Name: La identificación de mutaciones del ADN en Purificada hematopoyéticas células madre / progenitoras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprende a identificar mutaciones del ADN en células madre hematopoyéticas purificadas utilizando el modelo de ratón transgénico LacI. Este ensayo in vivo permite analizar la frecuencia y tipo de mutaciones espontáneas e inducidas por genotoxinas.

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Nos gustaría dar las gracias a David R. Rodríguez, MA para el diseño gráfico y la fotografía en este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por fondos del GCCRI, el NIH / NIA (5R21AG033339) y el programa de subsidios para el Centro de Cáncer (P30CA054174) a la instalación de UTHSCSA de Citometría de Flujo y el Fondo para UTHSCSA avanzada Nucleic Acids Core.

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Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

El ensayo in vivo de mutagénesis in descrito en el presente documento se basa en el modelo de ratón transgénico LacI originalmente generada por Kohler et al. 18 Este modelo utiliza un vector de fago λ que lleva un gen reportero lacI. Los dos sitios cos que flanquean el vector permite una recuperación relativamente simple y envasado posterior en partículas de fago infecciosas, utilizados para infectar E. coli. Una placa azul será generado por el fa...

En la mayoría de los tejidos, las células diferenciadas tienen una vida útil limitada. Para mantener la integridad funcional,, las células madre específicas de tejido y de larga duración producen continuamente células progenitoras que a su vez dan lugar a las células completamente diferenciadas necesarios para la función de ese tejido particular. Las células madre también reponer su propio compartimento a través de un proceso llamado auto-renovación. Por lo tanto, las células madre son responsables de mantener la integridad funcional del tejido que residen pulg Por lo tanto, es imperativo que están equipadas con mecanismos robustos para detectar y potencialmente reparar el ADN dañado. Si no, se pueden adquirir múltiples perturbaciones genómicos (potencialmente nocivos), que pueden ser heredadas por sus descendientes. La comprensión de cómo las células madre salvaguardar su genoma durante el período de vida de un organismo es una pregunta importante y puede ayudar a entender por qué la inestabilidad genómica está vinculado con el cáncer y otras enfermedades relacionadas con la edad (revisado en 1,2). <p clculo = &quot;jove_content&quot;&gt; El control de la integridad genómica de un tejido en el nivel de células madre o poblaciones de células progenitoras tempranas se puede lograr ya sea por la eliminación de vástago defectuosa (o progenitor) células a través de la muerte celular, la senescencia o la diferenciación, y / o por la reparación eficiente ADN de dañado. Estudios recientes han demostrado que es posible medir ciertos tipos de reparación del ADN directamente en estas poblaciones raras 3-6. Se encontró que, por ejemplo, en el sistema hematopoyético, roturas de doble cadena de ADN se pueden reparar mediante recombinación homóloga (HR) o de extremos no homólogos (NHEJ), siendo este último un proceso de reparación de baja fidelidad y por lo tanto un mayor riesgo de hacer errores. Ambos están siendo utilizados en las células madre hematopoyéticas (HSC) de 4,5, sin embargo, en ratones parece que es predominantemente de NHEJ en HSCs mientras que las células progenitoras tempranas utilizan HR 4. Una observación similar se hizo para las células madre de la piel 6. Curiosamente, en las CMH humano HR, no NHEJ,parece ser el mecanismo de reparación de la opción para la línea se rompe dobles 3. Si esta diferencia funcional entre las dos especies es real o simplemente representa una diferencia tecnológico o experimental aún está por verse. Un repertorio de células madre para reparar el ADN dañado es probable que incluya otros mecanismos de reparación del ADN, como la reparación por escisión de base (BER), la reparación por escisión de nucleótidos (NER) y desajuste de reparación (MMR). BER y NER son responsables de la reparación de lesiones únicas o múltiples de pares de bases en el ADN de una sola hebra, mientras que los desajustes correcciones MMR de base-base y los bucles de inserción / deleción; este tipo de daños en el ADN no pueden ser reparados por NHEJ o HR. En apoyo de esta noción son varios estudios del sistema hematopoyético que demuestra una relación entre las alteraciones en una de estas vías y anormalidades en el compartimiento HSC 7-9, así como un mayor riesgo de desarrollar el síndrome mielodisplásico 10-16, una enfermedad que se origina en laHSC y que se asocia con el aumento de la inestabilidad genómica conforme avanza la enfermedad 17. Hasta el momento, no se han reportado mediciones de BER, TNE y MMR directamente en las CMH. Además de la aclaración de los diversos procesos que controlan la integridad del tejido a un nivel mecanicista, es imperativo que ser capaz de medir la extensión de ADN mutado, de modo que las consecuencias de las aberraciones en uno de estos procesos se pueden probar, por ejemplo, en normal frente genéticamente células madre genéticamente o en viejo y joven. Sin embargo, el desarrollo de un ensayo relevante es difícil debido a la escasez de células madre específicas de tejido y la falta de condiciones de cultivo que conserva &quot;stemness&quot;. Además, un ensayo de este tipo debe ser modificable a las manipulaciones ambientales y genéticos. Una posible solución a estas limitaciones y requisitos es el uso de modelos de ratón que se han diseñado específicamente para detectar mutaciones en el ADN. MulSe han desarrollado modelos de ratones transgénicos ples para la detección de mutaciones. Por ejemplo, LacI ratones transgénicos 18 llevar un vector de fago λ recuperable que codifica el sistema reportero de LacI, en el que el gen LacI codifica un supresor del operador lac y sirve como reportero de la mutación. Tras la mutación del gen LacI, el operador lac se activa y se produce β-galactosidasa. escinde β-galactosidasa del sustrato cromogénico X-gal (5-bromo-4-cloro-E-indolil-β-D-galactopiranósido), lo que la convierte azul. Los sitios cos que flanquean el vector LacI permite una fácil recuperación de proteínas del fago lambda y la posterior infección de E. coli. Después de la incubación de E. infectada coli en agarosa que contiene el sustrato X-gal, las placas se puede puntuar. Las placas azules contienen un mutante putativo fago Lac-Me realización, mientras que las placas claras albergan los no mutantes. La frecuencia de placas azules (entre ªe las claras) indica la frecuencia de mutantes en la población original de células se extrajo el ADN de. Por otra parte, el fago λ que aloja el objetivo LacI se puede secuenciar fácilmente usando técnicas de PCR para el análisis de relativamente alto rendimiento. La secuenciación de múltiples genes mutantes LacI revelará información importante sobre el espectro de mutaciones, que a su vez puede señalar posibles deficiencias en las vías específicas de reparación del ADN o para eventos genotóxicos específicos. El sistema transgénico LacI se ha estandarizado a través de múltiples laboratorios 19 y los reactivos están disponibles comercialmente. Una desventaja importante del sistema de LacI es la capacidad limitada para detectar grandes deleciones o reordenamientos, por lo tanto, otros métodos, por ejemplo, peces de múltiples colores en metafase para untar necesitan ser utilizado para complementar esta deficiencia. Dentro del vector de fago λ del modelo de ratón LacI, hay un gen mucho más pequeño, CII, Disponible para el análisis de mutaciones. Su tamaño y el hecho de que los mutantes se pueden seleccionar hacen de este un ensayo de mano de obra intensiva y más barato menos 20 que el análisis del gen LacI. Sin embargo, el gen LacI se estudia más ampliamente para la mutagénesis 21 y la sensibilidad del gen de mutaciones ha sido bien caracterizado de modo que haya una clara comprensión de los residuos de aminoácidos que generan una respuesta fenotípica en un sustrato cromogénico 22-25. Otros modelos de ratón para la detección de mutaciones incluyen el uso de la ΦX174 o los transgenes LacZ. El modelo de ratón transgénico ΦX174, con el original: T → G: mutación de reversión C de ensayo 26 o el ensayo de mutación hacia adelante 27 que permite la detección de un espectro de sustituciones de pares de bases, representa un sistema menos costoso que el modelo de LacI. Sin embargo, la pantalla de mutaciones en el ensayo directo no es trivial, y la especificación de la mutaciónTRUM del transgén ΦX174 no está tan bien caracteriza-como la de la LacI. En modelos de ratones que llevan transgenes LacZ, el reportero LacZ mutacional se recupera utilizando E. células huésped de E. coli que son sensibles a la galactosa y medio que contiene galactosa 28. Un inconveniente de este sistema es que la recuperación de la diana LacZ también implica digestión con endonucleasas de restricción seguido por ligamiento y la electroporación de E. coli acoge, lo que dificulta la adaptación del sistema para un pequeño número de células. Aunque no es un requisito absoluto para el trabajo con poblaciones de células madre / progenitoras (siempre se puede empezar con más ratones), si se requieren grandes cantidades de células (por ejemplo, millones o más) se convertirá rápidamente poco práctico y un costo prohibitivo. Además, el tamaño relativamente grande de LacZ, mientras que proporciona un reportero mutacional sensible, es engorroso y más costoso para el análisis de secuencia de ADN y determminación de los espectros de mutación. Una ventaja importante de este modelo sin embargo, es su capacidad para detectar grandes deleciones e inserciones, así como reordenamientos cromosómicos. Dado que todas las células en los modelos de ratones transgénicos LacI, LacZ ΦX174 y llevan el sistema reportero, cualquiera de estos modelos de ratón se puede utilizar para medir la mutagénesis en cualquier tipo de célula de interés, incluyendo las células madre y progenitoras, mientras que puedan ser cosechadas de forma fiable y en número suficiente. Porque tuvimos una gran experiencia con el modelo de ratón LacI y el ensayo de mutación LacI, hemos decidido llevar a cabo este sistema aún más para el análisis de mutagénesis en madre hematopoyéticas y las poblaciones progenitoras. El tejido hematopoyético es bien caracterizado en términos de fenotipo de la superficie celular de sus componentes individuales, incluyendo las células madre de repoblación a largo plazo, que son identificables como la población extremadamente rara de Lin - IL7R <sup&gt; - Sca-1 + cKit + + (TSI) / Flk2 - CD150 + CD48 - células 29. . Mohrin et al 4 demostraron que la población ligeramente más grande de LSK/Flk2 - células son todavía buenos representantes de las HSC y significativamente diferente de las más primitivas progenitoras mieloides comprometidos población (CMP) cuando se trata de estudiar la reparación del ADN. Por otra parte, cuando el TSI enriquecido-HSC (Flk-2 + y Flk-2 -) las células se compararon con los Lin - IL7R - Sca-1-cKit + + (células progenitoras LS-K), todavía había una diferencia significativa en NHEJ capacidad 5 entre el menos puro, tallo población TSI enriquecida con células y las células progenitoras. En nuestro estudio utilizamos HSC enriquecido LSK (Flk-2 Flk-2 + y -) de las células, ya que encontramos que se requieren al menos 2 x 10 5 células para obtener resultados consistentes y confiables en este ensayo de mutagénesis, lo que el número de células es extremadamente difícilobtener cuando uno ordena la LSK/Flk2 - población CD150 + CD48 o incluso el LSK/Flk2 - población (en términos de los ratones, los costos y practicidad). Este protocolo, basada en la que originalmente desarrollada por Kohler et al. 18 describe en detalle cómo la frecuencia de mutantes de ADN espontánea puede ser determinada en células LSK y poblaciones de células mieloides diferenciadas, así como células de la médula ósea y del bazo no separada definida.

<table><tbody><tr><td>LacI ratones transgénicos&nbsp;</td>Kit de aislamiento de ADN RecoverEase de <td>BioReliance Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, que incluye el cóctel de ribonucleasa RNace-It</td> de <td>Agilent Technologies (Stratagene)</td><td>720202</td><td></td></tr><tr><td>el extracto de empaque Transpack, incluidos los tubos transpack naranjas y azules y el SCS-8 E. coli</td><td>Agilent Technologies (Stratagene)</td><td>200221</td><td></td></tr><tr><td>Estándares de tamaño de ADN &ndash; escalera lambda</td><td>Bio Rad</td><td>170-3635</td><td></td></tr><tr><td>Membranas de tamaño de poro de 0,025 mM&nbsp;</td><td>Fisher (Millipore)</td><td>VSWP 025 00</td><td></td></tr><tr><td>245 mm2 Placas de bioensayo (bandejas)&nbsp;</td><td>Fisher (Corning)</td><td>07-200-600</td><td></td></tr><tr><td>Caldo NZY (polvo)</td><td>Fisher (Teknova)</td><td>N1144</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Fisher</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformamida</td><td>Fisher</td><td>AC34843-5000</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Research Products Intl Corp (RPI)</td><td>B71800-10.0</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Roche</td><td>3-115-852</td><td></td></tr><tr><td>Extensor de PCR Taq Kit de polimerasa</td><td>5 PRIME</td><td>2200500</td><td></td></tr><tr><td>Kit de limpieza Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman/Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr></tbody></table>

la identificación de mutaciones del adn en purificada hematopoyéticas células madre / progenitoras

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

En los últimos años, se ha hecho evidente que la inestabilidad genómica está estrechamente relacionada con muchos trastornos del desarrollo, cáncer y envejecimiento. Dado que las células madre son responsables de asegurar la homeostasis del tejido y la reparación durante toda la vida, es razonable plantear la hipótesis de que la población de células madre es crítico para la preservación de la integridad genómica de tejidos. Por lo tanto, un interés significativo se ha producido en la evaluación del impacto de los factores endógenos y ambientales sobre la integridad genómica en las células madre y su progenie, con el objetivo de comprender la etiología de las enfermedades basados ​​en células madre. Ratones transgénicos LacI llevan un vector de fago λ recuperable que codifica el sistema reportero de LacI, en el que el gen LacI sirve como reportero de la mutación. El resultado de un gen mutado LacI es la producción de β-galactosidasa que escinde un sustrato cromogénico, convirtiéndose azul. El sistema indicador LacI es i llevado an todas las células, incluyendo las células madre / progenitoras y pueden ser fácilmente recuperados y utilizados para infectar posteriormente E. coli. Después de la incubación de E. infectada coli en agarosa que contiene el sustrato correcto, las placas se puede marcar; placas azules indican un gen mutante LacI, mientras que las placas claras puerto de tipo salvaje. La frecuencia de azul (entre claras) placas indica la frecuencia de mutantes en la población original de células se extrajo el ADN de. La secuenciación del gen mutante LacI mostrará la ubicación de las mutaciones en el gen y el tipo de mutación. El modelo de ratón transgénico LacI es bien conocido por ser un ensayo in vivo de mutagénesis in. Por otra parte, los ratones y los reactivos para el ensayo están disponibles comercialmente. A continuación se describe en detalle la forma en este modelo puede ser adaptado para medir la frecuencia de mutantes de ADN que ocurre de forma espontánea en el tallo enriquecida con células Lin - IL7R - Sca-1 + cKit + + (LSCélulas K) y otras subpoblaciones del sistema hematopoyético.

<html> El ensayo in vivo de la mutagénesis in mide un evento raro (UFP mutante) entre muchos eventos (todo UFP). Al realizar el ensayo con pequeño número de células, es posible que el resultado está influido considerablemente por los resultados falsos positivos y falsos negativos. Para solucionar este problema se realiza un experimento de dilución en serie con las células de la médula ósea no fraccionadas, cosechado de tres animales diferentes. Se midió la frecuencia de mutantes en la médula ósea de est...

Aquí se describe un ensayo in vivo mutagénesis por un pequeño número de células hematopoyéticas purificadas utilizando el modelo de ratón transgénico LacI. El gen LacI puede ser aislado para determinar la frecuencia, la ubicación y tipo de mutantes de ADN espontáneamente surgido o después de la exposición a genotoxinas.

La identificación de mutaciones del ADN en Purificada hematopoyéticas células madre / progenitoras

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

identifying-dna-mutations-purified-hematopoietic-stemprogenitor

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La formación de colonias de células (CFC) de ensayo es un ensayo in vitro en progenitores hematopoyéticos que forman colonias en un medio semi-sólido. Una combinación de la morfología de la colonia, la morfología celular y citometría de flujo se utilizan para evaluar la capacidad de los progenitores para proliferar y diferenciarse a lo largo de los diferentes linajes hematopoyéticos.

La formación de colonias de células (CFC) para el ensayo de células hematopoyéticas humanas

Un método para analizar la distribución de progenitores hematopoyéticos de médula ósea en citometría de flujo, así como para aislar eficazmente altamente purificadas células madre hematopoyéticas (HSC) se describe. El procedimiento de aislamiento se basa esencialmente en el enriquecimiento magnética de c-kit + células y células de clasificación para purificar las CMH para los estudios celulares y moleculares.

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

Este protocolo proporciona pautas paso a paso para establecer experimentos competitivos de trasplante de médula ósea de ratón para estudiar la función de las células madre/progenitoras hematopoyéticas sin purificación previa de las células madre mediante clasificación de células.

Los trasplantes competitivos para Evaluar la aptitud de Células Madre Hematopoyéticas

Cuantificación de células procedentes de donantes es necesaria para supervisar el engraftment después del trasplante de células madre en pacientes con hemoglobinopatías. Una combinación de la clasificación de celda basados en citometría de flujo, análisis de formación de Colonia y posterior análisis de corto tándem repeticiones pueden utilizarse para evaluar la proliferación y diferenciación de progenitores en el compartimiento eritroide.

Detección de células progenitoras eritroides de donantes Residual después del trasplante de células madre hematopoyéticas para los pacientes con hemoglobinopatías

Demostramos cómo identificar y aislar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de médula murine usando una combinación de magnético y fluorescencia clasificación (MACS y FACS). Este protocolo puede ser utilizado para RNA/proteína análisis, experimentos de transferencia adoptiva en vivo y en vitro ensayos de cultura (culturas de la pastilla o líquido).

Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

Describimos el uso de trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) para evaluar el potencial maligno de las células hematopoyéticas genéticamente. TCMH es útil para evaluar varias células hematopoyéticas malignas en vivo así como generar una cohorte grande de ratones con síndromes mielodisplásicos (MDS) o leucemia para evaluar nuevas terapias.

Uso de trasplante de células madre hematopoyéticas para evaluar el origen del síndrome mielodisplásico

Los patrones de mutación somática en las células reflejan la exposición mutagénica anterior y pueden revelar relaciones de linaje del desarrollo. Aquí se presenta una metodología para catalogar y analizar mutaciones somáticas en células madre hematopoyéticas individuales y células progenitoras.

Caracterización de la carga mutacional y la composición clonal de la sangre humana

El presente protocolo describe un procedimiento optimizado de cultivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para el injerto robusto de células editadas genéticamente in vivo.

Edición génica CRISPR/Cas9 de células madre y progenitoras hematopoyéticas para aplicaciones de terapia génica

Se necesitan nuevas estrategias para modelar fielmente las mutaciones somáticas en células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para estudiar mejor la biología de las células madre hematopoyéticas y las neoplasias hematológicas. Aquí, se describe un protocolo para modelar mutaciones heterocigotas de ganancia de función en HSPC combinando el uso de CRISPR / Cas9 y la transducción dual de donantes rAAV.

Ingeniería de mutaciones de ganancia de función heterocigotas oncogénicas en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas

Aquí se presenta una técnica basada en citometría de flujo que permite medir simultáneamente el número de divisiones celulares, el fenotipo celular superficial y el parentesco celular. Esas propiedades se pueden probar estadísticamente utilizando un marco basado en permutaciones.

Evaluación simultánea del parentesco, el número de división y el fenotipo mediante citometría de flujo para células madre y progenitoras hematopoyéticas

Aquí, presentamos un protocolo que integra la tecnología CRISPR/Cas9 con el ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8) para identificar genes candidatos que son cruciales para la capacidad proliferativa anormal de las células madre y progenitoras hematopoyéticas.

Evaluación de genes anormales relacionados con el crecimiento de células madre y progenitoras hematopoyéticas mediante la combinación de la tecnología CRISPR/Cas9 con el recuento de células

Aprende a identificar mutaciones del ADN en células madre hematopoyéticas purificadas utilizando el modelo de ratón transgénico LacI. Este ensayo in vivo permite analizar la frecuencia y tipo de mutaciones espontáneas e inducidas por genotoxinas.

La identificación de mutaciones del ADN en Purificada hematopoyéticas células madre / progenitoras

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