Microinyección de Heridas Ensayo y In vivo Localización de la herida epidérmica Reporteros de respuesta en Drosophila Embriones.

El objetivo general de este procedimiento es visualizar in vivo la respuesta de la herida epidérmica en embriones de Drosophila. Esto se logra recopilando primero la etapa de desarrollo en la que la actividad del reportero se puede detectar de manera consistente. El segundo paso del procedimiento es perforar el embrión con una aguja de vidrio y un aparato de microinyección.

El tercer paso es anestesiar el embrión para la visualización del reportero. El paso final es validar la localización del reportero mediante la detección del patrón de expresión de las sondas de ARN. En última instancia, los resultados pueden mostrar la activación específica del indicador de respuesta a la herida epidérmica solo en las células que rodean el sitio de la lesión por punción a través de la microscopía confocal.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes que implican el cierre de la herida es que podemos ver en los embriones vivos la expresión génica que se desencadena por la herida punzante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reparación de tejidos, como la forma en que las células que rodean una lesión regulan una respuesta inmediata a la herida para promover la reparación. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de la regeneración tisular, ya que la regulación de la respuesta de la herida es el paso inicial.

La cicatrización de heridas se puede ensayar en cualquier etapa del desarrollo. Sin embargo, en la etapa 17, la cutícula está demasiado madura. Los reporteros de heridas conocidas no se activarán.

Así que para demostrarlo, la etapa 15 a 16 será herida para cosechar embriones. Recolecta moscas adultas de dos a tres días de edad, 50 hembras y 25 machos. Transfiérelos a una jaula de recolección de embriones con un plato fresco de jugo de manzana, agar y una cucharada de pasta de levadura.

Aloje la jaula a 25 grados centígrados cada mañana durante los próximos tres días. Reemplace el plato por uno nuevo. En la tarde del tercer día, deje que los huevos se acumulen en un plato fresco durante dos horas.

Guarde este plato durante 14 horas a 25 grados centígrados. Una puesta de dos horas debería producir unos 200 embriones al día siguiente. Agregue unos mililitros de agua al plato y revuélvalo suavemente.

Luego, con un pincel, transfiera el agua y los embriones del plato a una canasta de malla de nailon en un tubo de recolección. Ahora haz un baño de lejía poco profundo y remoja los embriones en él durante dos minutos. Este paso elimina los COR, los huevos.

La cáscara agita el baño unas cuantas veces para evitar que los embriones se aglomeren. Después de dos minutos, enjuague los embriones con agua corriente y enjuague con placa de Petri durante cinco segundos cada uno. Luego, transfiera la canasta de embriones a una toalla de papel para secar los embriones.

A continuación, con una aguja de disección, traslade unos 50 embriones de la malla a una placa de agar hecha con colorante alimentario verde. El tinte es para aumentar la visibilidad de los huevos de rodilla. Bajo un telescopio de disección, haga dos filas paralelas de embriones a unos cinco milímetros de distancia.

Coloque las filas separadas por el ancho de un embrión para permitir el intercambio de gases. A continuación, presione con cuidado un portaobjetos con cinta adhesiva doble sobre los embriones para que las filas queden perpendiculares a la longitud del portaobjetos. Para reducir su presión interna, deja que los embriones se sequen al aire.

De esta manera, no estallarán cuando estén heridos. Después de 25 minutos, el primer portaobjetos preparado debe estar seco. Ahora, cubra los embriones con dos o tres gotas de aceite de carbono de halo para evitar una mayor deshidratación y proceda inmediatamente a herir los embriones secos.

Coloque el portaobjetos del embrión en la etapa del microscopio de inyección. Encuentre los embriones en el campo de visión y practique mover la platina del microscopio invertido. Ahora concéntrese en el plano medio del embrión a lo largo del eje ventral dorsal y lleve el embrión superior de la primera fila alineada al campo de visión.

A continuación, coloque y asegure con cuidado una aguja extraída en el soporte de la aguja. Utilice el micromanipulador para mover la aguja hacia abajo hasta el portaobjetos. Alinee la aguja con el embrión en el mismo plano focal.

Ahora, no ajuste más el manipulador de micrómetros. Ahora mueva la etapa para perforar el embrión de un lado a otro. A continuación, pasa al siguiente embrión de la fila.

Después de enrollar la primera fila, mueva la aguja completamente hacia arriba y lejos del escenario. A continuación, gire el portaobjetos y continúe perforando los embriones en la segunda fila. Una vez que todos están heridos, los embriones pueden ser fijados inmediatamente para su hibridación interna o tinción de anticuerpos.

Para examinar los reporteros fluorescentes, espere de cuatro a seis horas y transfiera el embrión a uno nuevo en el nuevo portaobjetos, coloque cuentas de vidrio alrededor de los embriones. A continuación, añade unas gotas de 50%One phenoxy, dos propanol, que es un anestésico, y coloca un cubreobjetos en los embriones para las micro inyecciones. Cargue la aguja de inyección desde la parte posterior con un microlitro de solución química más tinte, como peróxido de hidrógeno 0,6 molar.

Permita que la acción capilar atraiga la solución química hacia la punta de la aguja. A continuación, rompa la punta de la aguja contra el borde de un cubreobjetos en la mezcla de aceite de carbono halo. Primero, coloque la aguja montada con el borde del cubreobjetos en ángulo a menos de 90 grados.

A continuación, mueva suavemente el borde deslizante de la cubierta a través de la punta de la aguja hasta que se rompa. A continuación, aplique presión sobre el aparato de microinyección y compruebe que la solución sale de la aguja. Si no fluye, rompe la aguja un poco más.

Ahora, realice el mismo procedimiento que se usa para perforar embriones solamente. Esta vez, micro inyecte la solución simultáneamente con la punción. Lo ideal es inyectar 10 nanolitros.

Si se inyecta demasiada solución en el embrión, la membrana de Vitale se romperá mientras sigue el procedimiento de fijación en el protocolo de texto, preste mucha atención a los siguientes pasos. Use una pipeta de vidrio, no de plástico para enjuagar el heptano sobre el portaobjetos y use vidrio para hacer girar los embriones en el centro de la placa de Petri de vidrio. Posteriormente, agite los embriones en fijador durante 25 minutos a 220 a 230 RPM.

Después de agitar, deje que las burbujas de la interfaz exploten antes de eliminar por completo la fase acuosa inferior. Además, tenga cuidado de no arrancar los embriones. Después de agregar el metanol, los embriones heridos deben agruparse en la interfaz más tarde, esparcir los embriones a lo largo de la superficie de la placa de esta manera y transferirlos a un portaobjetos de vidrio con cinta adhesiva doble de esta manera.

A continuación, empuje cuidadosamente los embriones con la aguja de disección para reventar la membrana Vitale y proceda a la deshidratación. Las moscas de tipo silvestre se transformaron con reporteros fluorescentes fusionados con DOPA descarboxilasa o potenciadores de tirosina hidroxilasa y se sometieron al ensayo descrito. Bajo campo claro, fue posible ver el sitio de la herida, mientras que bajo iluminación de fluorescencia, fue posible ver la actividad reportera de la herida DCD.

El reportero de tirosina hidroxilasa mostró un resultado similar. Ambas imágenes se recogieron en un microscopio confocal Leica SP dos con un objetivo de 20 x. El procedimiento se realizó en un flujo de pérdida de función dos mutantes.

Antecedentes, la actividad reportera de la DOPA descarboxilasa se expandió a través de las células epidérmicas en el flujo de ganancia de función de dos mutantes generados con expresión ubicua en todas las células. Se observó inhibición del reportero en todas las células epidérmicas. A continuación, los embriones fueron simultáneamente heridos e inyectados con un compuesto solubilizado y el peróxido de hidrógeno con colorante azul de udina y el agua expandieron la actividad reportera de la DOPA descarboxilasa en las células epidérmicas, al igual que una inyección de ciclodextrina de metilo B en hidróxido de sodio utilizando hibridación de U en el interior.

La activación transcripcional de los genes de respuesta a la herida se realizó mediante el ensayo de DOPA descarboxilasa endógena. Se observó que la expresión de ARN se localizaba alrededor del sitio de la herida y, por supuesto, también se encontró que la tirosina hidroxilasa, las transcripciones de ARN se acumulaban en el sitio de la herida. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 60 minutos si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante no dedicar demasiado tiempo a alinear los embriones y avanzar con los siguientes pasos del procedimiento.