Un Abrigo Ropa de cama de Ensayo de Semillas para explorar Genéticamente

El objetivo general de este procedimiento es armar un ensayo de lecho de cubierta seminal para explorar cómo el endospermo controla la germinación de semillas en un Arabidopsis en respuesta a diversas condiciones ambientales, tanto a nivel genético como in vitro. Esto se logra primero utilizando una aguja de jeringa y pinzas truncadas para diseccionar cuidadosamente la semilla, la cubierta y el embrión de semillas de Arabidopsis. En el segundo paso, las cubiertas seminales diseccionadas se transfieren suavemente a un medio de germinación.

A continuación, las cubiertas de las semillas se ensamblan en una sola capa circular. En el último paso, los embriones se disponen en el centro del lecho de cubiertas de semillas ensamblado, también en una sola capa circular.

El endospermo desempeña un papel esencial para controlar la germinación de semillas en nuestras semillas de ab autopsia. Y el ensayo de flexión del código de semilla es un procedimiento genético in vitro para identificar los componentes moleculares de las vías de señalización que actúan en el endospermo para el control de la germinación de semillas. En general, las personas conocen este método con dificultad porque es complicado diseccionar rápidamente el embrión sin dañarlo.

La edad del material establecido también es importante tenerla en cuenta, ya que con el tiempo pierde la capacidad de controlar la determinación celular a medida que envejece. Comience vertiendo de 50 a 60 microlitros de semillas secas maduras de Arabidopsis en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. A continuación, añada un mililitro de etanol al 70 % al tubo y agite las semillas a temperatura ambiente en un vórtex o a 1200 RPM. Tras 10 minutos, centrifugue el tubo durante tres segundos a 4.000 G para concentrar las semillas en el fondo del tubo.

Luego, use una punta de succión al vacío para aspirar cuidadosamente el etanol, dejando las semillas en el fondo del tubo. Ahora, agregue un mililitro de agua destilada estéril a las semillas y agite durante otros 10 minutos. Después de centrifugar nuevamente las semillas, aspire el sobrenadante y agregue otro mililitro de agua destilada estéril al tubo, asegurándose de que el flujo de agua suspenda las semillas de manera homogénea a lo largo del tubo.

Luego, coloque el tubo en un porta-tubos para permitir que las semillas sedimenten en el fondo del tubo. Después de aproximadamente 30 segundos, aspire cuidadosamente el agua para sembrar las semillas. Primero, vierta 30 mililitros de medio de germinación recién preparado a 50 grados Celsius en una placa de Petri de 100 milímetros. Resuspenda las semillas en 200 microlitros de agua destilada estéril y, a continuación, utilice una punta de micropipeta de un mililitro para transferirlas a la superficie del medio de germinación.

Aspire el agua que rodea las semillas y luego deje la placa de Petri y las semillas destapadas en el gabinete de flujo laminar para un secado adicional. Después de dos horas, cierre la placa de Petri, dejando las semillas en la campana durante otros 90 minutos. Ahora, coloque un microscopio estereoscópico dentro de la campana.

Vierta 30 mililitros de medio de germinación en otra placa de Petri de 100 milímetros y, a continuación, coloque dos papeles rectangulares Watman nº 3 autoclavados adyacentes sobre la superficie del medio. El paso más difícil de este procedimiento es la disección de c, ya que A, la semilla es muy delgada, por lo que es necesario tener mucho cuidado para evitar dañar el embrión al cortar la semilla sujeta utilizando, con un par de pinzas estériles Dumont de punta roma número cinco.

Transfiera las semillas sobre los papeles, manteniendo luego las pinzas cerradas. Presione suavemente una semilla individual sobre el papel. Ahora utilice la punta de una aguja de jeringa para insulina de calibre 29 para cortar el tegumento de la semilla a lo largo del eje semiprincipal más largo, lo más cerca posible del lugar donde las cofias se unen al radículo.

Luego, use la pinza para presionar la semilla contra el papel. Nuevamente, aplique presión en la punta de las pinzas más cercana a la punta del radículo para liberar el embrión del tegumento de la semilla y armar un ensayo de aislamiento del tegumento. Primero, coloque un trozo de malla de nailon estéril de 3,5 por cinco centímetros en otro plato fresco de 100 milímetros con medio de germinación.

Luego, use la jeringa para empujar suavemente los embriones y las cubiertas seminales hacia los bordes metálicos de la pinza y transfiera los tejidos vegetales a la malla de nailon. Use la pinza y la jeringa para armar una sola capa circular de las cubiertas seminales, asegurándose de que las cubiertas estén lo más próximas posible entre sí y de que las aberturas en las cubiertas seminales estén orientadas hacia arriba. A continuación, coloque los embriones en una sola capa circular en el centro del lecho de cubiertas seminales, asegurándose de que los embriones también estén lo más próximos posible entre sí.

Finalmente, incubar los ensayos con sustrato de semillas bajo luz continua a 20-21 grados Celsius, en concordancia con resultados previos. Semillas mutantes de rábano opsys, incapaces de sintetizar gierilina o mutantes deficientes en GA, no pueden germinar 80 horas después de la inhibición de la semilla. En contraste y en mayor concordancia con resultados anteriores, la eliminación de la testa desencadena el crecimiento del embrión mutante deficiente en GA, a menos que el ácido OB CIC o un BA esté presente en el medio, lo que sugiere que el endospermo de los mutantes deficientes en GA libera un BA hacia el embrión para bloquear su germinación.

En esta imagen, 80 horas después de la inhibición de la semilla, se muestra un ensayo de cultivo sobre testa con embriones mutantes deficientes en GA sobre una capa de 80 testas mutantes deficientes en GA. De acuerdo con nuestra hipótesis, las testas mutantes deficientes en GA bloquean el crecimiento de embriones mutantes deficientes en GA. Aquí se muestra un ensayo de cultivo sobre testa con embriones mutantes deficientes en GA cultivados sobre una capa de testas mutantes deficientes en GA que también carecen de la capacidad de sintetizar ABA, 80 horas después de la inhibición de la semilla; como era de esperar, las testas mutantes no pueden bloquear el crecimiento de los embriones mutantes deficientes en GA.

De manera similar, embriones mutantes deficientes en GA cultivados sobre una capa de semillas mutantes deficientes en GA que carecían del factor deli RGL2, tampoco fueron capaces de bloquear el crecimiento de embriones mutantes deficientes en GA siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como el análisis de expresión génica a partir de cubiertas de semillas y embriones disecados de semillas, pueden realizarse para investigar la interacción genética utilizando el baño de cubierta de semilla. Así, una vez dominada la técnica, debería permitir a los investigadores en el campo de la germinación de semillas explorar cómo la cubierta de semilla controla el crecimiento embrionario en respuesta a señales ambientales en nuestro sistema.