La identificación de bacterias metabólicamente activas en el intestino de la Generalista Spodoptera littoralis Vía ADN isótopos estables Uso ¹³ C-glucosa

El objetivo general del siguiente experimento es detallar una metodología eficiente empleada para caracterizar filogenéticamente las bacterias metabólicamente activas en el intestino de un insecto. Esto se logra alimentando primero al insecto con glucosa marcada con C 13 para enriquecer isotópicamente el ADN de las bacterias metabólicamente activas en su intestino. El siguiente paso es extraer el ADN de la comunidad bacteriana presente en el intestino.

El tercer paso es separar el ADN de las especies metabólicamente activas, que incorporaron el C 13. A continuación, el ADN se identifica filogenéticamente y se cuantifica para las especies presentes mediante pirosecuenciación. Identificando así las especies bacterianas metabólicamente activas que componen la comunidad presente en el intestino del insecto.

Por lo tanto, el intestino del organismo pluricelular es una invención ingeniosa para explotar las capacidades metabólicas de los microorganismos para disolver o solubilizar la materia orgánica compleja para que finalmente pueda servir como nutrientes para el insecto huésped. Para entender el sistema, tenemos que analizar primero quién está ahí fuera, y en segundo lugar quién tiene qué de las actividades metabólicas. Si tenemos estos datos, podemos reconstruir el flujo de metabolitos y productos de degradación entre los microorganismos que se degradan y el insecto huésped.

Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo de la ecología microbiana, particularmente en la forma en que estos microbios interactúan con su huésped. En ese sentido, podríamos conocer más y aclarar y definir cuáles son las funciones que estos organismos están cumpliendo para su huésped. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre las bacterias intestinales activas en general.

Mediante el seguimiento de la glucosa ucle, también se puede realizar a otras fuentes de carbono, como el etiquetado de la celosa para identificar las bacterias activas involucradas en el proceso de digestión del nutriente ocrant. Mantenga los litros, los huevos y las placas de Petri a temperatura ambiente hasta que eclosionen. Luego, transfiera las larvas recién eclosionadas a una caja de plástico limpia y críalas con una dieta artificial a 23 a 25 grados Celsius bajo un régimen de día largo con 16 horas de iluminación y ocho horas de oscuridad; después de unos días, transfiera de nueve a 15 larvas sanas del segundo estadio de la caja de cría a placas de Petri individuales que contienen glucosa C 13 fresca.

Dieta artificial enriquecida, se necesitan al menos tres réplicas de tres larvas cada una por tratamiento. Utilice una dieta artificial que proporcione la misma cantidad de glucosa nativa que una fuente de alimento natural como el algodón para alimentar al grupo de control. Durante las próximas 24 horas.

Renovar frecuentemente las dietas artificiales. Comience transfiriendo las larvas con pinzas blandas a un charco de agua destilada para eliminar los desechos grandes. Luego transfiéralo a un nuevo plato limpio para anestesiar y matar los insectos.

Colóquelos sobre hielo y luego baje la temperatura a menos cinco grados centígrados en una hielera. A continuación, desinfecte los insectos muertos con etanol al 70% y sumérjalos en PBS para la disección. Las herramientas también deben limpiarse con etanol al 70%.

Comience con incisiones en la cutícula a lo largo de los lados derecho e izquierdo. Comienza en la cabeza y termina en el ano. Retire todo el exoesqueleto, los túbulos malienses y el cuerpo graso.

Luego, reemplace el tampón antes de abrir el intestino con el intestino aislado de los otros tejidos. Procese todo el intestino o secciones para el intestino, el intestino medio o el intestino posterior. Dependiendo de la cuestión científica.

Transfiera los tejidos intestinales sin PBS a un pequeño tubo estéril y guárdelos en el congelador. Antes de la extracción de ADN, seque las muestras a 45 grados centígrados en un dispositivo concentrador de vacío durante 30 a 90 minutos, dependiendo del tamaño del tejido. A continuación, triture el tejido seco con un Pelé de plástico estéril para extraer el ADN genómico utilizando un kit para la extracción de ADN del suelo.

A continuación, determine la concentración del ADN final eludido utilizando un espectrofotómetro. Verificar una extracción exitosa del ADN metagenómico microbiano del intestino del insecto mediante la preparación de un ensayo de PCR de diagnóstico utilizando cebadores generales bacterianos 27 F y 1, 492 R. Para el diagnóstico. Haga funcionar cinco microlitros de cada producto PCR en un gel 1%agros a 300 voltios y 115 miliamperios durante unos 20 minutos.

El tamaño correcto de los amplicones es de 1,5 kilobases. Junte el ADN extraído correspondiente a cada réplica experimental. Mantener separados los que tienen y no glucosa C13.

Normalice las concentraciones de ADN para garantizar que cada muestra contribuya por igual a su grupo. Una concentración final de 500 a 5.000 nanogramos de ADN es adecuada para el proceso de ultracentrifugación. Verifique dos veces la concentración anticipada con el espectrofotómetro en un tubo estéril de 15 mililitros con tapón de rosca.

Configura el medio de degradado. Combine el ADN cuantificado con 4,8 mililitros de solución de cloruro de cesio. A continuación, rellene el volumen con seis mililitros de tampón de degradado.

Transfiera con cuidado las mezclas a tubos de ultracentrífuga de 5,1 mililitros. Con una jeringa y una aguja, llene los tubos hasta la base del cuello y evite bombear o formar burbujas de aire. Incluya al menos un gradiente en blanco sin ADN en cada ejecución.

Para que actúe como gradiente de referencia, seleccione pares de tubos y equilibre con una precisión de 10 miligramos. Aplique un topper de tubo a cada tubo y asegúrese de que estén libres de fugas invirtiendo el tubo y aplicando una presión moderada con la mano. Utilice un rotor casi vertical con ocho pozos.

Selle cuidadosamente los pozos del rotor y cargue el rotor en la ultracentrífuga de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Gira el ADN a 50.000 RPM a 20 grados centígrados bajo el vacío durante 40 horas. Seleccione la aceleración máxima y la deceleración sin frenar.

Dos días después, retire con cuidado los tubos del rotor de la centrífuga con pinzas. Colóquelos en una rejilla sin alterar los gradientes formados y procese los tubos de inmediato. En primer lugar, equilibre una HPLC utilizando un caudal de 850 microlitros por minuto.

Luego, conecte el tubo de ultracentrífuga a un soporte de abrazadera y perfore la parte inferior del tubo con una aguja de una pulgada de calibre 23 unida a una jeringa. Por lo tanto, perfore con cuidado la parte superior del tubo con un minero de control para evitar alterar la forma, el gradiente y la práctica de antemano para garantizar un movimiento exitoso de PSA. A continuación, inserte la aguja conectada al tubo de la bomba en la parte superior del tubo donde no haya líquido y recoja las gotas de la parte inferior directamente en tubos de microfuga estériles de 1,5 mililitros que recojan una fracción cada 30 segundos durante 425 microlitros por fracción.

En este ejemplo, se recogen 12 fracciones de cada gradiente. A continuación, mida la densidad de cada fracción separada en una balanza analítica. Proceda con la recuperación de ADN y la secuenciación pirotécnica consultando el protocolo de texto durante 24 horas.

La glucosa C 13 de 10 milimolares se suplementó en la dieta de litros de sop. Larva. La misma cantidad de glucosa normal se añadió a la comida de los insectos control. A continuación, se extrajo el ADN de la comunidad bacteriana del intestino del insecto.

En un gel de electroforesis, una fuerte banda de ADN genómico en la parte superior confirmó una extracción exitosa de ADN, una PCR diagnóstica. El uso de cebadores universales bacterianos mostró la presencia de ADN bacteriano, la secuenciación piratórica cuantitativa se realizó directamente sobre los gradientes SIP representativos para revelar el linaje de la especie y su abundancia relativa. Se generaron un total de 120.045 lecturas de alta calidad con una longitud media de 404 OTs.

El perfil de secuenciación piroscópica mostró una mayor abundancia de ciertas especies, incluidos enterococos y panto, en la muestra etiquetada en comparación con la del grupo de control. Por lo tanto, se considera que esas bacterias son metabólicamente activas y merecen un estudio más profundo. Por lo tanto, al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe incluir un control adecuado en el análisis CYP.

Por lo tanto, lo que restaría el impacto del fondo, la contaminación en el destello del cabello y aseguraría que la diversidad y abundancia de bacterias que aparecen o desaparecen no son un artefacto de la masa en sí. Siguiendo este procedimiento o las metodologías como la fluorescencia in situ se podría utilizar y realizar la hibridación con el fin de responder preguntas adicionales. En ese caso se estará ocupando de la localización y disposición de las bacterias dentro del intestino del insecto.