Name: Microinyección de Heridas Ensayo y In vivo Localización de la herida epidérmica Reporteros de respuesta en Drosophila Embriones. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T21:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprende a visualizar la respuesta epidérmica a heridas en embriones de Drosophila mediante microinyección y microscopía confocal. Este método permite estudiar la expresión génica en tiempo real durante la reparación tisular.

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Este protocolo ha sido desarrollado en colaboración con los miembros anteriores del McGinnis Lab, Kim A. Maza y José C. Pearson. Damos las gracias a los constantes esfuerzos realizados por el Bloomington Drosophila Stock Center por su trabajo de organizar y distribuir las reservas de valor. Este trabajo fue apoyado por la financiación de los Institutos Nacionales de Salud (R01 GM077197 y K12 GM68524) y la familia de Herbert Stern. MTJ es compatible actualmente con número de concesión 5G12RR003060-26 del Centro Nacional de Recursos para investigación y número de subvención 8G12MD7603-27 del Instituto Nacional de Salud para Minorías y Disparidades de Salud. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Salud para Minorías y Disparidades en Salud o de los Institutos Nacionales de Salud.

El protocolo de la herida embrionario de Drosophila se puede resumir en cinco pasos: (1) Colección de Embriones, (2) Preparación de Embriones (3) Embryo hiriente, (4) La microinyección de embriones, y (5) Fijación de Embriones. 1. Embrión Collection <ol><li> Recoger las moscas adultas, 2-3 días después de eclosing, añadir 50 hembras y 25 machos de una jaula de recogida de embriones. </li><li> Coloque un agar jugo de manzana fresca, más la placa de levadura cada mañana durante 3 días. Notas: Para la recolección óptima de embriones, ciclo de las moscas en un horario diurno de 12 horas en una incubadora a 25 ° C (05:00 luminosos &quot;en&quot; y 17:00 las luces &quot;OFF&quot;); moscas hembras responden a los cambios en el ciclo de luz y depositará una mayor cantidad de huevos durante un interruptor de las luces de &quot;ON&quot; a las luces &quot;OFF&quot; 10,11. </li><li> En la tarde del Día-3, coloque un jugo de manzana fresca, más placa de agar de levadura en la jaula y recoger los embriones durante 2 horas. Coloque una nueva placa de la levadura en la jaula y guardar el2 plato de la colecta hr. </li><li> Guarde la placa de recogida para una 14 horas adicionales a 25 ° C para envejecer los embriones. Notas: La curación de heridas se puede ensayar en cualquier momento durante el desarrollo de Drosophila, los reporteros de la transcripción inducida por la herida que se describen en este documento tienen una actividad óptima entre las etapas 12 15 al 16. A finales de la etapa 17, el embrión es demasiado viejo para perforar fácilmente la cutícula maduración y activar de manera eficiente a los reporteros de la herida o detectar la transcripción inducida por lesión. Para permitir que el tiempo de recogida y el tiempo de las heridas que se produzcan durante las horas pico de laboratorio, seguimos un horario de recogida de embriones durante 2 horas (16:00-18:00), el intercambio de la placa de colección con una nueva placa a las 18:00, la edad la placa de recogida a 25 ° C durante 14 horas (durante la noche), y terminó los embriones a las 08:00 (día siguiente). </li></ol> 2. Preparación de embriones Notas: Este protocolo incluye el uso de muchas herramientas y objetos que son agudas o hechos de gmuchacha. Maneje todos los objetos punzantes y objetos de vidrio con cuidado para evitar lesiones personales. <ol><li> Retire con cuidado los embriones a partir de placas de recolección con un pincel añadiendo 2.3 ml de agua a la placa y el remolino. Transferencia de agua y embriones de la placa de malla de nylon y tubo de recogida. </li><li> Añadir 4-5 ml de lejía a la tapa de una placa de placa de Petri de plástico y empapar el extremo de malla de cubierta del tubo de recogida que contiene los embriones en lejía durante 2 min; que elimina la cáscara de huevo exterior del embrión. Gire manualmente el tubo de extracción de un par de veces para evitar que los embriones se agrupen en el blanqueo. Enjuague los embriones con 10x de agua y seque el tubo de recogida de cubiertas de malla que contiene los embriones dechorionated sobre una toalla de papel. </li><li> Utilice una aguja de disección para transferir ~ 50 embriones a partir de malla de nylon a una placa de agar. Añadimos colorante verde a la placa de agar para añadir contraste y la ayuda en la alineación del embrión. Bajo un microscopio de disección, hacer dos filas paralelas de ~ 25 embriones, alineando la embryOS en la diapositiva para que puedan estar en ángulo recto con respecto a la aguja de punción en el aparato de microinyección. Deja un poco de espacio (aproximadamente 1 longitud del embrión) entre los embriones con fines de intercambio de gases. Las dos filas paralelas deberían ser de aproximadamente 5 mm. </li><li> Coloque una diapositiva con cinta adhesiva doble en la parte superior de los embriones alineados y presione con cuidado el portaobjetos para transferir los embriones de la placa de color verde a la diapositiva. Luego de aire secar los embriones ~ 25 min para reducir la presión interna en el embrión y evitar una explosión cuando la herida. </li><li> Ponga 2-3 gotas de aceite de mezcla de halocarbonos en los embriones para evitar una mayor deshidratación. </li></ol> 3. Embrión Herir <ol><li> Colocar el portaobjetos del embrión en la platina del microscopio de la inyección. Encuentra los embriones en el campo de visión y la práctica de mover la platina del microscopio invertido. Notas: Antes de trabajar con la aguja, se centran en el plano medio de embrión a lo largo del eje dorsoventral. Para permitir la herida eficiente de laembriones alineados, comienzan hiriendo a la fila más cercana al aparato de aguja. Mover la etapa de llevar la parte superior de la fila de embriones alineados en el campo de visión. </li><li> Coloque con cuidado y asegurarse una aguja tirado en el soporte de la aguja. Utilice el micromanipulador para mover la aguja hacia abajo, hacia la diapositiva. Alinear la aguja con el embrión, en mismo plano focal. Una vez que la aguja está en el enfoque con el embrión, no mueva la aguja con el micromanipulador. </li><li> Mueva la platina para perforar el embrión hasta la médula, a continuación, pasar a la siguiente embrión en la fila. Cuando termine hiriendo a la primera fila, utilice el micromanipulador para mover la aguja completamente hacia arriba y fuera de los escenarios antes de mover la diapositiva; girar manualmente la corredera 180 ° y terminó la segunda fila. </li><li> Guarde los embriones menores de aceite de halocarbono a temperatura ambiente y proceder a la fijación de embriones si haciendo hibridación in situ o tinción de anticuerpos (véase el paso Procedimiento 5). Alternativamente, almacenar los embriones de 4-6 horasbajo aceite de halocarbonos y proceder con visualización fluorescente reportero transcripcional de la herida (resultados representativos). Notas: Para la visualización de la reportero fluorescente, que anestesian los embriones utilizando 50% de 1-fenoxi-2-propanol 13. Los embriones se retiran de la aceite de halocarbono y se colocan en una nueva diapositiva. Ponemos cuentas de vidrio alrededor de los embriones, añadimos unas gotas de anestésico, y colocamos un cubreobjetos sobre los embriones. </li></ol> 4. Microinyección de embriones Notas: El aparato de microinyección que usamos en el protocolo no está automatizado para entregar volumen específico durante el ensayo. Añadimos un colorante a la solución para visualizar la microinyección y tratar de normalizar el volumen entregado. Si se inyecta demasiada solución en el embrión, la membrana vitelina estallará. <ol><li> Aguja de carga de la parte trasera con 1 l de solución química más tinte (por ejemplo, 0,6 MH 2 O 2). Permitir capilaracción para dibujar la solución química a la punta de la aguja. </li><li> Para romper una aguja, coloque una hoja de la cubierta a un ángulo en un portaobjetos y cubrir el borde con la mezcla de aceite de hidrocarburo halogenado. Llevar la aguja montada en el foco con el borde de la hoja de la cubierta inclinada y suavemente mover borde hoja de la cubierta a través de la punta de la aguja hasta que se rompa. Aplique presión sobre el aparato de microinyección y comprobar que la solución química más medio de contraste fluye a la aguja. </li><li> Coloque la diapositiva que contiene los embriones alineados en la platina del microscopio. Proceder para enfocar el embrión y la aguja en el mismo plano. Simultáneamente perforar y solución química microinyectar además de teñir en cada embrión. Notas: agujas obstruidos producen con frecuencia; romper una aguja nueva para evitar la microinyección incompleta. Una punta de la aguja roma no hiere tan limpiamente como una punta de la aguja en ángulo. Ajuste del cubreobjetos a un no-ángulo de 90 ° durante la rotura es óptimo para producir una punta de la aguja en ángulo. </li></ol> 5. Fi Formaldehídojación Notas: Los productos químicos utilizados en esta fijación Drosophila son perjudiciales. Use el equipo de protección personal (por ejemplo, guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad) al manipular los productos químicos. Siga las pautas institucionales individuales para la eliminación de productos químicos regulados. <ol><li> Después de herir, esperar 15, 30, 60, o más minutos para la activación transcripcional de los genes inducidos por la herida que se produzca. Para eliminar los embriones a partir de diapositivas de inyección, escurrir con cuidado la mezcla de aceite de halocarbonos de las diapositivas, la diapositiva apoyarse contra un estante y borra el extremo con un Kimwipe. </li><li> Utilice una pipeta de vidrio para enjuagar heptano sobre el portaobjetos y lávelo el líquido de enjuague en una placa de Petri de vidrio. Heptano se disolverá la cinta y liberar los embriones. Continuar enjuagando hasta que todos los embriones se retiran de la diapositiva. Pase a la siguiente diapositiva, hasta que todos los embriones se extraen a partir de diapositivas. </li><li> Transferir el heptano plus solución embrión desde el plato de cristal en una ciencia 20 mlvial ntillation. Agitar el vial durante 2-3 minutos, retire el heptano y añadir 5 ml de heptano fresco. </li><li> Añadir 5 ml de solución fresca, fijación (véase la lista de reactivos para la receta). Se tapa el vial y se unen a un agitador de plataforma orbital. Agitar el vial que contiene los embriones durante 25 minutos a 220-230 rpm. </li><li> Después de agitar, dejar que las burbujas en el pop interfaz. Retire completamente la fase inferior, acuosa con una pipeta, evitando tirar los embriones. La capa inferior consiste en la solución de fijación y que deberá eliminarse adecuadamente. </li><li> Añadir 5 ml de metanol, tapar el frasco y agitar con fuerza a mano durante 20-30 segundos, remolino y colocarlo en su lugar. Heridos embriones permanecerán en la interfase y no hundirse hasta el fondo. Notas: Después de la fijación de la membrana vitelina de un embrión no herida normalmente ráfaga durante la etapa de deshidratación con metanol. Sin embargo, la membrana vitelina en un embrión de herida ya está rota y la etapa de deshidratación no se eliminará el memb vitelinarane. Se requiere mano-devitellinzation para completar el protocolo de fijación. </li><li> Retire con cuidado y la capa de heptano superior a continuación, añadir 5 ml de metanol fresco. Agitar el vial y los embriones deben hundirse. </li><li> Retire la solución de metanol más embrión con una pipeta de transferencia de vidrio y recoger en un tubo de recogida de malla de nylon en un plato de cristal. </li><li> Retire el metanol y enjuague los embriones con solución PBS 1x. </li><li> La transferencia de los embriones de la malla de nylon a una placa de jugo de manzana. Extender los embriones a cabo a lo largo de la superficie de la placa. </li><li> La transferencia de los embriones a un portaobjetos de vidrio cinta adhesiva doble. Cubra los embriones con 1x PBS. Notas: Los embriones tienden a agruparse debido a la membrana vitelina. El uso de un lugar de jugo de manzana permite la separación rápida de los embriones amontonados. Los embriones deben ser retirados de la placa y se transfieren a un portaobjetos de vidrio cinta adhesiva doble porque los embriones se hunden en la placa de agar cuando se aplica fuerza para quitar el embrión a partir de lamembrana vitelina. </li><li> Empuje con cuidado los embriones con una aguja de disección para &quot;pop&quot; de la membrana vitelina. El embrión debe hundirse en el PBS. </li><li> Usar una pipeta de vidrio para transferir el PBS 1x además de los embriones a un tubo de 1,5 ml. Enjuague los embriones con 1x PBS y se almacena a 4 ° C. Proceder a deshidratar los embriones utilizando un etanol: la serie de PBS y continuar con la hibridación in situ o protocolo immunolocalization 14. </li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Una respuesta reguladora de la transcripción inmediata a las señales externas permite a las células para coordinar una respuesta localizada a estímulos extracelulares, que puede incluir el estrés, daños, o infección. El control inadecuado de una respuesta localizada puede tener efectos dañinos en las células vecinas, así como una pérdida de recursos para reparar la lesión. El embrión de Drosophila es un excelente sistema para realizar experimentos básicos de cicatrización de heridas en una de mantener, fácil organismo modelo barato y. El potencial para la colaboración entre la investigación en otros organismos modelo y Drosophila ofrece una oportunidad única para explorar las muchas cuestiones biológicas. Una técnica adicional de los reporteros de la herida es la combinación genética de mutantes antecedentes, proporcionar un método eficiente para probar la contribución de nuevos genes a la activación de la vía de respuesta epidérmica de la herida. Tenemos transcripcionales epidérmicas herida inducida available tanto en la 2 ª y 3 ª cromosomas 5. En este estudio utilizamos UAS GAL4 y sistemas de sobreexpresión 16. En los estudios con alelos mutantes letales determinamos los antecedentes genéticos usando un cromosoma equilibrador fluorescente, por ejemplo Kruppel-GFP 17. Hemos analizado la localización reportera herida en varias bases genéticas (Tabla 1). Una posible modificación de la técnica es combinar la microinyección y heridas. La microinyección se puede utilizar para introducir una solución química en el embrión. Varios compuestos químicos se han probado y se encontró que regular la actividad de los reporteros de la herida epidérmica 9. Este método de la herida y la microinyección simultánea puede ser útil para aumentar el número de células en el embrión de Drosophila que responde una señal de la herida y se puede utilizar directamente para controlar los cambios de expresión génica después de la herida 18. Una aplicación en el futuro de la técnica de microinyección será probar nuevos productos químicos para la regulación de la respuesta epidérmica de la herida. Drosophila como sistema modelo para estudios genéticos ofrece una amplia gama de protocolos sencillos para abordar eficazmente las cuestiones complejas. Los recientes informes sobre la viabilidad de las técnicas de Drosophila destaca el uso de la migración hemocyte 19 y la infección avispa parásita 20 como medio para ampliar aún más el impacto de la comunidad de investigación de Drosophila. Además de los estudios de la reparación de heridas, Drosophila proporciona un modelo clásico para la regeneración con el sistema de disco imaginal 21,22. Los avances en los estudios combinados de regeneración del disco imaginal y heridas de punción / microinyección ofrece un excelente sistema para descubrir los componentes bien conservados de la reparación de tejidos.

La manipulación de embriones de Drosophila utilizando una técnica de microinyección es un ensayo bien establecido-1. La importancia del método reportero respuesta epidérmica herida es combinar el protocolo para la punción / microinyección con reporteros fluorescentes y visualizar una respuesta in vivo a la lesión epidérmica en embriones de Drosophila. El objetivo de este método es permitir un conjunto más amplio de los científicos a utilizar Drosophila como herramienta para investigar los procesos que regulan la respuesta transcripcional a la lesión de punción epidérmica. La epidermis de una sola capa en Drosophila proporciona un sistema sencillo para estudiar la respuesta epidérmica de la herida después de haberse pinchado 2. El embrión de Drosophila es un sistema de modelo sólido para diseccionar genéticamente las etapas de la reparación de heridas, incluyendo la respuesta de la herida, la inflamación, y la reepitelización 3. Esto es en parte debido a que muchos o la mayoría cigóticos mutantes sobreviven hasta el final de embryogeneses y desarrollar barreras epidérmicas, incluso cuando los patrones de desarrollo va profundamente mal. Caracterización anterior de un factor de transcripción de cabeza Granulado bien conservada (GRH), identificaron que los genes Grh objetivo Dopa descarboxilasa (DDC) y la tirosina hidroxilasa (PLE) son transcripcionalmente activados alrededor de los sitios de lesión 4. Drosophila como organismo modelo para la respuesta de la herida proporciona una línea complementaria de la investigación para avanzar en los estudios de cicatrización de las heridas de mamíferos 5. Estudios posteriores han identificado genes adicionales herida inducida Drosophila y desarrolló una &quot;caja de herramientas&quot; de muchos periodistas de la herida fluorescentes para monitorizar la respuesta in vivo herida epidérmica a limpiar hiriendo a 6. Informes recientes sobre la regulación de la cicatrización de heridas Drosophila se han centrado en el fenotipo de cierre de la herida, lo que permite el descubrimiento de muchas vías que regulan la migración celular 7,8. Con el análisis de lalos reporteros de la herida fluorescentes, nuestros estudios han identificado un nuevo conjunto de genes necesarios para la expresión localizada de la epidermis genes inducible por lesión 9. Uno de los méritos del método reportera herida respuesta es que los resultados proporcionan una visión más clara en un mecanismo de cómo las señales son transducidas desde el lugar de la lesión a las células vecinas. Sin embargo, una de las desventajas del método reportera herida respuesta es que los resultados no se vinculan directamente a fenotipos en la curación o la reparación de heridas. Utilización más amplia del protocolo punción herida limpia en pantallas genéticas y químicas permitirá nuevos reguladores de la respuesta transcripcional a epidérmica hiriendo a identificarse y además la traducción de cicatrización de heridas descubrimientos en modelos de mamíferos de los tratamientos de lesiones.

<table><tbody><tr><td>levadura</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51475</td><td></td></tr><tr><td>jugo de manzana</td><td>Agar genérico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>50-824-297</td><td></td></tr><tr><td>lejía</td><td>Aceite de</td> halocarbono genérico<td></td><td></td></tr><tr><td>, 700 W</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>aceite de halocarbono, 27 W</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8773</td><td></td></tr><tr><td>1- fenoxi-2-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>484423</td><td></td></tr><tr><td>peróxido de hidrógeno</td><td>Fisher Scientific</td><td>H324</td><td></td></tr><tr><td>metil-&beta;-ciclodextrina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>azul de toluidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>formaldehído, 16%</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18814-20</td><td></td></tr><tr><td>heptano</td> químico tóxico <td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td>producto químico tóxico</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td>químico tóxico</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90013</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-255-956</td><td></td></tr><tr><td>libre de ARNasa H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2819-100</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila incubadora</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-197</td><td></td></tr><tr><td>jaula para moscas</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>tubo de recolección de embriones</td><td>Genessee Scientific</td><td>46-101</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-037</td><td></td></tr><tr><td>cinta adhesiva doble</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pincel</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aguja de disección</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-965A</td> objeto <td>punzante</td></tr><tr><td>cubreobjetos de vidrio</td><td>Thermo Scientific</td><td>3306</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos</td> punzantes <td>Thermo Scientific</td><td>4445</td><td>objeto punzante</td></tr><tr><td>microscopio de disección</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi-2000</td><td></td></tr><tr><td>aguja capilar</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>objeto</td></tr> <tr>punzante<td>tirador de agujas</td><td>Narishige</td><td>PC10</td><td></td></tr><tr><td>portaagujas de microinyección</td><td>Narishige</td><td>MINJ4</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MN151</td><td></td></tr><tr><td>microscopio invertido</td><td>Carl Zeiss</td><td>Primo-Vert</td><td></td></tr><tr><td>de vidrio Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747A cristal para</td><td>objetos punzantes</td></tr><tr><td>Pasteur</td><td>pipeta Fisher Scientific</td><td>22-063-172</td> bulbo de transferencia para <td>objetos punzantes</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>vial de centelleo</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7</td> agitador orbital para <td>objetos punzantes</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>14-259-260</td><td></td></tr><tr><td>tubo de 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>escaneo láser confocal</td> solución de fijación <td>Leica</td><td>SP2</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>(5 ml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% formaldehído</td><td>2,5 ml</td><td></td><td>químico tóxico</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>0,5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EGTA</td><td>0,5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Libre de ARNasa H2O</td><td>1,5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de aceite de halocarbono</td><td>(10 ml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceite de halocarbono, 700 W</td><td>5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceite de halocarbono, 27 W</td><td>5 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microinyección de heridas ensayo y<em&gt; in vivo</em&gt; localización de la herida epidérmica reporteros de respuesta en<em&gt; drosophila</em&gt; embriones.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

El embrión de Drosophila se desarrolla una capa epidérmica robusta que sirve tanto para proteger las células internas de un entorno externo duro, así como para mantener la homeostasis celular. Lesión de la punción con agujas de vidrio proporciona un método directo para desencadenar una respuesta rápida de la herida epidérmica que activa reporteros transcripcionales de la herida, que puede ser visualizado por una señal del informador localizada en embriones o larvas vivas. Punción o láser lesión también proporciona señales que promueven la contratación de hemocitos a la zona de la herida. Sorprendentemente, severa (a través de y a través de) la lesión de punción en embriones de etapa tardía sólo rara vez se interrumpe el desarrollo embrionario normal, como mayor que 90% de tales embriones heridos sobreviven a la edad adulta cuando los embriones se inyectan en un medio de aceite que minimiza la fuga inmediata de hemolinfa a partir de los sitios de punción . El procedimiento de la herida requiere la micromanipulación de embriones de Drosophila, incluyendo la alineación manual de los embriones en agplacas ar y la transferencia de los embriones alineados con microscopio. El ensayo de respuesta epidérmica herida de Drosophila proporciona un sistema rápido para poner a prueba los requisitos genéticos de una variedad de funciones biológicas que promueven la curación de heridas, así como una manera de detectar compuestos químicos potenciales que promueven la cicatrización de heridas. El corto ciclo de vida y la rutina de cultivo fácil hacer Drosophila un organismo modelo de gran alcance. Drosophila cicatrización de la herida limpia aparece para coordinar la respuesta regenerativa de la epidermis, con la respuesta inmune innata, en formas que todavía están bajo investigación, lo que proporciona un excelente sistema para encontrar conservada reglamentario mecanismos comunes para Drosophila y las heridas de la epidermis de los mamíferos.

Para obtener los resultados mostrados en este método, el marco de lectura abierto de la proteína fluorescente verde (GFP) se fusiona a un / secuencia potenciadora herida inducida por el promotor de dopa descarboxilasa (DDC) y DsRed se fusiona a una secuencia de promotor de la herida de la tirosina hidroxilasa ( plo) 4,6. En un embrión de Drosophila en vivo, la maduración de la proteína fluorescente reportero herida es óptima 4-6 horas después de la herida, lo que permite tiempo para la acumulación de proteína suficiente para visualizar, así como el tiempo para la proteína fluorescente para oxidar al estado fluorescente 15. Para observar la localización reportero, un microscopio de fluorescencia compuesto es suficiente. Para observar un mayor aumento de la localización reportero, un microscopio confocal es óptima para generar una proyección máxima de múltiples secciones ópticas (Figura 1). Confocal de imágenes in vivo de embriones de Drosophila se complica por el RAondulaciones pid del embrión. . Una vista completa del embrión se puede obtener con 20X objetivo y una vista de primer plano de emplazamiento de la herida se puede obtener con objetivo 40X. Una vista superior de la epidermis reportera herida de localización se pueden obtener imágenes con 10 secciones ópticas 1μm sucesivas. Una vista lateral de la epidermis reportera herida de localización se pueden obtener imágenes con 40 sucesivas 1 micras secciones ópticas. El uso de métodos de cruzamiento genético estándar, es posible combinar los reporteros de la herida con mutaciones genéticas. Un ejemplo se presenta en este documento es Flotillin-2 (Flo-2), ya que los mutantes de ganancia de función (sobreexpresión generada con expresión ubicua en todas las células) la pérdida de función (alelo nulo generada con la inserción del elemento P) y de FLO-2 demuestran el producto del gen Flo-2 es necesaria y suficiente para inhibir la localización de la DDC-GFP de heridas reporteros 9 (Figuras 2A y 2B). Uso de la millascroinjection protocolo, es posible probar si la introducción de soluciones químicas superactivates o inhibe la localización de los reporteros de la herida. Embriones Químicamente heridos-resultaron heridos y se inyecta con una proporción de 1:4 de toluidina al 1% de colorante azul y compuestos solubilizados simultáneamente. Azul de toluidina colorante permitido para la confirmación visual de compuestos solubilizados que se inyecta en la cavidad del cuerpo. Control de embriones fueron heridos con una aguja rota que contiene una relación 1:4 de toluidina al 1% de colorante azul y soluto sin química. Dos ejemplos presentados en este documento son el peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) y metil-β-ciclodextrina (MβCD), debido a que ambas soluciones químicas son suficientes para activar globalmente la localización de la DDC-GFP herida reporteros 9 (Figuras 2C y 2D) . El peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) se diluyó en H 2 O y 0,6 M. metil-β-ciclodextrina (MβCD) se solubilizó en 1 mM de NaOH a 3 mM. Utilizando el protocolo de fijación embrión, es posible detectar la activación de la transcripción de genes de respuesta de la herida en un dominio localizado, que rodea a un sitio de la herida. Un ejemplo que se presenta en este trabajo es la hibridación in situ de sondas de ARN para detectar Ddc y transcripciones ples 4,6,9 (Figuras 3A y 3B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. DDC-GFP y ple-DsRed hieren reportero localización. Campo claro y las imágenes fluorescentes en los embriones de tipo salvaje heridos. (A) con mejor vista del DDC-GFP reportero de heridas. (B) con mejor vista de ple-DsRed hieren reportero. Todas las imágenes se recogieron en un microscopio confocal Leica SP2, con 20X objetivo. Las flechas marcan el sitio de la herida. Las líneas discontinuas en el panel de datoss marcan los contornos de los embriones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. La localización de la reportera Ddc-GFP heridas en mutantes antecedentes genéticos y químicos microinyectado embriones. Claro y imágenes fluorescentes de heridos Flotillin-2 (Flo-2), los embriones mutantes. (A) Pérdida de la función de Flo-2 {} KG00210 mutantes, expansión de la actividad de reportero a través de todas las células epidérmicas. (B) Ganancia de la función de Flo-2 (armadillo-GAL4, UAS-Flo2) mutantes, la inhibición de la actividad del indicador a lo largo de todas las células de la epidermis. (C) El peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) microinyección solución, la expansión de reporter actividad a lo largo de todas las células epidérmicas. (D) metil-β-ciclodextrina (MβCD) microinyección solución, la expansión de la actividad del indicador a lo largo de todas las células epidérmicas. Todas las imágenes se recogieron en un microscopio confocal Leica SP2, con 20X objetivo. Las flechas marcan el sitio de la herida. Las líneas discontinuas en los paneles de datos marcan los contornos de los embriones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3. Detección de la respuesta de la herida transcripciones de ARN de genes. Imágenes fluorescentes de hibridación in situ y la detección de ARN en embriones de tipo salvaje heridos. DDC (A) y plo (B) las transcripciones de ARN se acumulan alrededor del sitio de la herida. Todas las imágenes fueron colecciónted en un microscopio confocal Leica SP2, con objetivo de 20X. Las flechas marcan el sitio de la herida. Las líneas discontinuas en los paneles de datos marcan los contornos de los embriones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Tabla 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> Tabla 1. Resumen de los reporteros de respuesta epidérmica herida. Inserciones de los cuatro periodistas de respuesta de la herida (DDC, ple, msn, KKV) están disponibles en la segunda y tercera cromosomas. Todos los periodistas de respuesta herida activar el gen fluorescente (GFP o DsRed) en un número limitado de células epidérmicas que rodean el lugar de la lesión de punción en la de tipo salvaje de fondo (por ejemplo, el fenotipo &quot;local&quot;). Ddc y msn herida reporteros de respuesta requieren Grh para la activación de la FLUORESCENgen ce después de la lesión de punción (por ejemplo, &quot;ninguno&quot; fenotipo). Todos los periodistas de heridas requieren Flo-2 para la localización del gen de fluorescencia después de la lesión de punción (por ejemplo, el fenotipo &quot;global&quot;). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> .

La epidermis de embriones de fase muy tardía embriones de Drosophila ofrece un sistema in vivo para el análisis de la respuesta herida de punción rápida y se pueden combinar con las manipulaciones genéticas o tratamientos químicos de microinyección para avanzar los estudios en la curación de heridas para la traducción en modelos de mamíferos.

Microinyección de Heridas Ensayo y<em&gt; In vivo</em&gt; Localización de la herida epidérmica Reporteros de respuesta en<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar in vivo un reportero de la respuesta a la herida epidermal en el embrión de drosófila. Esto se logra primero recolectando el estadio de desarrollo en el que la actividad del reportero puede detectarse de manera constante. El segundo paso del procedimiento consiste en perforar el embrión utilizando una aguja de vidrio y un aparato de microinyección.El tercer paso consiste en anestesiar el embrión para la visualización del reportero. El paso final es validar la localización del reportero mediante la detección del patrón de expresión de sondas de ARN. En última instancia, los resultados pueden mostrar la activación específica del reportero de la respuesta a heridas epidérmicas únicamente en las células que rodean el sitio de la lesión por punción mediante microscopía confocal.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes que implican observar el cierre de heridas es que podemos visualizar en embriones vivos la expresión génica inducida por heridas por punción. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reparación de tejidos, como la forma en que las células que rodean una lesión regulan una respuesta inmediata a la herida para promover la reparación. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de la regeneración de tejidos, ya que la regulación de la respuesta a la herida es el paso inicial.La cicatrización de heridas puede ensayarse en cualquier etapa de desarrollo. Sin embargo, a la etapa 17, la cutícula ya es demasiado madura. Los reporteros de heridas conocidos no se activarán.Para demostrarlo, se lesionarán embriones en estadios 15 a 16 para su recolección. Recolecte moscas adultas de dos a tres días de edad, 50 hembras y 25 machos. Trasférmelas a una jaula de recolección de embriones con una placa fresca de jugo de manzana, agar y una pequeña cantidad de pasta de levadura.Mantenga la jaula a 25 grados Celsius cada mañana durante los próximos tres días. Reemplace la placa por una nueva. Por la tarde del tercer día, permita que los huevos se acumulen en una placa fresca durante dos horas.Guarde esta placa durante 14 horas a 25 grados Celsius. Un reposo de dos horas debería producir aproximadamente 200 embriones al día siguiente. Añada unos pocos mililitros de agua a la placa y agítela suavemente.Luego, utilizando un pincel, transfiera el agua y los embriones desde la placa a un recipiente de recolección con una cesta de malla de nailon. A continuación, prepare un baño diluido de lejía y sumerja los embriones durante dos minutos. Este paso elimina las COR, los huevos.Agite suavemente el baño varias veces para evitar que los embriones se agrupen. Después de dos minutos, enjuague los embriones con agua corriente y enjuague el recipiente de Petri durante cinco segundos cada uno. Luego, transfiera la canastilla de embriones a una toalla de papel para secar los embriones.A continuación, utilizando una aguja de disección, transfiera aproximadamente 50 embriones desde la malla hasta una placa de agar elaborada con colorante alimentario verde. El colorante sirve para aumentar la visibilidad de los huevos de rodilla. Bajo un microscopio estereoscópico, forme dos hileras paralelas de embriones separadas aproximadamente cinco milímetros.Coloque las filas separadas por un ancho igual al de un embrión para permitir el intercambio de gases. A continuación, presione cuidadosamente una portaobjetos con cinta adhesiva doble cara sobre los embriones de modo que las filas queden perpendiculares a la longitud del portaobjetos. Para reducir su presión interna, deje que los embriones se sequen al aire.De este modo, no estallarán cuando se les provoque una herida. Después de 25 minutos, el primer portaobjetos preparado debe estar seco. Ahora, cubra los embriones con dos o tres gotas de aceite de halo carbono para evitar una mayor deshidratación y proceda inmediatamente a herir los embriones secos.Coloque la lámina con el embrión en la platina del microscopio de inyección. Localice los embriones en el campo de visión y practique el movimiento de la platina del microscopio invertido. Enfoque ahora el plano medio del embrión a lo largo del eje dorsal-ventral y coloque el embrión superior de la primera fila alineada en el campo de visión.A continuación, coloque y asegure cuidadosamente una aguja estirada en el portaagujas. Utilice el micromanipulador para mover la aguja hacia abajo, hasta el portaobjetos. Alinee la aguja con el embrión en el mismo plano focal.Ahora, no ajuste más el micromanipulador. A continuación, mueva la platina para atravesar el embrión por completo. Luego, pase al siguiente embrión en la fila.Después de lesionar la primera fila, mueva completamente la aguja hacia arriba y lejos del portaobjetos. Luego gire el portaobjetos y continúe perforando embriones en la segunda fila. Una vez que todos estén lesionados, los embriones pueden fijarse inmediatamente para hibridación in situ o tinción con anticuerpos.Para examinar los reporteros fluorescentes, espere de cuatro a seis horas y transfiera el embrión a uno nuevo sobre el portaobjetos nuevo; coloque cuentas de vidrio alrededor de los embriones. Luego agregue unas gotas de fenoxietanol al 50%, que es un anestésico, y coloque una cubreobjetos sobre los embriones para las microinyecciones. Cargue la aguja de inyección por la parte trasera con un microlitro de solución química más colorante, como peróxido de hidrógeno 0,6 molar.Deje que la acción capilar impulse la solución química hasta la punta de la aguja. A continuación, rompa la punta de la aguja contra el borde de un portaobjetos en una mezcla de aceite de carbono en halo. En primer lugar, enfoque la aguja montada con el borde del portaobjetos en ángulo a casi no 90 grados.A continuación, mueva suavemente el borde del cubreobjetos a lo largo de la punta de la aguja hasta que esta se rompa. Luego, aplique presión en el aparato de microinyección y verifique que la solución salga por la punta de la aguja. Si no fluye, rompa un poco más la aguja para abrirla.Ahora, realice el mismo procedimiento utilizado para puncionar solo los embriones. Esta vez, microinyecte la solución simultáneamente con la punción. Idealmente, inyecte 10 nanolitros.Si se inyecta demasiada solución en el embrión, la membrana de Vitale se romperá durante el procedimiento de fijación descrito en el protocolo escrito; preste mucha atención a los siguientes pasos. Utilice una pipeta de vidrio, no de plástico, para enjuagar el heptano sobre el portaobjetos y use vidrio para hacer girar los embriones hacia el centro de la placa de Petri de vidrio. Posteriormente, agite los embriones en el fijador durante 25 minutos a 220-230 rpm.Después de agitar, espere a que las burbujas en la interfase revienten antes de retirar completamente la fase acuosa inferior. Además, tenga cuidado de no extraer los embriones. Después de agregar el metanol, los embriones heridos deben agruparse más tarde en la interfase; esparza los embriones a lo largo de la superficie de la placa de esta manera y transfiéralos a una portaobjetos de vidrio con cinta adhesiva doble cara como se muestra.Luego, empuje cuidadosamente los embriones con la aguja de disección para romper la membrana vitelina y continúe con la deshidratación. Las moscas de tipo silvestre fueron transformadas con reporteros fluorescentes fusionados a los potenciadores de la DOPA descarboxilasa o de la tirosina hidroxilasa y sometidas al ensayo descrito. Bajo iluminación de campo claro, fue posible observar el sitio de la herida, mientras que bajo iluminación de fluorescencia, fue posible detectar la actividad del reportero de la herida DCD.El reportero de hidroxilasa de tirosina mostró un resultado similar. Ambas imágenes se obtuvieron en un microscopio confocal Leica SP dos con un objetivo de 20 x. El procedimiento se realizó en un flujo de pérdida de función con un mutante dos.Antecedentes, la actividad del reportero de DOPA descarboxilasa se expandió en todas las células epidérmicas en mutantes con ganancia de función generados mediante expresión ubicua en todas las células. Se observó inhibición del reportero en todas las células epidérmicas. A continuación, embriones fueron simultáneamente heridos e inyectados con un compuesto solubilizado y azul de udina, peróxido de hidrógeno y agua, lo que expandió la actividad del reportero de DOPA descarboxilasa en las células epidérmicas, al igual que una inyección de metil-β-ciclodextrina en hidróxido de sodio mediante hibridación dentro de U.La activación transcripcional de los genes de respuesta a la herida se ensayó mediante la descarboxilasa endógena de DOPA. Se observó que la expresión de ARN estaba localizada alrededor del sitio de la herida y, por supuesto, también se encontró que los transcritos de ARN de tirosina hidroxilasa se acumulaban en el sitio de la herida. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 60 minutos si se lleva a cabo correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante no dedicar demasiado tiempo a alinear los embriones y avanzar con los siguientes pasos del procedimiento.

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