Extracción de proteínas totales y 2-D Métodos gel de electroforesis para

El objetivo general de este procedimiento es generar un mapa bidimensional del proteoma bacteriano. Esto se logra primero cultivando una bacteria y recolectando sus proteínas. A continuación, las proteínas recolectadas se separan en una sola dimensión según su pH.

Mediante enfoque isoeléctrico tras la separación en la primera dimensión, las proteínas se separan adicionalmente en la segunda dimensión según su peso molecular. Finalmente, el gel de la segunda dimensión se tiñe y las proteínas se visualizan. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran diferencias en la expresión proteica mediante electroforesis bidimensional.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la patogénesis bacteriana, como qué proteínas se producen bajo ciertas condiciones y cómo difieren distintos aislamientos bacterianos en la producción de proteínas. Esta información puede ayudar a identificar proteínas candidatas que podrían estar involucradas en la virulencia. Después de cultivar un caldo lácteo de 100 mililitros hasta la fase estacionaria, transfiera 35 mililitros a un tubo de centrífuga y centrifugue a 4.500 Gs y cuatro grados Celsius durante 20 minutos.

Resuspenda el precipitado en 35 mililitros de PBS frío y repita la centrifugación. Después de resuspender el precipitado en un mililitro de PBS frío, transfiera la solución a un microtubo estéril de dos mililitros y centrifugue nuevamente. Repita el lavado con un mililitro de PBS frío antes de centrifugar a cuatro grados Celsius y 14.000 G durante un minuto. Descarte el sobrenadante y agregue un mililitro de solución P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F; transfiera el precipitado disuelto a un tubo roscado de dos mililitros que contenga aproximadamente 0,5 mililitros de perlas de vidrio previamente esterilizadas.

Luego, en la cámara fría, para romper las células, utilice un homogenizador mecánico con perlas tres veces durante un minuto cada vez, colocando la muestra en hielo después de cada ciclo y centrifugando durante un minuto antes de transferir el sobrenadante a un tubo estéril de poliestireno de cinco mililitros. Para aumentar el rendimiento, repita la agitación con perlas dos veces más con un alícuota adicional de P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F. Recupere las muestras.

Luego, tras determinar la cantidad de proteína, almacene alícuotas de 200 microgramos a menos 80 grados Celsius hasta su uso para realizar la primera dimensión. La focalización isoeléctrica o IEF comienza utilizando una solución limpiadora para limpiar los portacintas. A continuación, enjuague las cintas con agua Milli-Q.

Luego, déjelos boca abajo para que sequen después del secado, y asigne a cada muestra un número de portador de tira de gel. Cargue una muestra de proteína previamente preparada de 200 microgramos en el pozo lateral del portador de la tira, y use la pipeta para distribuir la muestra a lo largo del portador utilizando pinzas limpias. Saque las tiras de gel del empaque.

Luego retire la capa protectora de las tiras de gel antes de colocarlas con el lado áspero hacia abajo en un movimiento lento y deslizante, humedeciendo las tiras desde el extremo negativo hasta el extremo positivo. Para prevenir la quemadura, coloque papel absorbente humedecido con agua esterilizada encima del electrodo y debajo de las tiras de gel. Elimine las burbujas de aire y cubra con una capa fina de aceite mineral para evitar que se sequen.

Alinee los porta-tiras de gel en la máquina de IEF. Ejecute las muestras utilizando el programa que se indica aquí. Los geles se pueden retirar en cualquier momento durante el último paso.

Cuando el programa haya finalizado, retire las tiras de los portatiras y, a menos que se vayan a usar inmediatamente, cúbralas con envoltura de plástico y almacénelas a menos 80 grados Celsius hasta que esté listo para realizar la segunda dimensión de electroforesis SDS-PAGE. Después de armar el aparato para moldear geles para SDS-PAGE, prepare la solución de gel en un matraz con punta al vacío y una barra de agitación, añadiendo tampón Tris 1,5 molar draquel y una mezcla de agua MCU, y desgasifique la solución a velocidad moderada mediante vacío durante 20 minutos. Cuando finalice el vacío, agregue SDS al 10 % a la solución de gel pipeteando por la pared del matraz. Para evitar introducir burbujas, añada luego sulfato de amonio recién preparado y TEMED, y agite.

Vierta el gel y déjelo solidificar, luego disuelva el DTT en la solución de equilibración previamente preparada. Retire las tiras del almacenamiento a menos 80 grados Celsius, desenróllelas y coloque las tiras IPG con la cara de gel hacia abajo en el tampón, e incube durante 30 minutos. A continuación, agregue 4,5 litros de tampón de electroforesis al tanque de corrida.

Luego, utilizando pinzas, retire las tiras de la solución de equilibrio y use una toalla de papel para eliminar el exceso de tampón. Desarme el aparato de moldeo de geles y lave las placas de vidrio con agua tibia. Después de reemplazar el agua en la parte superior del gel con tampón de corrida, use pinzas limpias para colocar una tira encima de la placa larga con el lado del gel orientado hacia usted.

Lubrique la tira con un buffer x y utilice una tira de plástico para deslizar la tira IPG más hacia abajo contra el gel, eliminando todas las burbujas de aire entre la tira y el gel. Añada solución sellante de agarosa en la parte superior de la tira para fijarla en su lugar. Luego, tras repetir el proceso para todas las tiras, introdúzcalas en el tanque de gel.

Después de asegurarse de que el nivel del tampón 1x en la cámara externa esté en el nivel designado, coloque la cámara superior. Coloque el marco de la cámara de tampón superior encima de las placas de vidrio y presiónelo hacia abajo. Añada el tampón de electroforesis 2x a la cámara superior hasta la línea media.

Luego, agregue el tampón de marcha 1x a la cámara externa hasta que alcance la línea superior. Coloque la tapa y encienda la unidad de electroforesis y la fuente de alimentación. Haga correr las muestras durante toda la noche a 52 voltios, 96 miliamperios y cinco vatios.

Corra los geles hasta que las líneas líderes estén a un centímetro del fondo. Después del tiempo de corrida, retire las placas del soporte. Una vez que los geles se hayan retirado de las placas de vidrio, fíjelos en la solución uno durante al menos una hora o durante la noche a cuatro grados Celsius.

Luego, transfiera los geles a la solución de fijación dos y agite durante una hora. Lave los geles con agua Milli Q cuatro veces, durante 15 minutos cada vez. A continuación, use la solución de nitrato de plata para teñir los geles durante 30 minutos o hasta 48 horas.

Después de lavar los geles durante un minuto en agua Milli Q, transfiéralos a la solución reveladora hasta que el gel se tiña. Para detener la reacción entre cinco y 30 minutos, transfiera los geles a la solución de paro durante 10 minutos. Aquí se muestra un gel teñido con Kumasi Blues de extracciones de proteínas celulares completas de ol dia multivorans.

Aislados clínicos cultivados en caldo LB o en caldo de manitol con levadura y recolectados en fase estacionaria. El análisis comparativo de los perfiles proteicos extraídos de las mismas culturas bacterianas en dos ocasiones diferentes mostró patrones de bandas similares, lo que indica extracciones proteicas exitosas. En esta figura, el análisis mediante electroforesis en gel bidimensional de 200 microgramos de proteína total de Bural dio, pseudo muestra una abundancia de más de 500 puntos que pueden identificarse individualmente mediante espectrometría de masas.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la citometría para determinar diferencias cuantitativas y cualitativas entre aislamientos bacterianos estrechamente relacionados. Además, con una modificación del método de tinción, los investigadores pueden determinar la identidad de los puntos proteicos mediante la excisión de los puntos y espectrometría de masas.