Name: Perfiles de los Contenidos triacilglicérido en Bat Tegumentario lípidos por cromatografía preparativa en capa fina y MALDI-TOF espectrometría de masas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprende a aislar e identificar triglicéridos en secreciones sebáceas de murciélagos mediante cromatografía en capa fina preparativa y espectrometría de masas MALDI-TOF. Este método permite analizar perfiles lipídicos que funcionan como señales químicas en interacciones biológicas.

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Asistencia fue proporcionada por Scott Treece, Katelyn Arter, Jeremy Ragsdell Tony Lamark James, Amy Fischer, Hannah Blair, y Cheyenne Gerdes durante el desarrollo de los métodos de laboratorio. Nos gustaría dar las gracias al Laboratorio de Medina-Bolívar (Luis H. Ñopo-Olazábal; Arkansas Biosciences Institute) para obtener ayuda con TLC escaneo de densitometría. MALDI-TOF MS utilizado para este proyecto fue proporcionado por la NSF EPSCoR, RII: Iniciativa ASSET Arkansas P3 Center (EPS-0701890) en el Instituto de Biociencias de Arkansas. El financiamiento fue proporcionado por una de Pesca y Vida Silvestre del Servicio / Arkansas State Vida Silvestre Grant, la Sociedad Nacional de Espeleología, y The Center for American Bat Investigación Norte y Conservación de la Universidad Estatal de Indiana.

PRECAUCIÓN: Obtenga por adelantado todos los permisos estatales y federales necesarios para el manejo, transporte y almacenamiento de los murciélagos. Las homologaciones también se deben obtener de su cuidado y uso de animales comité institucional, así como de su comité de bioseguridad institucional. Si los murciélagos vivos (o tejido del sistema nervioso) se deben manejar, cuidadores de animales deben ser vacunados contra la rabia. Murciélagos utilizados en el presente estudio se obtuvieron de la Selva Nacional Ozark San Francisco, CA, durante el verano de 2010 de acuerdo con los métodos estándar (de la Universidad Estatal de Arkansas Comité Institucional de Bioseguridad aprobación # 135349-1) 28. 1. Tejido Tratamiento y lípidos extracción <ol><li> Limpie todos los equipos con metanol antes y entre la recogida de tejidos de diferentes individuos. Recorte el pelo (aproximadamente 1,0 g) de la piel con unas tijeras y colocar en un matraz Erlenmeyer de 125 ml. Sebo muestra de la superficie del ala por la depuración de la piel con 4-6 bolas de algodón empapado de cloroformo,: Disolvente de metanol (C: M; 03:02 v / v), y colocarlos en un matraz separado. </li><li> Extracto de tejido con 10 ml de C: M (02:01 v / v) que contiene 0,5% de hidroxitolueno butilado (BHT) para evitar la oxidación 29. Utilice únicamente disolventes de calidad HPLC. </li><li> Después de 2 horas, añadir aproximadamente 0,5 g de sulfato anhidro a cada matraz, mezclar brevemente, y recoger el disolvente por filtración a través de papel de filtro. </li><li> Repita los pasos 1,2 y 1,3 veces. Una vez con 1:1 C: M y secuencialmente con 01:02 C: M. Piscina filtrados juntos. </li><li> Se evaporan los filtrados combinados bajo una corriente de N 2, determinar el peso seco, y disolver el residuo de lípidos en 03:02 C: M (con 0,5% de BHT) a una concentración de 10 mg / ml. No conserve la muestra en viales de vidrio a -20 ° C. En general, es mejor analizar las muestras dentro de un mes después de la toma de la muestra y para reducir al mínimo los ciclos de congelación-descongelación. </li></ol> 2. Lípido La separación por cromatografía preparativa en capa fina <ol><li> Preparar con antelación solvente lavada 1,5 ml microcentrifuge tubos de llenado con 03:02 C: M, enjuagando con acetona, y secado al aire. Esto se hace para eliminar los plastificantes que pueden interferir con el análisis de espectrometría de masas más tarde. Almacene los tubos de muestra en un recipiente libre de polvo y manejar estos tubos sólo con guantes para evitar la contaminación de los aceites de la piel. </li><li> Active la placa de TLC por primera pre-desarrollo con 03:02 C: M. Añadir suficiente disolvente a la cámara de TLC a una profundidad de 1 cm, a continuación, colocar la placa en la cámara (cerca con tapa de vidrio) y dejar que el disolvente para ejecutar completamente a la parte superior de la placa. Esto tarda unos 45 min. </li><li> Retire la placa y secar en una campana de extracción hasta que se evapora el disolvente (aproximadamente 15 minutos), y echarlo en un horno durante al menos 10 minutos a 120 ° C. Coloque una marca de lápiz en la parte superior de la placa para mantener la orientación cuando se aplican las muestras. Coloque una línea de lápiz recto, 1,5 cm del borde inferior de la placa, para marcar la línea de base donde se colocarán la muestra y los estándares. </li><li> Prepare la cámara TLC cortando unapedazo de papel de filtro lo suficientemente grande como para alinear las dos paredes cortas y una larga pared. Coloque el forro de papel de filtro en la cámara. Será totalmente mojado cuando se añade disolvente a la cámara. </li><li> Preparar 100 ml de la fase móvil disolvente, que es hexano: éter dietílico: ácido acético (H: E: Un; 80:20:2 v / v / v). Vierta disolvente en la cámara para dar una profundidad de aproximadamente 1 cm. Cubrir con la tapa de vidrio, con un sello de grasa de silicona a lo largo del borde superior de la cámara. Dejar que la cámara de equilibrar durante la noche antes de su uso. </li><li> Aplicar la muestra manualmente a la placa preparada con un tubo capilar o una pipeta como una raya continua de aproximadamente 1,5 cm desde un borde hasta 1,5 cm hasta el otro borde. Se prefiere un aplicador automático de muestras, ya que se carga la muestra en una racha más homogénea. Utilice los carriles exteriores de la placa de TLC de detectar cerca de 20 l de mezcla de esteroles, ácidos grasos libres, las etiquetas y las normas de éster de esterol (uso de 10 mg / ml; mezclas prefabricadas se pueden obtener). </li><li> Coloque la placa de TLC cargado enla cámara de equilibrado, cerrar con la tapa, y desarrollar la placa hasta que el disolvente se dirige hacia el borde superior. Esto toma alrededor de 45 minutos con la fase móvil se describe aquí. Retire la placa de la cámara y deje que el exceso de disolvente se evapore de la placa en una campana de humos durante aproximadamente 1 min. </li><li> Rocíe con un 0,05% rodamina 6G en etanol al 95%. Visualice bandas de lípidos bajo una lámpara ultravioleta de longitud de onda larga. Marque con un lápiz la posición f R para las bandas fluorescentes resueltas en la muestra y los estándares. Un registro fotográfico se puede tomar en este punto. </li><li> Identificar la banda correspondiente a la norma TAG y sacarlo de la placa raspando la sílice con una espátula en una hoja grande de papel cristal sopesar papel. Transferencia de sílice a un tubo de microcentrífuga-disolvente se lavó 1,5 ml. </li><li> Añadir 1,0 ml de 03:02 C: M disolvente para el tubo de muestra, se somete a ultrasonidos durante 1 min, Pellet la sílice por centrifugación, y luego transferir el disolvente a un tubo nuevo previamente pesado. Repita ªe paso anterior, mancomunar los filtrados, y se evapora el disolvente bajo una corriente de N2. </li><li> Guarde el residuo seco que contiene TAGs bajo N 2 en la oscuridad a 4 ° C, mientras que las muestras de tejido adicionales están separados por TLC. Rodamina 6G está presente en las muestras, pero es insoluble en hexano y se retira durante la disolución de la muestra inmediatamente antes del análisis de MS. </li></ol> 3. Análisis TAG por MALDI-TOF MS <ol><li> Preparar una solución de matriz fresco α-ciano---hidroxi cinámico ácido 4 (CHCA) mediante la disolución de 10 mg de CHCA en 1 ml de disolvente (etanol 49,5%, 49,5% de acetonitrilo, y 1% acuosa 0,1% de TFA). </li><li> Preparar la hormona adrenocarticotropic (ACTH; 18-39 clip, 2465,1989 Da) para la resolución del instrumento y las pruebas de sensibilidad mediante la mezcla de 1 l de ACTH (1 mg / ml) con 39,5 l de ácido trifluoroacético 0,1% (TFA) para obtener un 10 pmol / l solución madre. Esto puede ser almacenado a -20 ° C para su uso futuro. </li><li> Prepare una fresca solut ACTH trabajode iones (1 pmol / l) mediante la adopción de 1 l de la solución de stock 10 pmol / l, se mezcla con 9 l 0,1% de TFA, y luego la mezcla (01:01) con 10 l de la solución matriz de CHCA para obtener un fmol 500 / concentración l. </li><li> Preparar normas de etiqueta en 10 mg / ml en 03:02 C: M para la calibración de instrumentos MALDI (por ejemplo tricaprina [470.361 Da], tricaprilina [554.455 Da], trilaurina [638.549 Da], tripalmitina [722.642 Da], tripalmitoleína [800.689 Da] , trimiristina [806.736 Da], trioleína [884.783 Da], tri-11-eicosenoin [968.877 Da] y trierucin [1052.971 Da]). </li><li> Preparar trioleina a 10 mg / ml en 03:02 C: M para una norma TAG calibración bloqueo masivo externo. </li><li> Disolver las muestras de las marcas almacenados en hexano a una solución de 10 mg / ml. </li><li> Prepare un 0,5 M (77,06 mg/1.0 ml) solución madre de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) con 90% de metanol para su uso como muestra y matriz estándar. También hay que preparar una solución 1,0 M (2,0 g/50.0 ml) de NaOH. Cubra el tubo con solución DHB usando foi aluminio<html> l para protegerlo de la luz. </li><li> Mezcla (en tubos de pre-lavado) 10,0 l de matriz DHB, 10,0 l de muestra o patrón, y 5,0 l 1,0 M de NaOH. Mezclar y centrifugar brevemente el tubo para llevar la mezcla a la parte inferior. </li><li> Punto 1.0 l de estándar, muestras, o ACTH en una placa de MALDI objetivo de acero inoxidable y el lugar en un desecador hasta que se seque. Coloque la placa del objetivo en el instrumento para la adquisición de datos. </li><li> Realice MALDI-TOF MS análisis en modo reflectrón positivo. Tune y calibrar el instrumento como se describe por el fabricante del instrumento utilizando la ACTH y soluciones estándar TAG. </li><li> Adquirir espectros para cada muestra en la placa, blanco (compatible con las especificaciones del instrumento; parámetros para este trabajo fueron 5 tasa de disparos láser Hz, ~ 100 disparos por lugar de obtener un espectro promedio). Después de alisar y restando el fondo de los espectros MALDI, picos de iones proceso de forma manual con el motor de búsqueda en línea LIPID MAPAS (/ Tools / ms / glycerolipids_batch &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.lipidmaps.org / tools / ms / glycerolipids_batch). </li><li> Copie y pegue la lista de espectros en la lista de los iones precursores y caja de intensidad. Limitar la búsqueda a la composición acilo deseado. Identificar etiquetas de la masa / carga (m / z) relaciones de iones presentes en el espectro para cada muestra. Si éster metílico de ácido graso (FAME) porcentajes están disponibles a partir de análisis de GC / MS separado, añadir estos datos para obtener las probabilidades de los TG presentes. </li></ol> INSTRUMENTO: El espectrómetro de masas utilizado en este estudio es un Waters MALDI Micro MX (equipado con una nm 20 Hz N 2 láser 337). Instrumento MALDI de cualquier fabricante con capacidad de modo reflectrón positiva se puede utilizar. Ajustes generales utilizados son tensión de impulso, 2000 V; reflectrón, 5200 V, fuente, 15.000 V, con la adquisición de datos utilizando el software MassLynx (ver. 4.0). Estas condiciones de funcionamiento proporcionan una resolución de masa superior a 12.000.

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<li>Fuchs, B., Süß, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-+A+review+of+the+current+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Lipid analysis by thin-layer chromatography- A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

En este trabajo se presenta un método simple y robusto para separar grandes clases de lípidos aislados de tegumento de los mamíferos por TLC preparativa y la determinación de los perfiles de TAG por MALDI-TOF MS, sin derivatización mucho tiempo de las moléculas de lípidos. Los pasos críticos en la producción de los espectros de la calidad de TG con MALDI-TOF MS incluyen: 1) la extracción con éxito del compuesto con un mínimo de contaminación u oxidación; 2) la separación suficiente y el aislamiento por cromatografía, y 3) de alta resolución y precisión de masa MALDI-TOF MS. En este trabajo se muestra el método de extracción y separación de la fracción de lípidos neutros desde el plagiopatagium del murciélago rojo del Este para obtener TAG perfiles. Aunque el presente estudio se utilizó una especie de murciélagos (Mammalia: Chiroptera), estos métodos pueden extenderse para estudiar los lípidos tegumentarios de cualquier especie de mamífero. Tegumento Bat se caracteriza por ser predominantemente colesterol, con menores cantidades de TAGs, AGL, squalene y ésteres de esterol / cera. Proporciones de lípidos de sebo en los murciélagos difieren de los seres humanos en que el escualeno está presente en bajas cantidades (en oposición a un máximo de 16% en los seres humanos), mientras que el colesterol se produce en proporciones más grandes (1 - 7% en los seres humanos, pero 26-62% en los murciélagos) 22 , 31. Pelos humanos contienen aproximadamente el 3% TAGs, mientras que proporciones de hasta 28% se encuentran en murciélago rojo oriental pelo. La extracción de muestras de lípidos de los murciélagos es similar para otras especies. Mientras que en este estudio bolas de algodón empapadas en disolvente se usan para eliminar el sebo, también se puede invertir un tubo o vial de muestra que contiene disolvente sobre la superficie del tegumento múltiples veces. Productos de cinta especializadas también ofrecen medios alternativos para extraer lípidos de la superficie 32. Una parte crítica de una extracción de lípidos adecuada es para minimizar la contaminación de aceites de la piel. Esto se logra fácilmente, manteniendo un frasco con metanol y rociar toda la cristalería y utensilios de cocina, limpiando los utensilios con un tejido entre todas las muestras y el uso de guantes de examen. La oxidación oacilos poliinsaturados f se previene a través de la adición de BHT, y deben ser utilizados con independencia de la temperatura de las muestras se almacenan en. Análisis de Biomoléculas lo general requiere un paso cromatográfico para separar las moléculas de interés de los contaminantes. TLC se utiliza en este método, lo que evita los requisitos de instrumentación para gases o cromatografía líquida y requiere menos experiencia técnica para lograr resultados robustos y repetibles. Dependiendo de la clase de lípidos de interés, muchos diferentes fases móviles se pueden incorporar. Además, el uso de placas de HPTLC y densitometría de barrido se puede usar para lograr resultados cuantitativos. Mientras que las variaciones de los métodos de TLC son demasiado numerosas para enumerarlas aquí, algunas fases móviles comunes utilizados en lípidos TLC incluyen cloroformo: metanol: agua para la separación de fosfolípidos y glicolípidos o isooctano: éter etílico para la separación de los lípidos no polares 28. En cuanto a la separación de TAGs de otras clases de lípidos, el H: E: A tansistema lvent trabaja constantemente y proporciona resultados comparables. Otra ventaja para el uso de TLC es que las bandas de interés se pueden perfilar rápidamente usando MALDI-TOF MS sin derivatización previa de los analitos. En este estudio la sílice se elimina de la placa de TLC, y el analito se eluye de ella por sonicación en un disolvente y la posterior centrifugación para separar el adsorbente y la evaporación del disolvente de elución. Alternativamente, la matriz se puede aplicar directamente sobre las bandas de analitos separados en placas de TLC y después se analizó directamente por MALDI-TOF MS 33. Perfiles de éxito por MALDI-TOF MS no confían en la preparación de muestras suficientes y la competencia del operador con el ajuste y la calibración del instrumento. El instrumento debe ser calibrado diariamente con los estándares que cubren molecular rango de peso adecuado para las moléculas de interés. La sensibilidad y la resolución adecuada (por ejemplo ≥ 10.000) de los equipos también deben confirméD al día con ACTH. Los constituyentes lipídicos sebáceas que se encuentran en la superficie del tegumento de mamíferos pueden desempeñar un papel en la colonización por patógenos bacterianos / hongos. Por lo tanto el conocimiento de la composición química entre las especies y de los individuos puede proporcionar pistas sobre los procesos de enfermedades humanas y la vida silvestre. Diferencias intraespecíficas entre los individuos sanos y los enfermos pueden representar signos clínicos que ayudan en la detección y diagnóstico de enfermedades. Además, si los compuestos específicos que inhiben el crecimiento microbiano están presentes, estos pueden ser identificados para su uso en el tratamiento y prevención de enfermedades.

Tejidos tegumentarios mamíferos incluyen la epidermis, las estructuras de queratina (por ejemplo, cabello y uñas) y las glándulas exocrinas. Glándulas exocrinas de tipo sebáceo están asociados con los folículos del pelo, que se denominan colectivamente como la unidad pilosebácea 1. Las glándulas sebáceas liberan un exudado oleosa sobre la superficie de la piel a que se refiere como sebo. El sebo se compone en gran parte de glicerolípidos (por ejemplo, triglicéridos [CTC]), acilos grasos libres (AGL), ésteres de esterol / cera, y escualeno. Composición química del sebo es específico de la especie 2. Además de ser parte del sistema inmune innato y proporcionar la función antimicrobiana 3, lípidos sebáceos afectan a importantes procesos fisiológicos incluyendo la pérdida por evaporación de agua a través de la piel 4, la integridad celular y la regulación de genes 5, y la absorción del fármaco 6. Composiciones de lípidos sebáceos también pueden servir como marcadores de la enfermedad. Proporciones y cantidades de sebácea b alteradosclases de lípidos de la carretera son signos clínicos de enfermedades tales como acné vulgaris 7, 8 la caspa, dermatitis seborreica 8, asteatosis 9, 10 entre otros. Tejidos epidérmicos y del pelo incluyen perfiles variables que contienen esteroles y derivados, las etiquetas, los AGL, ceramidas, fosfolípidos y otros componentes lipídicos menores. Debido a que los lípidos tegumentario pueden funcionar en los procesos de enfermedad, la determinación de diferencias en las composiciones químicas de los TG entre individuos sanos y enfermos puede ser útil para el diagnóstico clínico de la enfermedad. Los lípidos se definen generalmente como compuestos orgánicos insolubles en agua con sustituyentes ya sea polar o no polar-polares 11. Estructuras lipídicas pueden ser cadenas largas de hidrocarburos, alcanos oxigenados (incluyendo ésteres de cera, ácidos grasos libres, alcoholes, cetonas, y aldehídos), o estructuras de anillo complejos tales como el colesterol 12. Hay ocho clases principales de lípidos basados ​​en la estructura (AGL, glycerolipids [GL], glicerofosfolípidos [GP], esfingolípidos [SP], lípidos esteroles [ST], lípidos prenol [PR], saccharolipids [SL], y policétidos [PK]), que exhiben una amplia gama de propiedades químicas en función de la clase 13. Debido a la amplia variación en las propiedades químicas de clases de lípidos, se desea perfiles directa sin derivatización antes de moléculas de lípidos. Uno de los métodos emergentes de investigación en lípidos es la cromatografía en capa fina (TLC), combinada con espectrometría de desorción por láser asistida por matriz / ionización tiempo de vuelo de masas (MALDI-TOF MS) 14. MALDI-TOF MS se utiliza ampliamente en la investigación proteómica para identificar las proteínas y asociarlos a las secuencias de aminoácidos específicos debido a los iones de péptidos de masas &quot;huellas digitales&quot; de gran precisión generados a partir de las proteínas tripsina digerido 15. MALDI-TOF MS también se puede utilizar para el perfil de otras clases de biomoléculas, incluyendo lípidos tales como etiquetas 16-18. MALDI requiere el uso de una matriz, típcamente un compuesto orgánico que contiene estructuras de doble enlace y aromáticos conjugados. Las moléculas de la matriz sirven para transferir con cuidado la energía del láser para los analitos, promover la transferencia de protones, y producir iones en fase gaseosa sola carga 19-21. Los iones son sometidos a un campo de alto voltaje a alto vacío y se aceleraron en un analizador de masas TOF donde los iones se separan posteriormente por las diferencias en las velocidades que son proporcionales a sus relaciones masa-carga. Incluso las grandes biomoléculas pueden ser ionizados con poca fragmentación, la producción de especies de iones moleculares sola carga de análisis de espectro simplificado. La capacidad de analizar moléculas lipídicas directamente sin previa transformación ha promovido la adopción inmediata de MALDI-TOF MS en la investigación lipidomic 18. Este trabajo presenta un método de rutina para aislar y analizar los lípidos tegumentarios del pelo, las secreciones sebáceas y plagiopatagium del murciélago rojo del Este (Lasiurus Borealis). Esto se utiliza para determinar las variaciones interespecíficas en Bat lípidos tegumentario para dilucidar el proceso de la enfermedad del síndrome de la nariz blanca (SNB) 22. WNS es una enfermedad fúngica de murciélagos y es causado por las especies recientemente descritas psicrofílicas Geomyces destructans 23-25. WNS ha causado la muerte de más de 5 millones de murciélagos de la cueva de América del Norte y amenaza la extinción de las especies de murciélagos vulnerables, con impactos económicos potenciales de miles de millones de dólares en daños a la industria agrícola 26,27. Para investigar los pasos de G. destructans la infección, se extrajeron los lípidos de los tejidos de pelo y de las alas de los murciélagos rojo del este y separados en clases de lípidos amplias por TLC para aislar la fracción de TAG para el posterior análisis por MALDI-TOF MS. TAGs contienen cadenas de acilo cortos y son fácilmente detectados por MALDI-TOF MS con poca interferencia de la matriz.

<table><tbody><tr><td>Hidroxitolueno butilado</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>101162</td><td><a href="http://www.mpbio.com" target="_blank">www.mpbio.com</a></td></tr><tr><td>TLC Placas flexibles</td><td>Whatman</td><td>4410-222</td><td><a href="http://www.whatman.com" target="_blank">www.whatman.com</a></td></tr><tr><td>ACTH</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>A8346-5X1VL</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Trioleína</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>44895-U</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>TLC Lipid Standard</td><td></td><td>TLC 18-1</td><td><a href="http://www.nu-chekprep.com" target="_blank">www.nu-chekprep.com</a></td></tr><tr><td>MALDI TAG Standard</td><td>Nu-Check Prep., Inc.</td><td>Código NIH 53B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MALDI TAG Standard</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>17810-1AMP-S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Frascos de vidrio con tapa de teflón</td><td>U.S. National Scientific Co.</td><td>B7800-2</td><td><a href="http://www.nationalscientific.com/" target="_blank">www.nationalscientific.com/</a></td></tr><tr><td>DHB</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>50862-1G-F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CHCA</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>C8982-10X10 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sebutape</td><td>CuDerm</td><td>S100</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

perfiles de los contenidos triacilglicérido en bat tegumentario lípidos por cromatografía preparativa en capa fina y maldi-tof espectrometría de masas

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

El tegumento de mamífero incluye glándulas sebáceas, que segregan un material aceitoso en la superficie de la piel. La producción de sebo es parte del sistema inmune innato que es de protección contra los microbios patógenos. La producción de sebo anormal y composición química son también un síntoma clínico de las enfermedades específicas de la piel. El sebo contiene una mezcla compleja de lípidos, incluyendo triglicéridos, que es específico de la especie. Las propiedades químicas generales expuestos por diversas clases de lípidos dificultan la determinación específica de la composición de sebo. Técnicas analíticas para los lípidos requieren típicamente derivatizaciones químicas que son Incremento Muestra costos de preparación de mano de obra intensiva y. Este artículo describe cómo extraer lípidos de tegumento de los mamíferos, clases de lípidos amplios separados por cromatografía en capa fina, y el perfil de los contenidos triacylglyceride utilizando la espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser asistida por matriz / ionización. Este método robusto permite una determinación directade los perfiles triacylglyceride entre las especies y los individuos, y puede aplicarse fácilmente a cualquier grupo taxonómico de los mamíferos.

El método de extracción para el aislamiento de lípidos totales a partir de tejido descrito por Folch 30 es un procedimiento sencillo, que está adaptado aquí. Después de la extracción de tejido y evaporación del disolvente, los lípidos a menudo aparecen como una película de color amarillento. El color amarillo más probable es de contaminantes de proteínas, que pueden ser eliminados mediante la realización de una extracción líquido-líquido. Este procesamiento de la muestra adicional no es necesario en este procedimiento debido a TLC preparativa separa la fracción de TAG de tales contaminantes. La adición de sulfato de sodio anhidro fresco en todas las etapas de filtrado ayuda a reducir la contaminación del agua que afecta a las determinaciones de peso de lípidos precisos. Lípidos tegumentario mamíferos análisis por TLC preparativa con H: E: A como la fase móvil por lo general se resolverá cuatro bandas distintas que corresponden a (a partir del origen) esteroles, ácidos grasos libres, las etiquetas y los ésteres de esterol / ésteres de cera / escualeno (Figura 1). En ocasiones cuando se utiliza analíticaalto rendimiento cal (HP) TLC con el H: E: Una fase móvil, los ésteres de esteroles, ésteres de cera, y el escualeno se separará y aparecen como tres bandas separadas. En las condiciones utilizadas en el presente estudio, los ésteres de esterol / cerosos no están separados. Si estas bandas son de interés, la fase móvil se puede cambiar a isooctano: éter etílico (95:5 v / v), y la placa de HPTLC se puede analizar por densitometría de barrido. Otros factores que pueden provocar una mala separación. Estos son generalmente eliminados colocando el papel de filtro en la cámara, la aplicación de grasa para un sello hermético en la tapa, equilibrar la cámara durante la noche, y de mantenimiento de cámaras de TLC limpias, para obtener una calidad constante separaciones y los datos de TLC. Representante espectros de masas MALDI-TOF obtenido para TAGs aislados del murciélago rojo del Este se muestran en las figuras 2 y 3. Estos espectros contienen picos de iones de TAG en el rango de masas entre m / z 850 a 910, que es típico de TAGs aisladas de mamífero no acuáticos. La adición de 1,0 M de NaOH promueve una sola carga iones Na + que son más estables que los iones H +. Además de la estabilidad, la ausencia de H + y K + iones aumenta la facilidad de análisis de espectro. El m / z 850-910 iones picos corresponden a 16:00, 18:00, 18:01, y 18:02 restos FA constituyan el acilo dominantes en TAGs (Tabla 1). Posibles restos de FA de TAGs se pueden determinar inicialmente por el total de iones m / z presente en MALDI-TOF MS espectros, y las diferencias entre las especies y de los individuos que se deducen. Sin embargo, si se requiere que las razones dadas por el contenido de acilo, entonces se deben utilizar MS / MS o la cromatografía de gases (GC / MS). Más información sobre relaciones de acilo se puede deducir mediante la observación de los picos en la región diacilglicéridos del espectro (Figura 4). Diacilglicéridos se producen a partir de la fragmentación TAG en la fuente MALDI y se pueden encontrar en el m / z 590-650 región. La fragmentación de TAG se puede aumentar poromitiendo la adición de 1,0 M de NaOH 16. Tejido ala de murciélago rojo oriental se caracteriza por un pico dominante a m / z 879,7 y el tejido de pelo con un pico dominante a m / z 881.8 (Figura 2 y 3 respectivamente). Los picos am / z 907,8, 879,7, y 855,7 (POP, PPO) son aproximadamente iguales en intensidad (~ 50%) en los tejidos de pelo con el pico a 853,7 ser ~ 40%. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Composición </td><td fo:width="1in"> Composición Elemental </td><td fo:width="1in"> Masa Observada </td></tr><tr><td> TAGs Na + </td><td></td><td> TAGs Na + </td></tr><tr><td> SSO </td><td> C 57 H 108 O 6 </td><td> 911,8 </td></tr><tr><td> OOS, LSS </td><td> C 57 H 106 O 6 </td><td> 909.8 </td></tr><tr><td> OOO, LNSS, LSO </td><td> C 57 H104 O 6 </td><td> 907,8 </td></tr><tr><td> LOO, LLS </td><td> C 57 H 102 O 6 </td><td> 905.8 </td></tr><tr><td> LLO, OOLn </td><td> C 57 H 100 O 6 </td><td> 903.7 </td></tr><tr><td> LLL </td><td> C 57 H 98 O 6 </td><td> 901.7 </td></tr><tr><td> LLLn </td><td> C 57 H 96 O 6 </td><td> 899.7 </td></tr><tr><td> LLnLn </td><td> C 57 H 94 O 6 </td><td> 897.7 </td></tr><tr><td> Lnlnln </td><td> C 57 H 92 O 6 </td><td> 895.7 </td></tr><tr><td> OSP </td><td> C 55 H 104 O 6 </td><td> 883.8 </td></tr><tr><td> LSP, programación orientada a objetos, Sopó </td><td> C 55 H 102 O 6 </td><td> 881.8 </td></tr><tr><td> LOP, LNSP, LSPo </td><td> C 55 H 100 O 6 &lt;/ Td&gt; <td> 879.7 </td></tr><tr><td> LLP, LNOP, Lopo </td><td> C 55 H 98 O 6 </td><td> 877.7 </td></tr><tr><td> LnLP, LLPo, LnOPo </td><td> C 55 H 96 O 6 </td><td> 875.7 </td></tr><tr><td> LnLnP, LnLPo </td><td> C 55 H 94 O 6 </td><td> 873.7 </td></tr><tr><td> LnLnPo </td><td> C 55 H 92 O 6 </td><td> 871,7 </td></tr><tr><td> PPS </td><td> C 53 H 102 O 6 </td><td> 857.8 </td></tr><tr><td> POP, PPO </td><td> C 53 H 100 O 6 </td><td> 855,7 </td></tr><tr><td> OOM, PPL, Popos, Popo </td><td> C 53 H 98 O 6 </td><td> 853.7 </td></tr><tr><td> PPLN, ppol, Popoo, Myoo </td><td> C 53 H 96 O 6 </td><td> 851.7 </td></tr><tr><td> LLM, Lnom </td><td> C 53 H 94 </sub&gt; O 6 </td><td> 849.7 </td></tr><tr><td> PPP, SSLA </td><td> C 51 H 98 O 6 </td><td> 829,7 </td></tr><tr><td> PPPO, Osla </td><td> C 51 H 96 O 6 </td><td> 827.7 </td></tr><tr><td> PPoPo, PMyO </td><td> C 51 H 94 O 6 </td><td> 825.7 </td></tr><tr><td> LnLnLa </td><td> C 51 H 86 O 6 </td><td> 817,6 </td></tr><tr><td> MMS, Slap, PPM </td><td> C 49 H 94 O 6 </td><td> 801.7 </td></tr><tr><td> SLaPo, PPOM, PPMy </td><td> C 49 H 92 O 6 </td><td> 799,7 </td></tr><tr><td> PoPoM, OOCA </td><td> C 49 H 90 O 6 </td><td> 797,7 </td></tr><tr><td> MMP </td><td> C 47 H 90 O 6 </td><td> 773.7 </td></tr><tr><td> MMPo, OCAP </td><td> C 47 H 88 O6 </td><td> 771.7 </td></tr><tr><td> OCaPo </td><td> C 47 H 86 O 6 </td><td> 769,6 </td></tr><tr><td> MMM, PPCa, PMLA </td><td> C 45 H 86 O 6 </td><td> 745.6 </td></tr><tr><td> PoPCa, PoMLa </td><td> C 45 H 84 O 6 </td><td> 743.6 </td></tr><tr><td> Popoca </td><td> C 45 H 82 O 6 </td><td> 741.6 </td></tr><tr><td> LaLaP, MMLA, mCAP </td><td> C 43 H 82 O 6 </td><td> 717.6 </td></tr><tr><td> LaLaPo </td><td> C 43 H 80 O 6 </td><td> 715.6 </td></tr><tr><td> OO </td><td> C 39 H 72 O 5 </td><td> 643.5 </td></tr><tr><td> OL </td><td> C 39 H 70 O 5 </td><td> 641.5 </td></tr><tr><td> LL </td><td> C 39 H 68 O 5 </td><td> 639,5 </td></tr><tr><td> SP </td><td> C 37 H 72 O 5 </td><td> 619.5 </td></tr><tr><td> OP </td><td> C 37 H 70 O 5 </td><td> 617.5 </td></tr><tr><td> LP </td><td> C 37 H 68 O 5 </td><td> 615,5 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Composición de ácidos grasos, composición elemental, y la masa isotópica de aductos sodiated de triacilglicéridos y diacilglicéridos. Ln = ácido linolénico (18:3), L = ácido linoleico (18:2), O = ácido oleico (18:1), S = ácido esteárico (18:0), P = ácido palmítico (16:00), Po = ácido palmitoleico (16:1), M = ácido mirístico (14:00), Mi = ácido miristoleico (14:01) La = láurico ácido (12:00), Ca = ácido cáprico (10:00). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig1.jpg" /> Figura 1. Cromatograma en capa fina de amplia separación de clases de lípidos por hexano: éter dietílico: ácido acético(80:20:2 v / v / v) como la fase móvil. La banda entre esterol y FFA no fue identificado por un estándar, pero puede ser un alcohol graso o cera diéster. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig2.jpg" /> Figura 2. Región TAG Ampliado de MALDI-TOF espectro de masas de TAGs sodiated. (M / z 700 a 950) de murciélago rojo del Este (L. borealis) tejido ala Peaks identificados a m / z 853,7 (OOM, PPL, Popos, Popo) ym / z 879,7 (LOP, LNSP, LSPo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig3.jpg" /> Figura 3. Región TAG Ampliado de MALDI-TOF espectro de masas de TAGs sodiated (m / z 700 a 950) de murciélago rojo del Este (L. borealis) tejido de cabello.Los picos identificados en m / z 905,8 (LOO, LLS) ym / z 907,8 (OOO, LNSS, LSO). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig3large.jpg" target="_blank">Haz click aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig4.jpg" /> Figura 4. Región DAG de MALDI-TOF espectro de masas de los fragmentos del DAG sodiated (m / z 530 a 730). Tejido de murciélago rojo del Este (L. borealis) ala Peaks identificados a m / z 643,5 (OO) y m / z 615,5 (LP) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> .

Tegumento de los mamíferos contiene lípidos extraíbles con disolventes que pueden proporcionar composiciones química característica de las especies individuales. Este trabajo presenta un método de rutina para separar grandes clases de lípidos aislados de tejidos tegumentarios utilizando cromatografía en capa fina y la determinación del perfil triacilglicérido por láser de desorción / ionización por espectrometría de masas de tiempo de vuelo asistida por matriz.

Perfiles de los Contenidos triacilglicérido en Bat Tegumentario lípidos por cromatografía preparativa en capa fina y MALDI-TOF espectrometría de masas

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar e identificar el contenido de triglicéridos presente en las secreciones sebáceas de murciélagos. Primero, extraiga la fracción lipídica de la superficie de los tejidos tegumentarios en condiciones que minimicen la contaminación y la oxidación. Separe los lípidos mediante cromatografía en capa fina para obtener la fracción de triglicéridos.Ahora procese los datos espectrales con el software del instrumento y analícelos mediante bases de datos químicas en línea. En última instancia, se utiliza la cromatografía en capa fina preparativa y la espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz y tiempo de vuelo para determinar las diferencias en los perfiles de composición de triglicéridos entre los grupos experimentales y controlados. Este método puede emplearse para ayudar a identificar lípidos secretados que podrían funcionar como señales químicas en las interacciones huésped-patógeno.Aunque estamos utilizando este método para investigar los signos clínicos del síndrome de la nariz blanca, este método puede aplicarse a otros sistemas de mamíferos, incluyendo el estudio de señales sexuales o posiblemente diferencias interespecíficas en la composición de la leche. Limpie todos los instrumentos con metanol antes y entre la recolección de tejidos de diferentes individuos. Corte aproximadamente un gramo de pelo de la piel y colóquelo en un matraz erlenmeyer de 125 mililitros.Para obtener una muestra del sebo de las superficies alares. Humedezca bolas de algodón con disolvente de cloroformo-metanol. Frote la piel y coloque estas en un matraz separado.Ahora extraiga el tejido con 10 mililitros de cloroformo-metanol que contenga 0,5 % de BHT para prevenir la oxidación, después de dos horas agregue aproximadamente 0,5 gramos de sulfato de sodio anhidro y pase a través de papel de filtro para recolectar el disolvente. Repita la extracción secuencialmente con cloroformo-metanol en proporciones de uno a uno y uno a dos. Luego reúna los filtrados y evapore el conjunto de filtrados bajo una corriente de nitrógeno.Determine el peso seco y disuelva el residuo lipídico hasta una concentración de 10 miligramos por mililitro. Almacene la muestra en viales de vidrio a menos 20 grados Celsius durante hasta un mes para eliminar plastificantes que podrían interferir con el análisis posterior de espectrometría de masas. Llene tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros con tres a dos de cloroformo metanol.Luego enjuague con acetona y seque al aire; almacene los tubos de muestra en un recipiente libre de polvo y manipule estos tubos únicamente con guantes para prevenir la contaminación por aceites de la piel. Active la placa de TLC primero pre-desarrollándola con una mezcla de tres a dos de cloroformo-metanol.Agregue disolvente a la cámara de CCF hasta una profundidad de un centímetro. Luego coloque la placa en la cámara y permita que el disolvente ascienda completamente hasta la parte superior de la placa. Retire la placa y séquela en una campana extractora hasta que el disolvente se evapore.Luego caliente la placa al menos 10 minutos a 120 grados Celsius. Ahora marque la placa con una marca de lápiz en la parte superior. Trace una línea recta con lápiz a 1,5 centímetros del borde inferior de la placa para marcar la línea base donde se colocarán la muestra y los patrones.A continuación, corte un trozo de papel de filtro lo suficientemente grande como para forrar las dos paredes cortas y una pared larga de la cámara de CCF. Introduzca el forro de papel de filtro en la cámara. Vierta 100 mililitros de fase móvil recién preparada en la cámara hasta una profundidad de aproximadamente un centímetro.Aplique un sello de grasa de silicona a lo largo del borde superior de la cámara. Cúbrala con la tapa de vidrio y equilibre durante la noche. Aplique la muestra manualmente o con un aplicador automático de muestras, realizando una estría continua.Utilice las franjas externas de la placa de CCF para aplicar aproximadamente 20 microlitros de la mezcla de patrones. Coloque la placa de CCF cargada en la cámara equilibrada. Cierre la tapa y desarrolle la placa hasta que el disolvente ascienda hasta el borde superior.Después de aproximadamente 45 minutos, retire la placa y deje que el exceso de disolvente se evapore en una campana extractora. Rocíe con yodo seis G al 0,05 % en etanol al 95 %. Luego, visualice las bandas lipídicas bajo una lámpara de ultravioleta de longitud de onda larga con un lápiz. Marque la posición Rf de las bandas fluorescentes resueltas en la muestra y en los patrones.Realice un registro fotográfico. A continuación, identifique la banda correspondiente al patrón de marcadores. Trasfiera esta banda a un trozo grande de papel de vidrio y papel de suero, y luego a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros lavado con disolvente.Añada un mililitro de disolvente de cloroformo-metanol en una proporción de tres a dos a la muestra y someta a sonicación durante un minuto. Pelote la sílice mediante centrifugación y luego transfiera el disolvente a un nuevo tubo previamente pesado. Repita la extracción con un mililitro, reúna los filtrados y luego evapore el disolvente bajo una corriente de nitrógeno.Guarde el residuo seco que contiene las etiquetas bajo nitrógeno, en la oscuridad y a cuatro grados Celsius, mientras se separan muestras adicionales de tejido mediante TLC Rho Domine. Se encuentra presente Six G en las muestras, pero es insoluble en hexano y se elimina durante la disolución de la muestra de inmediato. Antes del análisis por MS, prepare la solución de trabajo de A CTH a 500 fmol por microlitro y los patrones de etiquetas a 10 miligramos por mililitro según se describe en el protocolo del texto.Además, prepare la solución stock de DHB 0,5 molar con metanol al 90 % para usarla como matriz de muestra y patrón. Cubra el tubo con papel de aluminio para protegerlo de la luz. Ahora combine 10 microlitros de matriz de DHB, 10 microlitros de muestra o patrón y cinco microlitros de la mezcla de hidróxido de sodio 1 molar, y centrifugue brevemente el tubo para llevar la mezcla al punto inferior.Coloque un microlitro de muestra patrón o A CTH sobre una placa de acero inoxidable para MALDI y colóquela en un desecador para secar. Luego, introduzca la placa en el instrumento para la adquisición de datos. Realice el análisis de MALDI toff MS en modo de reflexión positiva.Ajuste y calibre el instrumento según lo descrito por el fabricante del instrumento, utilizando las soluciones estándar de CTH y etiquetas. Adquiera espectros para cada muestra colocada en la placa objetivo después de suavizar y restar manualmente el fondo de los picos de iones del proceso Aldi Spectra con el motor de búsqueda en línea lipid maps; copie y pegue la lista de espectros en la lista de iones precursor y el cuadro de intensidad. Limite la búsqueda a la composición de AAL deseada. Identifique las etiquetas mediante las relaciones masa-carga de los iones presentes en el espectro para cada muestra.Si hay disponibles porcentajes de ésteres metílicos de ácidos grasos provenientes de un análisis GCMS independiente, añada estos datos para obtener las probabilidades de las etiquetas. El análisis de lípidos tegumentarios de mamíferos mediante TLC preparativo con HEA como fase móvil suele resolverse en cuatro bandas distintas que corresponden a esteres FFAs, etiquetas y esteres estériles, cera EERs y escualeno. Estos espectros de masas múltiples se obtuvieron para las etiquetas aisladas del murciélago rojo del este.Típico de una preparación de mamíferos no acuáticos. Los espectros contienen picos de iones en el rango de masa entre relación carga maestra ocho 50 y nueve 10. Las cadenas de ácidos grasos son los constituyentes y marcas principales de los AAL.Se puede deducir más información sobre las proporciones de AAL al observar los picos en la región de glicéridos D AAL del espectro, que representan la fragmentación de la etiqueta. El espectro MALDI muestra tres regiones de etiqueta distintas donde la relación de carga principal se basa en el número de átomos de carbono. El tejido de ala de murciélago rojo oriental se caracteriza por picos dominantes en estas tres regiones con relaciones de carga principal de 8 53 0.7 8, 79 0.7 y 907.8.Recuerde que al trabajar con murciélagos vivos o eutanasiados, debe obtener todos los permisos necesarios para el manejo, almacenamiento y transporte de estos animales. Además, debe obtener la autorización del comité institucional de cuidado y uso de animales, así como del comité institucional de bioseguridad. Si se manipulan murciélagos vivos o tejido nervioso de murciélagos, recuerde que todos los manipuladores deben estar vacunados contra la rabia.Además, al trabajar con ciertos patógenos de murciélagos como geo MiSiS ants, se requiere un laboratorio de nivel de bioseguridad dos.

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Investigación

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Chemistry

Química

Composición de los extractos de lípidos polares y la composición de ácidos grasos de glicerolípidos individuales están determinados en un experimento de lípidos perfil simple y robusto. Para ello, glicerolípidos están aislados por cromatografía en capa fina y se somete a transmetilación de sus grupos acilo. Grasos methylesters acilo son cuantificados por cromatografía de gases.

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Perfiles de los Contenidos triacilglicérido en Bat Tegumentario lípidos por cromatografía preparativa en capa fina y MALDI-TOF espectrometría de masas (Video) | JoVE Journal

Perfiles de los Contenidos triacilglicérido en Bat Tegumentario lípidos por cromatografía preparativa en capa fina y MALDI-TOF espectrometría de masas

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