperatura a las condiciones previamente verificados específicos para el objetivo y la muestra que se está fotografiado (véase el debate). </li><li> Abra la válvula de control del 5% de CO 2/95% del depósito atmosférico para dar CO 2 del aire complementado a la etapa superior incubadora. La velocidad de flujo debe estar entre 60 y 80 ml de gas por minuto. Mayor velocidad se traducirá en una amplia muestra de deshidratación a pesar de la cámara de humidificación. </li></ol></li><li> Añadir el aceite de lente objetivo y colocar inmediatamente la cultura que serán fotografiadas a la etapa superior incubadora. </li><li> Permitir el equilibrio de la temperatura en el cultivo durante un mínimo de 10 min. Se prefiere una hora, especialmente para formación de imágenes durante la noche se describe en la Sección 3. </li></ol>ve_title &quot;&gt; Sección 2 - imagen en tiempo real de anterógrada Virion Protocolo de transporte Eventos <ol><li> Seis a ocho horas antes de la imagen, infectar un plato de 35 mm cubreobjetos-parte inferior de maduros, las neuronas SCG disociadas con 1 x 10 6 unidades formadoras de placa del virus de interés (Véase la Tabla 1 para los virus ejemplo) utilizando el método descrito en Taylor et al. 2012a 11. Si va a probar más de un virus, off-set inoculaciones por 30-60 minutos para permitir la formación de imágenes de muestras secuenciales en similares tiempos después de la infección. </li><li> Inserte plato a la etapa superior incubadora durante un mínimo de 10 minutos antes de ejecutar cualquier experimento. Mientras que la temperatura se equilibre, el plano focal está cambiando y va a afectar negativamente los experimentos de imagen. </li><li> Con luz transmitida y el ocular del microscopio, encontrar un cuerpo celular neuronal que tiene una extensión axonal claramente aislados. También puede utilizar la iluminación fluorescente adecuado para encontrar una célula que expresa deteccióncantidades de mesa de proteínas fluorescentes. Es importante limitar la exposición de la muestra a la iluminación fluorescente, en este paso y pasos subsiguientes, debido a daño celular inducido por la luz y blanqueo de proteínas fluorescentes. </li><li> Atenúa la iluminación de fluorescencia para reducir la intensidad de la luz de excitación a la que están expuestas las células. Involucrar a la luz atenuando densidad neutra (ND) filtros de la trayectoria de la luz de iluminación de fluorescencia. Para las películas que duran más de 1 min, un mínimo de ND4 deben ser usados ​​para prevenir foto-blanqueo de proteínas fluorescentes y extensa foto-daño de los axones. Estructuras altamente fluorescentes normalmente se pueden visualizar con un ND8 filtro en su lugar. </li><li> Utilizando el software de microscopio (Figura 2 y Suplementario Movie 1A), cambiar la trayectoria de la luz a la cámara EM-CCD. </li><li> Determinar tiempos de imagen óptima y las condiciones para cada canal fluorescente. <ol><li> Inicie una ventana de la imagen en vivo mediante el botón &quot;Play&quot;. &lt;/ Li&gt; <li> Determine los ajustes de exposición de cámara óptimos para cada proteína fluorescente. No exceder 300 ms por canal como aberraciones dinámicas sobre los rápidos estructuras virión movimiento ocurrirá. Utilizar la ganancia EM de la cámara a un ajuste de 300 (fabricante sugirió ganancia máxima), para reducir al mínimo el tiempo de exposición y mejorar la detección de señales débiles. Tiempos de exposición correctos deben producir una imagen con una baja intensidad de fondo y de señales de alta específicos. </li></ol></li><li> Después de la determinación de riesgos y la búsqueda de una región bien definida de axón, el software debe ser configurado para realizar la adquisición de imágenes automatizado. Detener la ventana de proyección de imagen en directo de la muestra para evitar el blanqueo. <ol><li> En el software de elementos NIS, seleccione el 6D - Definir / Ejecutar la aplicación Experimento en el menú &quot;Aplicaciones&quot; del menú desplegable. </li><li> En la ventana de adquisición ND, haga clic en la ficha Hora que determinará la frecuencia de adquisición de imágenes. Establezca el intervalo de &quot;Sin demora&quot; y la duración a 5 min. Thsoftware e adquirirá entonces cuadros de imagen a la mayor frecuencia posible duración de 5 min. </li><li> Seleccione la pestaña &quot;Lambda&quot;, que permite la selección de las configuraciones de hardware predeterminados utilizados para la adquisición de imágenes fluorescente múltiple. Haga clic en la primera casilla y en la subsiguiente menú desplegable para seleccionar una configuración de hardware apropiada. Repita el procedimiento para todas las proteínas fluorescentes que se va a examinar. </li><li> Asegúrese de que las pestañas de &quot;posiciones XY&quot;, &quot;Z-series&quot; y &quot;agrandar&quot; son de-seleccionados. </li><li> Encima de las pestañas, seleccione la casilla &quot;Guardar en archivo&quot; para guardar automáticamente las imágenes en el disco duro durante la adquisición. Configurar la ubicación y el nombre de archivo del archivo de salida experimento. A medida que se realizan experimentos secuenciales, el software añadirá un número secuencial al final del nombre de archivo designado. </li><li> Una vez que todas las fichas han sido seleccionados. Iniciar el experimento haciendo clic en el botón &quot;Run-Now&quot;. </li><li> Optimizar la velocidad de adquisición de imágenes a través de los ajustes de exposición y imagtamaño e. Uso de una pequeña región de la zona de imagen-a menudo capaces de acelerar las velocidades de adquisición de marco. Definir la zona de interés con la función ROI en NIS-Elements, seleccionar un área de entre 25% y 50% del área total de la imagen. Por otra parte, los tiempos de exposición más cortos aumentarán las tasas de adquisición de marco, pero disminuye la calidad de la señal (véase el debate). </li></ol></li></ol> Sección 3 - Noche time-lapse de anterógrada Spread Eventos <ol><li> Cuatro horas antes de la imagen, infectar un cultivo neuronal compartimentada construida en un 35 mm μ-plato. Inocular los cuerpos celulares neuronales con 1 x 10 6 unidades formadoras de placa del virus de interés (Véase la Tabla 1 para los virus ejemplo) utilizando el método descrito en Taylor et al. 2012b 12. </li><li> Coloque suavemente placa de cultivo en la etapa superior incubadora. Asegúrese de que la posición del objetivo se establece en el lado del plato. Lentamente el objetivo en el enfoque, garantición del objetivo no empuja hacia arriba dentro de la muestra. Una vez que el campo de enfoque ha sido identificado, mueva lentamente el objetivo en el centro del plato, cerca de la barrera interna demarcación de la parte interna del compartimiento de axón. Durante el movimiento, asegurar que se mantiene la profundidad de foco y evitar empujando hacia arriba en la muestra. La desviación de la superficie de plástico por el objetivo dañará los axones y el plástico. </li><li> Añadir aproximadamente 2 ml de agua tibia (~ 37 ° C) solución salina tamponada con fosfato a la placa de cultivo fuera del anillo de teflón. Esta rodea la cultura neuronal con un anillo de PBS para reducir al mínimo la deshidratación de la muestra y proporcionar aislamiento térmico. </li><li> Deje que la temperatura se equilibre durante un mínimo de 1 hora antes de iniciar la adquisición de imágenes automatizado (3.8). Pasos 3.5 a través de 3.7 se pueden configurar durante este tiempo. </li><li> Restringir la intensidad de la iluminación al nivel más bajo posible mediante la participación de todos los filtros de densidad neutra. Esto permitirá la adquisición de imágenes frecuentes over períodos de tiempo largos sin excesivo foto-daño. La reducción de la iluminación se traducirá en una señal baja, que requieran exposiciones largas (véase el debate). </li><li> Utilice los ajustes históricos de exposición o antes de montaje experimental generar un plato en paralelo de las células epiteliales infectadas que expresan las proteínas fluorescentes de destino para establecer los ajustes de exposición como se describe en la Sección 2.5. </li><li> Después de ajustar la exposición para los canales necesarios, es el momento de configurar el software de adquisición de imágenes automatizado. Detener la ventana de proyección de imagen en directo para limitar muestra de blanqueo. <ol><li> En el software de elementos (Figura 2 y la película suplementario 2), seleccione la 6D - Definir / Ejecutar la aplicación Experimento en el menú &quot;Aplicaciones&quot; down menú para abrir la ventana de adquisición ND. </li><li> En la ventana de adquisición ND, haga clic en la ficha Hora. Establezca el intervalo de &quot;5 minutos&quot;. Ajuste de la duración de 20 horas. El campo de bucles se calcula automáticamente para el número de repeticiones, el program va a realizar. </li><li> Seleccione la pestaña &quot;Lambda&quot;. Haga clic en la primera casilla y en la subsiguiente menú desplegable, seleccione la configuración lambda apropiado para contraste de fase. Repita el procedimiento para las posiciones siguientes, la selección de las configuraciones adecuadas para cada proteína fluorescente a explorar. </li><li> Seleccione la pestaña &quot;Imagen grande&quot;, que determina los parámetros de varias imágenes que se combinan en un solo campo de visión más amplio. Un área de buen tamaño se compone de 5 x 2 imágenes utilizando un 7% de superposición costura. Esto permitirá que el número máximo de células por posición en ser fotografiado sin afectar la frecuencia de adquisición de la imagen. Además, desactive la casilla de verificación de &quot;Shutter Cerrar activo durante el movimiento Stage&quot;. Esta opción mejora la velocidad de adquisición por parte de no cerrar persianas entre imágenes. </li><li> Seleccione la pestaña &quot;XY posiciones&quot;, para identificar múltiples posiciones que serán secuencialmente fotografiadas en paralelo durante el curso de la película durante la noche. Seleccione las posiciones que definen la po centroint para cada gran área de la imagen. Seleccionar 6-8 posiciones de la imagen en la muestra. Un buen área de la imagen tendrá pequeños grupos de células en estrecha aposición a los axones claramente definidos. Las células no deben ser apilados en la parte superior de cada otra y axón agrupación debería reducirse al mínimo. El punto de enfoque es el núcleo de la célula. Coloque el objetivo de tal manera que una envoltura nuclear se ve claramente definido para la mayoría de las células. </li><li> Asegúrese de que la pestaña de &quot;Z-series&quot; no está seleccionada. </li><li> Configurar la función de guardado automático como se describe en la Sección 2.6.5. </li><li> Prueba de la exposición y la posición haciendo clic &quot;1 bucle de tiempo&quot;. Evaluar las imágenes resultantes para la iluminación de luz transmitida, el enfoque y encuadre. Si el foco se ha desplazado, restablezca el enfoque para cada posición en la pestaña XY. Espere 10 minutos y repita este paso hasta que el enfoque es estable. </li><li> Después de todos los ajustes se han verificado y probado, iniciar el experimento automático haciendo clic en el botón &quot;Ejecutar ahora&quot;. </li></ol></li&gt; </ol> Sección 4 - Procesamiento de Imágenes y Exportación Exportación de datos <ol><li> Los conjuntos de datos obtenidos durante la exploración de células vivas de eventos de transporte o propagación deben ser exportados desde el software de elementos NIS en tipos de archivo más utilizados para su posterior uso en presentaciones y publicaciones (Supplemental Movie 3). Para exportar películas abren la prima nd2 archivo adecuado. Elementos de NIS y seleccione la vista &quot;split-componente&quot; para visualizar los canales fluorescentes deseados. Reproducir el archivo a una velocidad adecuada, a 5 fotogramas por segundo es un buen punto de partida para la visualización de transporte rápido. </li><li> Incluir una indicación de la hora de representar a un reloj en tiempo real durante la reproducción de películas. Haga clic derecho sobre la imagen y seleccionar Añadir ND-información. Un contador digital aparecerá en la esquina superior izquierda. <ol><li> Edite el sello de tiempo para mostrar la información. Haga clic derecho sobre la barra y seleccione Editar-ND información. En la siguiente ventana emergente, edite el texto para reflejar la imaginaciónng parámetros que son importantes. Editar fuente, el color y el tamaño para mayor claridad. </li></ol></li><li> Vaya al menú &quot;Editar&quot; y encontrar &quot;Crear vista instantánea&quot; o pulse la tecla &quot;x&quot;. Este comando abre la ventana &quot;visión instantánea&quot;. Seleccione &quot;Aplicar a todos los fotogramas&quot; para generar un 8 bits, RGB, archivo listo para exportar que contiene los canales fluorescentes de toda la película. </li><li> Guardar como un archivo. Avi para la compatibilidad multiplataforma. Ajuste la velocidad de reproducción en 200 milisegundos por cuadro. Los archivos. Avi generados por elementos NIS se pueden comprimir más con otro software de conversión en el tipo de archivo deseado. </li></ol>

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</ol>

No tenemos nada que revelar.

El objetivo de imágenes de células vivas es la observación de los procesos biológicos que ocurren sin una alteración significativa en el acto de la observación. Este objetivo se logra mediante la optimización de tres variables: el control del medio ambiente, la velocidad de formación de imágenes, y la iluminación de fluorescencia. Estas variables interdependientes deben ser equilibradas para lograr condiciones de la imagen viables. Los protocolos presentados utilizan condiciones específicas para producir los resultados ...

La infección del sistema nervioso periférico (SNP) por alphaherpes virus tales como el virus del herpes simple (HSV) -1, -2, y el virus de la pseudorrabia (PRV) implica varios pasos complejos y altamente regulado durante todo el ciclo de vida viral. Transporte dentro de las neuronas del SNP es fundamental durante los acontecimientos de la infección viral primaria y posterior propagación inter-host. Los mecanismos moleculares que modulan dos componentes del ciclo de vida viral, el transporte dirigido de conjuntos virales de distancia desde los cuerpos celulares dentro de los axones (transporte anterógrado) y la transmisión posterior de los viriones a las células susceptibles (propagación anterógrada) son importantes para la comprensión del herpesvirus patogénesis. El transporte y la salida de las partículas virales en las neuronas depende de montaje de un 1,2 virión infeccioso maduro. Ensayos previamente fijados, incluyendo inmunofluorescencia (IF) y microscopía electrónica (EM), se utilizaron para estudiar el estado de montaje de partículas y protinteracciones ein relacionados con el transporte y la propagación del virión 3-6. Sin embargo, la naturaleza dinámica de transporte de viriones y artefactos experimentales introducidas por fijación química confunde la interpretación de imágenes fijas 7,8. Recientemente, un número de proteínas de fusión viral-fluorescentes se han descrito para el VHS y PRV que tienen impactos insignificantes en la función de proteínas. Proteína Fluorescente Verde (GFP) y las proteínas fluorescentes rojas (mCherry o mRFP) fluoróforos a menudo se combina para permitir formación de imágenes de dos de los tres componentes estructurales de un virión maduro: cápside, tegumento, y glicoproteína 9-11. Imágenes de células vivas de transporte anterógrado con doble etiquetado virus visualiza el estado de ensamblaje de las partículas virales durante el transporte. Fluoróforo similares expresando cepas virales se utilizan para visualizar el número y la diversidad de los genomas virales siguientes propagación 12,13. Las propiedades de las proteínas fluorescentes (revisado en 14,15) afectan en gran medidala capacidad de visualizar conjuntos virales o celulares. Las propiedades intrínsecas de la proteína fluorescente, incluyendo la auto-interacciones y estabilidad, deben tenerse en cuenta al diseñar y probar nuevas fusiones de proteínas para la preservación de la funcionalidad de tipo salvaje. En conjunción con fusiones de proteínas fluorescentes, dos bien caracterizados en sistemas de cultivo celular in vitro se emplean para la formación de imágenes en vivo de células de la infección por virus del herpes: disociado 16 y compartimentada 17 (Figura 1A) neuronas de los ganglios cervicales superiores de rata (SCG). En ambos sistemas, embrionario SCG se diseccionan, disociado de los cuerpos celulares individuales, y se sembraron en el cultivo in vitro 18. Las neuronas SCG son parte del sistema nervioso autónomo y pueden ser fácilmente cultivadas y diferenciadas por el factor de crecimiento neuronal (NGF) en una madura estado polarizado ex vivo. Neuronas SCG disociadas forman una extensa red de axones que permite fo la visualización de partículas virales que sean sometidos a transporte anterógrado 6. Culturas SCG en compartimientos proporcionan aislamiento de fluidos del cuerpo de las células neuronales (compartimento S) y terminales de axones distales (compartimiento N) 19. Una serie de protocolos detallados para la construcción y el uso de las neuronas compartimentada con 20 originales o modificadas Campenot cámaras 17 se han publicado con anterioridad. Aislamiento neumático permite la infección selectiva de los cuerpos de las células neuronales y la detección de viriones progenie después del transporte a terminales de axones aislados. Plating células epiteliales a través de los terminales antes de la infección proporciona células receptoras para la propagación de la infección viral. Hay muchos elementos esenciales importantes para toda la experimentación imágenes de células vivas, pero los más relevantes para nuestros protocolos son: la adquisición automatizada de imagen, la iluminación fluorescente, la velocidad de formación de imágenes, y el control del medio ambiente. Para todos los experimentos de imagen, utilizamosun,, microscopio de epifluorescencia iluminación automatizado invertida (Figura 1B). El microscopio se basa en la base de Nikon Eclipse Ti y emplea una serie de sistemas motorizados controlados por el ordenador para reconfigurar rápidamente el microscopio durante la adquisición de imágenes automatizado. Para la iluminación de fluorescencia, se utiliza un amplio espectro lámpara de arco de mercurio que puede ser atenuado con filtros de densidad neutra a lo largo de la trayectoria de iluminación. Filtros de excitación limitan el espectro de la iluminación fluorescente y cuando se combina con espejos dicroicos múltiples pasadas y filtros de emisión de fluorescencia visualizar compuestos fluorescentes específicas. Los filtros de excitación y emisión se montan en ruedas independientes, cambio rápido de filtro para permitir una rápida adquisición secuencial de diferentes canales fluorescentes. La velocidad de adquisición de la imagen se ve reforzada con una cámara EM-CCD sensible y rápido, útil para la detección de señales de baja intensidad y corta imagen tiempos de lectura. Control ambiental de la microscOpe se consigue con una tapa etapa se calienta incubadora y un calentador de lente de objetivo de mantener las muestras a temperaturas elevadas mientras se pasa un ambiente humidificado y CO 2 enriquecido en la incubadora. El microscopio se mantiene en una habitación oscura con una temperatura ambiente mantenida cerca de 25 ° C y la luz fuera minimizada con cortinas en todas las ventanas. Los protocolos siguientes describen el uso de este sistema para el transporte anterógrado y ensayos de propagación. Una serie de alternativas existen para el control de las variables de imágenes de células vivas. El control de la configuración de microscopía se puede realizar manualmente o por medio de sistemas automatizados que dependen de software propietario. Iluminación de fluorescencia se puede lograr con fuentes de láser de halógeno, o LED. La velocidad de formación de imágenes es modificado por la velocidad de conmutación de filtro y el tiempo para visualizar la señal con el sistema de detección emparejado. El control ambiental se puede lograr con hardware especializado en la millasetapa copio, recinto de la totalidad o parte del microscopio en una caja calentado y humidificado, o mediante la elevación de la temperatura de la habitación donde se llevará a cabo la microscopía. Cada una de estas alternativas tiene ventajas y desventajas relacionadas con el coste y el rendimiento. En el protocolo posterior, que detalle el uso de imágenes de células vivas para estudiar el transporte rápido anterógrada y la propagación de los virus alphaherpes anterógrada a través de la utilización de cepas virales recombinantes. Imágenes de células vivas en tiempo real visualiza la cápside, tegumento, y / o glicoproteína co-localización de estructuras dinámicas que experimentan transporte dentro de los axones 11. Imágenes timelapse noche de cultivos neuronales compartimentadas visualiza axonal salida del virión y la infección de células susceptibles 12. Los protocolos que aquí se presentan se han optimizado para su uso con el sistema de imagen en particular, sino que se presenta en términos generales en relación con los cuatro elementos de imágenes de células vivas. En la discusión quevoluntad más detalle algunos de la optimización que es necesario para la experimentación con éxito.

<table><tbody><tr><td>plato de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm</td><td>MatTek Corporation; Ashland, MA</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>35 mm &mu;-Dish </td><td>Ibidi USA LLC, Verona, WI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Cuerpo del microscopio </td><td>Nikon Instruments Inc.</td>Microscopio motorizado <td>Nikon Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>etapa X-Y</td><td>Prior Scientific; Rockland, MA</td><td>H117 ProScan Flat Top</td><td></td></tr><tr><td>Ruedas de filtro motorizadas</td><td>Prior Scientific</td><td>HF110 Rueda</td><td></td>de filtro de 10 posiciones</tr><tr><td>Fuente de iluminación fluorescente </td><td>Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario, Canadá,</td><td>X-Cite 120Q</td><td></td></tr><tr><td>, juegos de filtros de fluorescencia multibanda</td>, <td>Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT</td><td>89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD camera</td><td>Andor Technology USA; South Windsor, CT</td><td>iXon3 897</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora ambiental superior de etapa Chamlide</td><td>Live Cell Instruments; Seúl, Corea del Sur</td><td>TC-L-10</td><td></td></tr><tr><td>Calentador de lente objetivo</td><td>Bioptecs; Butler, PA</td><td>150803 Controlador 150819-12-08 Software de análisis de calentadores</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon Instruments Inc.; Melville, NY</td><td>Elementos</td><td></td> NIS</tr></tbody></table>

móvil en vivo de imágenes de alphaherpes virus transporte anterógrada y propagación

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Los avances en las técnicas de microscopía de fluorescencia de células vivas, así como la construcción de cepas virales recombinantes que expresan proteínas de fusión fluorescentes han permitido a la visualización en tiempo real del transporte y la propagación de la infección por el virus alphaherpes de las neuronas. La utilidad de las nuevas proteínas de fusión fluorescentes a la membrana viral, tegumento, y cápsidas, en conjunción con imágenes de células vivas, identificado conjuntos de partículas virales transportados dentro de los axones. Herramientas similares se han empleado con éxito para el análisis de la célula-célula repartidas de partículas virales para cuantificar el número y la diversidad de los viriones de transmisión entre las células. Es importante destacar que las técnicas de imágenes de células vivas del transporte y la propagación anterógrada producen una gran cantidad de información, incluyendo velocidades de las partículas de transporte, la distribución de las partículas, y los análisis temporales de la localización de la proteína. Junto a las técnicas genéticas virales clásicos, estas metodologías han proporcionado una visión críticaen importantes cuestiones mecánicas. En este artículo se describe en detalle los métodos de imagen que se desarrollaron para responder a las preguntas básicas de transporte de virus alphaherpes y propagación.

Transporte anterógrado La aplicación de este protocolo para las infecciones de las culturas SCG disociadas con PRV 348, una cepa recombinante PRV expresando GFP-US9 y proteínas de fusión de membrana gM-mCherry, ha facilitado la visualización del transporte anterógrado de viriones (Figura 3 y complementario Movie 4). La incorporación de estas proteínas de fusión en partículas víricas en los resultados de su detección en el transporte de puntos lagrimales, y las ...

Imágenes de células vivas de las infecciones por virus alphaherpes permite el análisis de los eventos dinámicos de transporte dirigido y propagación intercelular. A continuación, presentamos metodologías que utilizan cepas virales recombinantes que expresan proteínas de fusión fluorescentes para facilitar la visualización de los conjuntos virales durante la infección de las neuronas primarias.

Móvil en vivo de imágenes de Alphaherpes Virus Transporte anterógrada y Propagación

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar los eventos de transporte y diseminación del virus del herpes mediante fusiones de proteínas fluorescentes en cultivos primarios de neuronas. Esto se logra primero estableciendo la incubación de las muestras a temperaturas fisiológicamente relevantes en un microscopio capaz de conmutar rápidamente la iluminación fluorescente. En el segundo paso, se configuran los parámetros de la imagen de fluorescencia para limitar cualquier daño celular por fototoxicidad mientras se adquieren datos adecuados.A continuación, se realiza la adquisición secuencial de los canales fluorescentes o la adquisición en múltiples posiciones. En el paso final, se adquieren marcos compuestos por múltiples imágenes dispuestas en mosaico. Los datos se analizan y reformatan para su presentación y publicación.En última instancia, este método de microscopía de células vivas se utiliza para rastrear el movimiento de partículas virales fluorescentes dentro de neuronas y para seguir la infección a medida que se extiende entre células. Este método puede proporcionar información sobre el transporte y la diseminación del virus del herpes en neuronas. Asimismo, puede aplicarse a otros eventos dinámicos en biología celular y microbiología, como la captación endocítica de partículas o la migración celular.Antes de cualquier experimento de imagen, conecte y comience a calentar el incubador del platino del microscopio. Después de 30 minutos, encienda el microscopio, las fuentes de luz transmitida y epifluorescente, y los controles automáticos de hardware. Luego abra NIS Elements, el software de control del microscopio, para conectarse al microscopio.Aquí se muestra una captura de pantalla de una interfaz de usuario estándar en NIS Elements. Los botones de reproducción y detención controlan la ventana de imagen en vivo que representa las configuraciones actuales del hardware para la adquisición de imágenes, así como lo que se está observando en ese momento. En el panel superior hay una serie de configuraciones ópticas que implementan ajustes preestablecidos del hardware para configurar el microscopio para detección con iluminación transmitida o fluorescencia.Los controles de la cámara y los ajustes de exposición permiten configurar la detección de la cámara para optimizar la calidad de la imagen y la velocidad. Todos los experimentos se coordinan utilizando los controles de adquisición ND. A continuación, coloque un calentador de lente en el objetivo de inmersión en aceite adecuado y luego fije el incubador de platina a la platina motorizada del microscopio.Asegúrese de que el inserto adecuado que sostendrá la muestra esté en su lugar, y luego conecte la tubería de aire humidificado del control de la incubadora al puerto de entrada de la incubadora de platina. Encienda los controles de la incubadora y del calentador de lentes, y luego ajuste la temperatura a las condiciones previamente verificadas específicas para el objetivo y la muestra que se está observando. Por último, abra la válvula de control del tanque de 5% de dióxido de carbono y 95% de aire atmosférico para suministrar aire enriquecido con dióxido de carbono a la incubadora de platina.Para obtener imágenes de los eventos de transporte de viriones de grado entero en tiempo real, primero inserte un plato de cultivo celular que contenga neuronas infectadas en el incubador acoplado al microscopio durante un mínimo de 10 minutos antes de realizar el experimento. Luego, utilizando luz transmitida y el ocular del microscopio, localice un cuerpo celular neuronal que presente una extensión axonal claramente aislada.Encontrar áreas imágenes en el cultivo neural es la parte más difícil de este procedimiento. El éxito se asegura cultivando múltiples muestras por si hay un crecimiento celular deficiente o infección, o por si se produce una interrupción física del cultivo durante la obtención de imágenes. Ahora use el software del microscopio para cambiar la trayectoria de la luz a la cámara EM CCD y luego haga clic en el botón de reproducción para iniciar una ventana de imagen en vivo.Después de determinar los ajustes óptimos de exposición de la cámara para cada conjunto de proteínas fluorescentes, establezca la ganancia de multiplicación electrónica de la cámara en 300. Para minimizar el tiempo de exposición y mejorar la detección de señales débiles. Detenga la ventana de imagen en vivo para evitar el desteñido de la muestra.A continuación, tras ajustar los tiempos de exposición y localizar una región bien definida del axón en los elementos NIS, configure el software para la adquisición secuencial de imágenes. Abra el menú desplegable de aplicaciones y seleccione la aplicación seis D definir experimento. En la ventana de adquisición ND, haga clic en la pestaña de tiempo para determinar la frecuencia de adquisición de imágenes.Establezca el intervalo sin demora y la duración en cinco minutos. Ahora haga clic en la pestaña Lambda para seleccionar las configuraciones predeterminadas del hardware utilizadas para la adquisición múltiple de imágenes fluorescentes. Haga clic en el primer cuadro y luego, en los menús desplegables subsiguientes, seleccione una configuración de hardware adecuada.Seleccione la casilla de guardar en archivo y configure la ubicación y el nombre del archivo de salida del experimento. Una vez que todos estos parámetros se hayan establecido, haga clic en el botón ejecutar ahora para iniciar el experimento. La tasa de adquisición de imágenes se optimiza mediante la configuración de exposición y el tamaño de la imagen adquirida.Utilice la herramienta de región de interés en NIS Elements para definir la región de interés. Seleccione un área entre el 25 y el 50 % del área total de la imagen para realizar imágenes de lapso de tiempo nocturnas de eventos de dispersión de enterobacterias. Primero, coloque suavemente la placa de cultivo en el incubador colocado sobre la platina.Después de asegurarse de que la posición del objetivo esté colocada en el lateral del platillo, acerque lentamente el objetivo al enfoque, teniendo cuidado de que no empuje hacia arriba la muestra. Una vez identificado el campo de enfoque, mueva lentamente el objetivo hacia el centro del platillo, cerca de la barrera interna, delimitando el lado interno del compartimento axonal, cuidando mantener el enfoque en profundidad y evitar empujar hacia arriba la muestra. A continuación, rodee las neuronas en el platillo de cultivo con aproximadamente dos mililitros de PBS a 37 grados Celsius fuera del anillo de teflón para minimizar cualquier deshidratación de la muestra y proporcionar aislamiento térmico.Luego, active todos los filtros de densidad neutra para restringir la intensidad de la iluminación al nivel más bajo posible, lo que permite la adquisición frecuente de imágenes durante largos períodos de tiempo sin daño fotográfico excesivo. En la ventana de adquisición ND, haga clic en la pestaña de imagen grande y luego seleccione un área compuesta por cinco por dos imágenes. Utilice un solapamiento de empalme del 7 % para imaginar secuencialmente múltiples posiciones en paralelo.Durante la película nocturna, seleccione la pestaña de posiciones XY. Luego, defina las posiciones que determinarán el punto central de cada área de imagen grande. El punto de enfoque debe ser el núcleo de la célula; coloque el objetivo de manera que se observe una envoltura nuclear claramente definida en la mayoría de las células.Luego, haga clic una vez en el bucle para probar la exposición y los ajustes de posición, y evalúe las imágenes resultantes en cuanto a luz transmitida, iluminación, enfoque y encuadre. Después de haber verificado y probado todos los ajustes, inicie el experimento automatizado haciendo clic en el botón ejecutar ahora para exportar las películas obtenidas durante la imagen de células vivas. Primero, abra el archivo ND2 crudo apropiado en NIS Elements y seleccione la vista de componentes separados.Para visualizar los canales fluorescentes deseados, reproduzca el archivo a una velocidad adecuada. Cinco cuadros por segundo es un buen punto de partida para visualizar el transporte rápido e incluir una marca de tiempo que represente un reloj en tiempo real durante la reproducción del video. Haga clic con el botón derecho en la imagen y seleccione AGREGAR información ND.En la esquina superior izquierda aparecerá un contador digital para editar la marca de tiempo; haga clic derecho en el contador y seleccione editar la información ND. En la ventana emergente subsiguiente, modifique el texto para reflejar los parámetros de imagen relevantes. Edite el color y tamaño de fuente del texto para mayor claridad.Luego, vaya al menú editar y seleccione Crear instantánea de vista para abrir la ventana de instantánea de vista y generar un archivo listo para exportación RGB de ocho bits que contenga los canales fluorescentes de toda la película; seleccione aplicar a todos los fotogramas. Finalmente, guarde el archivo en formato A VI para compatibilidad entre plataformas y configure la velocidad de reproducción en 200 milisegundos por fotograma. En esta imagen de contraste de fase, se muestra un cultivo representativo, maduro y disociado de ganglios cervicales superiores o SCG, utilizado para la obtención de imágenes del transporte de viriones intergradas. Las neuronas infectadas con el virus de la rabia pseudorrábica o PRV 3 48 expresan las proteínas de fusión de membrana GFPS nueve y GMM cherry.En esta figura se muestra una imagen representativa de células vivas de axones del ganglio cervical superior infectados con P RV 3 48 ocho horas después de la infección, en la que se visualizan estructuras en transporte anterógrado dentro de los axones distales mediante dos canales fluorescentes, GFP y mCherry. Una estructura en transporte anterógrado, indicada por las flechas blancas, avanza dentro del axón. Las dos proteínas fluorescentes aparecen desplazadas espacialmente debido a la adquisición secuencial de los canales fluorescentes y al rápido movimiento de las estructuras virales.La aplicación de este protocolo a infecciones de cultivos disociados de GCS con PRV 3 48 ha facilitado la visualización del transporte anterógrado de Vons. La incorporación de estas proteínas de fusión en partículas virales permite su detección en puntos de transporte, observados como puntos fluorescentes en movimiento. Las condiciones de imagen antes mencionadas minimizan el desplazamiento de cada fluoróforo en una partícula móvil durante el cambio de filtros.El uso de ruedas de filtros de conmutación rápida y espejos dicróicos multipaso emparejados permite la adquisición secuencial rápida de dos o más canales fluorescentes a velocidades de hasta 0,8 cuadros por segundo en una ventana de imagen de tres minutos. Se observan comúnmente numerosas Punta en movimiento y se generan rápidamente tamaños grandes de muestras para análisis de colocalización. A continuación se muestra un esquema del sistema de cultivo compartimentalizado representado en esta imagen, con neuronas del GCS sembradas en el compartimento izquierdo y proyecciones axonales extendiéndose por debajo de las barreras internas hacia el compartimento extremo derecho.Las siguientes imágenes fueron seleccionadas a partir de una película de lapso de tiempo con mosaico de imágenes amplio, que muestra la transmisión de viriones desde axones infectados con PRV 4 27 hacia células epiteliales receptoras. En este primer panel se muestra la imagen de las fluorescencias YFP y RFP transmitidas en un momento posterior a la infección. En ese momento, las células receptoras comienzan a expresar proteínas de fusión fluorescentes YFP ancladas a la membrana y VP26-MRFP.El cuadro blanco resalta un área de las células epiteliales del receptor que contiene ensamblajes de cápside infectantes. Aquí se muestra la misma área que en la imagen anterior, vista únicamente a través del canal RFP. La línea blanca continua indica la representación esquemática del contorno celular.Las líneas blancas discontinuas indican los núcleos celulares y las líneas azules delimitan los axones. En este segundo panel, se muestran conjuntamente solo los canales YFP y RFP. Observe el gran número de puntos de MRFP asociados con los tractos axónicos.Estas células fueron infectadas recientemente y no expresan ninguna de las proteínas de fusión. Las células infectadas pueden rastrearse hacia atrás para visualizar los capsidos fluorescentes que iniciaron la infección viral. Estas células individuales pueden aislarse del campo amplio y rastrearse sin una pérdida significativa de detalle.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la microscopía de células vivas afecta el proceso biológico que se observa. Sin embargo, una cuidadosa optimización de estos protocolos permite la visualización sin alteración.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Imágenes de células vivas es de particular utilidad en el estudio de la dinámica del tráfico de orgánulos. A continuación se describe un protocolo para obtener imágenes en vivo de alta densidad de núcleo vesículas en las neuronas cultivadas con amplio campo de la microscopía de fluorescencia. Este protocolo es flexible y puede adaptarse a los orgánulos de imagen como las mitocondrias, endosomas, y peroxisomas.

Imágenes en vivo del denso núcleo de vesículas en la Primaria neuronas del hipocampo cultivadas

Este experimento visualizado es una guía para la utilización de un clon de fluorescencia molecular del VIH para vivir experimentos de imagen confocal.

Visualización de la célula a célula de Transmisión del VIH utilizando clones fluorescente del VIH y la microscopía confocal en vivo

Procesos celulares, tales como la migración celular tradicionalmente han sido estudiados en dos dimensiones, las superficies de plástico rígido. Este informe describe una técnica para visualizar de manera directa la localización de proteínas y el análisis de la dinámica de proteínas en las células que migran de una manera más fisiológicamente relevantes, matriz tridimensional.

Células vivas imágenes de la migración de las células que expresan proteínas de fluorescencia etiquetado en una matriz tridimensional

Se describe un protocolo en tiempo real videoimaging de la migración neuronal en el cerebro anterior del ratón. La migración de viralmente marcados o injertado precursores neuronales se registró en rebanadas agudas en vivo utilizando de gran campo de imagen fluorescente con un intervalo de adquisición relativamente rápido para estudiar las diferentes fases de la migración de células, incluyendo las duraciones de las fases estacionaria y la migración y la velocidad de migración.

Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto

Este video muestra un método para monitorear la proteína celular infectada 0, el tráfico de ICP0 en la infección por el virus del herpes simple-1. Después de la síntesis de novo, ICP0 se transloca al núcleo, luego se mueve al citoplasma durante la progresión de la infección. La microscopía de inmunofluorescencia revela y analiza la localización subcelular de la proteína, ofreciendo información sobre su tráfico a través de las fases de la infección.

Una técnica de inmunofluorescencia para la localización de proteínas virales en células infectadas

La migración de los neuroblastos es un acontecimiento fundamental en la neurogénesis postnatal. Se describe un protocolo para el etiquetado de la eficiencia de los neuroblastos por electroporación in vivo postnatal y la posterior visualización de su migración utilizando time-lapse de rodajas de cerebro agudas. Incluimos una descripción para el análisis cuantitativo de la dinámica de neuroblastos de seguimiento de vídeo.

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

Describimos un protocolo para monitorizar la movilidad radial de las células inmunitarias no adherentes in vitro utilizando un aparato de sedimentación celular. La migración celular se rastrea en monocapas de células tumorales o en proteínas de la matriz extracelular. El examen por microscopía óptica y fluorescencia permite observar la movilidad celular y la funcionalidad citotóxica.

Radial Movilidad y citotóxicos Función de Retroviral Replicar Vector transducidas, no adherente Alloresponsive linfocitos T

ICP0 sufre translocación nuclear-a-citoplásmico durante la infección de HSV-1. No se conoce el mecanismo molecular de este evento. Aquí describimos el uso de microscopio confocal como una herramienta para cuantificar el movimiento ICP0 infección por HSV-1, que establece las bases para el análisis cuantitativo de desplazamiento ICP0 en futuros estudios mecanicistas.

Análisis temporal de la translocación Nuclear-a-citoplásmico de una proteína del Virus 1 del Herpes simple por inmunofluorescencia microscopia Confocal

Aquí describimos un método in vitro de imágenes en vivo para visualizar el transporte intracelular de orgánulos y el tráfico de proteínas de membrana plasmática en astrocitos murinos. Este protocolo también presenta una metodología de análisis de imágenes para determinar los itinerarios de transporte de carga y la cinética.

Visualización y análisis del transporte intracelular de organelos y otros Cargos en astrocitos

Aquí, demostramos cómo combinar la transfección de neuronas primarias de roedores del hipocampo con imágenes confocales de células vivas para analizar los efectos patológicos inducidos por proteínas en el transporte axonal e identificar las vías mecanicistas que median estos efectos.

Uso de imágenes de células vivas para medir los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal en las neuronas primarias del hipocampo

El transporte endocítico y retrógrado de proteínas desde la membrana plasmática a la red trans-Golgi es esencial para mantener la homeostasis de la membrana y regular la señalización. Aquí, describimos un método para obtener imágenes y cuantificar el transporte endocítico de proteínas de carga transmembrana mediante microscopía de células vivas utilizando nanocuerpos anti-GFP derivados en células HeLa.

Imágenes de células vivas del transporte endocítico utilizando nanocuerpos funcionalizados en células cultivadas

Aprende a visualizar el transporte anterógrado del virus herpes en cultivos neuronales primarios mediante proteínas fluorescentes. Esta técnica permite estudiar la propagación viral en tiempo real con mínimo daño celular.

Móvil en vivo de imágenes de Alphaherpes Virus Transporte anterógrada y Propagación

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