Name: Cultivos neuronales estratificados por sexo para estudiar las vías de muerte de las células isquémicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende a preparar cultivos neuronales estratificados por sexo a partir de tejido hipocampal embrionario. Este método permite estudiar mecanismos de señalización específicos en la muerte neuronal por isquemia en machos y hembras.

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Trabajo apoyado en parte por la Fundación Walter S. y Lucienne Driskill y NIH R01NS058792.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Los cultivos neuronales primarios disociados del hipocampo estratificados por sexo en los que se diseccionan, disocian y cultivan por separado los hipocampos masculinos y femeninos presentan una herramienta útil para investigar la señalización celular específica del sexo en la muerte de las células neuronales. Si bien los neurocientíficos suelen utilizar cultivos neuronales primarios, los protocolos varían entre laboratorios según sus objetivos e intereses experimentales específicos. Muchos investigadores optan por cocul...

Los mamíferos son sexualmente dimórficos, con machos y hembras que exhiben diferentes rasgos y características. Las diferencias sexuales se extienden incluso al cerebro y son evidentes en la susceptibilidad neuronal a las lesiones y enfermedades (revisado en1-5). Por ejemplo, el cerebro masculino es más susceptible a la lesión neuronal isquémica por accidente cerebrovascular o paro cardíaco seguido de reanimación (revisado en6). La enfermedad de Parkinson (revisada en7) y la esquizofrenia (revisada en8) son más comunes en los hombres humanos que en las mujeres, mientras que el cerebro humano femenino parece más susceptible a la enfermedad de Alzheimer (revisado en9) y a los trastornos del estado de ánimo como la depresión (revisado en10). A pesar de las diferencias observables entre los sexos en la susceptibilidad a las lesiones y enfermedades neuronales, la mayoría de los paradigmas de tratamiento actuales no tienen en cuenta el sexo y son similares tanto en hombres como en mujeres. Se podría lograr un mayor éxito si se tuvieran en cuenta y se comprendieran las diferencias entre los sexos.
Modelos animales in vivo de lesiones y enfermedades neuronales demuestran un dimorfismo sexual similar al de los humanos y son fundamentales para mejorar nuestra comprensión de las diferencias sexuales y cómo esas diferencias contribuyen a la supervivencia y función neuronal. La evidencia ha demostrado, por ejemplo, que los roedores machos son más susceptibles que las hembras a la lesión neuronal isquémica11-15. Se cree que esta diferencia depende, al menos parcialmente, de la señalización molecular de la testosterona, la principal hormona esteroide sexual masculina, y el estrógeno, la principal hormona esteroide sexual femenina. Los estudios con roedores machos y hembras gonectomizados revelan que la testosterona y el metabolito de la testosterona, la dihidrotestosterona (DHT) exacerban y el estrógeno disminuye la lesión neuronal después de la isquemia cerebral12-14,16-18. Sin embargo, las diferencias sexuales en la isquemia cerebral están presentes tanto en animales neonatos como adultos19,20. Los neonatos experimentan aumentos repentinos de estrógeno o testosterona en el útero durante el desarrollo, pero tienen niveles relativamente bajos de hormonas después del nacimiento hasta la pubertad (revisado en21). Por lo tanto, la presencia o ausencia de hormona sexual primaria no es el único determinante de la susceptibilidad neuronal a las lesiones influenciada por el sexo. De hecho, es probable que durante el desarrollo se establezcan dimorfismos sexuales que den lugar a diferencias en la señalización celular y la respuesta a la isquemia, incluso cuando los niveles hormonales son bajos.
Independientemente de si las diferencias sexuales dependen de la presencia de hormonas esteroides sexuales o si se deben a dimorfismos establecidos durante el desarrollo, se está volviendo claro con estudios posteriores que existen diferencias en la señalización celular entre hombres y mujeres en el cerebro. En el Laboratorio Herson de la Facultad de Medicina de la Universidad de Colorado, hemos identificado una de esas diferencias. Hemos encontrado que el canal iónico permeable al calcio, sodio y potasio, TRPM2 (revisado en22,23), induce la muerte celular neuronal después de un insulto isquémico in vivo en el ratón macho, pero no en la hembra24. Demostramos que la inhibición farmacológica o la eliminación genética de TRPM2 es protectora en el ratón macho, pero no en la hembra en nuestro modelo in vivo de oclusión arterial carotídea media (MCAO) de accidente cerebrovascular24.
A pesar de su utilidad, los modelos animales in vivo de lesión neuronal isquémica pueden, a veces, ser limitados para estudios moleculares de muerte neuronal, debido a la dificultad o incapacidad de dirigirse específicamente a las neuronas para su investigación. Por esta razón, nuestro laboratorio utiliza neuronas corticales o hipocampales disociadas primarias in vitro para complementar nuestro trabajo in vivo. Los cultivos primarios de neuronas disociadas presentan una herramienta útil para investigar las vías de señalización celular involucradas en la lesión y enfermedad neuronal. Las neuronas en cultivo pueden mantenerse en un entorno estrictamente controlado, con o sin entrada glial. En ausencia de glía, las respuestas observadas en el cultivo son neuronales. Los agentes farmacológicos pueden administrarse al cultivo sin preocuparse por la absorción a través de la barrera hematoencefálica, lo que permite la inhibición o activación de componentes específicos de una vía de transducción de señales determinada. La biología molecular se puede utilizar para sobreexpresar o eliminar varias proteínas de interés, y se pueden realizar mediciones electrofisiológicas en células individuales, algo que no sería posible en un sistema modelo in vivo.
El Laboratorio Herson amplía la utilidad de los cultivos neuronales primarios disociados mediante el primer sexado de los embriones utilizados para preparar los cultivos. Los cultivos de neuronas estratificadas por sexo masculino y femenino demuestran claramente que las neuronas masculinas son más susceptibles que las neuronas femeninas a la muerte celular neuronal después de la privación de oxígeno y glucosa25. La privación de oxígeno y glucosa es un modelo in vitro aceptado de isquemia neuronal, ya que la isquemia reduce la disponibilidad de oxígeno y glucosa en el cerebro. Además, hemos demostrado con experimentos electrofisiológicos en neuronas disociadas y estratificadas por sexo que TRPM2 se activa en las neuronas masculinas pero no en las femeninas24,26. Actualmente estamos investigando los reguladores moleculares específicos del sexo de la actividad TRPM224,26. Aquí, compartimos y discutimos nuestro protocolo para establecer cultivos de neuronas hipocampales embrionarias primarias disociadas por sexo y presentamos datos representativos utilizando este método que sugieren que la enzima de reparación del ADN, PARP-1, contribuye a la muerte de células isquémicas de una manera específica por sexo similar a TRPM2. PARP-1 se activa por la rotura del ADN debido al estrés oxidativo (revisado en27,28). Cuando el daño al ADN es mínimo, la actividad de PARP-1 mejora la supervivencia celular, pero cuando el daño es excesivo, el aumento de la actividad de PARP-1 exacerba la muerte celular. PARP-1 produce poli-(ADP)ribosa, un conocido activador del canal TRPM228-31, y algunas evidencias sugieren que PARP-1 se activa preferentemente en el cerebro masculino pero no femenino en respuesta al estrés oxidativo32,33. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que PARP-1 activa TRPM2 en el hombre pero no en la mujer, induciendo la muerte celular neuronal en respuesta a la privación de oxígeno y glucosa.

<table><tbody><tr><td>B27 Suplemento</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Bórax</td><td>Sigma</td><td>71997</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Bórico</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina Suero Bovino</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>MEM, sin glutamina, sin rojo de fenol</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal, sin glutamina, sin rojo de fenol</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lisina, MW 70,000-150,000</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Azul Trypan 0.4%</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Pinzas en ángulo</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 7 &ndash; Pinzas curvadas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>dentadas (Londres) Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11080-02</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de Graefe Extra Finas 1 x 2 dientes</td><td>Fine Science Tools</td><td>11153-10</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Moria Fine</td><td>Science Tools</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de operación medianas</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de microdisección extrafinas</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos</td><td>Fisher</td><td>87721</td><td></td></tr><tr><td>Colador de células, 40 y micro; M Malla de nylon</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr></tbody></table>

cultivos neuronales estratificados por sexo para estudiar las vías de muerte de las células isquémicas

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

Las diferencias sexuales en la susceptibilidad neuronal a la lesión isquémica y a la enfermedad neurodegenerativa se han observado durante mucho tiempo, pero los mecanismos de señalización responsables de esas diferencias siguen sin estar claros. El cultivo neuronal embrionario disociado primario proporciona un modelo experimental simplificado con el que investigar la señalización de las células neuronales implicadas en la muerte celular como resultado de isquemia o enfermedad; Sin embargo, la mayoría de los cultivos neuronales utilizados en la investigación hoy en día son de sexo mixto. Los investigadores pueden probar, y de hecho lo hacen, los efectos del tratamiento con esteroides sexuales en cultivos neuronales mixtos en modelos de lesiones y enfermedades neuronales, pero la evidencia acumulada sugiere que el cerebro femenino responde a los andrógenos, estrógenos y progesterona de manera diferente al cerebro masculino. Además, los roedores neonatos machos y hembras responden de manera diferente a la lesión isquémica, y los machos experimentan una mayor lesión después de la isquemia cerebral que las hembras. Por lo tanto, los cultivos neuronales mixtos podrían oscurecer y confundir los resultados experimentales; Es posible que se pierda información importante. Por esta razón, el Laboratorio Herson de la Facultad de Medicina de la Universidad de Colorado prepara rutinariamente cultivos neuronales embrionarios primarios disociados estratificados por sexo tanto del hipocampo como de la corteza. Los embriones se sexan antes de la recolección del tejido cerebral y el tejido masculino y femenino se disocian por separado, se siembran por separado y se mantienen por separado. Utilizando este método, el laboratorio de Herson ha demostrado un papel específico del canal iónico TRPM2 en la muerte de células isquémicas. En este manuscrito, compartimos y discutimos nuestro protocolo para el sexado de ratones embrionarios y la preparación de cultivos de neuronas primarias disociadas del hipocampo estratificadas por sexo. Este método se puede adaptar para preparar cultivos corticales estratificados por sexo, y el método para el sexado de embriones se puede utilizar junto con otros protocolos para cualquier estudio en el que se considere que el sexo es un determinante importante del resultado.

La determinación correcta del sexo de embriones de ratón es un paso crítico en la preparación de cultivos primarios de neuronas estratificados por sexo. Para asegurar que los hipocampos de machos y hembras se cultivaran por separado a partir de embriones correctamente determinados, los embriones se separaron por sexo y se recolectaron sus cortezas e hipocampos. Se aisló ADN genómico del tejido recolectado de cada embrión según procedimientos estándar, teniendo cuidado de mantener separados los sexos. Se realizó la reacci...

Los cultivos neuronales embrionarios primarios disociados del hipocampo son útiles para investigar los mecanismos de señalización implicados en la muerte neuronal. El sexado de los embriones antes del aislamiento y disociación del hipocampo permite la preparación de cultivos masculinos y femeninos separados, lo que permite al investigador identificar e investigar la señalización celular específica del sexo.

Cultivos neuronales estratificados por sexo para estudiar las vías de muerte de las células isquémicas

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar cultivos primarios de neuronas disociadas del hipocampo estratificados por sexo. El primer paso del procedimiento consiste en determinar el sexo y diseccionar embriones en el día embrionario 18, para obtener cultivos neuronales primarios estratificados por sexo. El siguiente paso es preparar neuronas asociadas a partir del tejido neuronal.El paso final consiste en sembrar las neuronas a la densidad adecuada y cultivarlas para su experimentación. En última instancia, este método, junto con otros protocolos, puede utilizarse en cualquier estudio en el que se considere que el sexo es un determinante importante del resultado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del género, como si los roedores macho y hembra responden de manera diferente a la isquemia neuronal. De las varias preparaciones necesarias, hay algunas que vale la pena revisar, como las placas de cultivo de tejidos.Preparar la poli-L-lisina diluida a 0,1 miligramos por mililitro. Luego, bajo una campana de flujo laminar para cultivo de tejidos, cubrir abundantemente el fondo de cada pocillo de una placa de cultivo estéril tr

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Cultivos neuronales estratificados por sexo para estudiar vías de muerte celular isquémica

Este video demuestra la técnica de evaluación de la muerte neuronal en cortes organotípicos de corteza rinal e hipocampo. La muerte neuronal se produce a través de convulsiones epilépticas en evolución, que se asemejan a la epilepsia in vivo, y se detecta mediante la tinción dual de las células muertas mediante yoduro de propidio e inmunofluorescencia.

Ensayo de muerte neuronal para evaluar la muerte celular en un modelo de epilepsia ex vivo

Este video muestra una técnica ex vivo para inducir la muerte de células cerebrales mediada por células T CD8+ citotóxicas. Al obtener cortes de cerebro, las células T CD8+ dirigidas a oligodendrocitos activados se transfieren a los cortes para dirigirse a la vaina de mielina y a los oligodendrocitos. Después de la incubación, el daño a la mielina y la muerte neuronal se pueden evaluar histológicamente en las regiones de interés.

Una técnica ex vivo para inducir la muerte neuronal a través de linfocitos T CD8+ específicos de oligodendrocitos

Oclusión de la carótida bilateral junto con hipotensión sistémica produce isquemia cerebral global en la rata, lo que resulta en daños en el hipocampo con la gravedad reproducibles. Temas de animales se deterioran con patrones predecibles de daño cerebral, que se recuperan convenientemente, y las tasas de mortalidad son relativamente bajos.

2 vasos Oclusión / Hipotensión: un modelo de rata de isquemia cerebral global

Hemos desarrollado un modelo de cortes de cerebro que se puede utilizar para examinar los mecanismos moleculares implicados en la lesión cerebral excitotoxicidad mediada. Esta técnica genera tejido cerebral madura viable y reduce el número de animales necesarios para la experimentación, mientras que mantiene los circuitos neuronales, las interacciones celulares y compartimentos postsinápticos parcialmente intacta.

Excitotóxica Estimulación del cerebro Microslices como<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Carrera

Este estudio presenta una técnica para el aislamiento de neuronas de ratones neonatales WT. Requiere la cuidadosa disección de la médula espinal del ratón neonatal, seguida de la separación de las neuronas del tejido de la médula espinal mediante escisión mecánica y enzimática.

Aislamiento y Cultura de Neuronas de la Médula Espinal de Ratones Neonatales

Este protocolo describe un método simple para el aislamiento y cultivo de neuronas de gránulo cerebral primario de ratón (CGNs) de cachorros de 6-7 días, transduction eficiente de CGNs por pérdida y ganancia de estudios de la función y modelado de excitotoxicidad neuronal inducida por el NMDA, muerte celular inducida por potasio bajo, daño del ADN y estrés oxidativo utilizando el mismo modelo de cultura.

Modelado de la muerte Neuronal y la degeneración en las neuronas del gránulo cerebeloso primario de ratón

Se presenta un protocolo para preparar cultivos de rebanadas flotantes a partir del cerebro humano adulto. El protocolo es una variación del método de cultivo de rebanadas ampliamente utilizado utilizando inserciones de membrana. Es simple, rentable y recomendado para ejecutar ensayos a corto plazo destinados a desentrañar mecanismos de neurodegeneración detrás de las enfermedades cerebrales asociadas a la edad.

Cultivos de rebanadas flotantes a corto plazo del cerebro humano adulto

Los cultivos de rodajas organotípicas son una poderosa herramienta para estudiar los procesos neurodesarrollo o degenerativos/regenerativos. Aquí, describimos un protocolo que modela la muerte del neurodesarrollo de las células de Purkinje en cultivos de rebanadas cerebelosas de ratón. Este método puede beneficiar la investigación en el descubrimiento de fármacos neuroprotectores.

Supervivencia de células Purkinje en cultivos de rebanadas de cerebeloso organotípico

Aquí, presentamos un enfoque simple utilizando medios de cultivo específicos que permiten el establecimiento de culturas enriquecidas con neuronas y astrocitos, o cultivos de neurona-glia de la corteza embrionaria, con alto rendimiento y reproducibilidad.

Un modelo de cultivo celular para estudiar el papel de las interacciones de neuronas y glia en isquemia

Una forma sólida para estudiar las avalanchas neuronales, es decir, invariante en escala espacio-temporal de ráfagas de actividad, lo que indica la dinámica de estado crítico en la corteza. Avalanchas surgen espontáneamente en el desarrollo de las capas superficiales de la corteza cultivo que permite mediciones a largo plazo de la actividad con planos las redes distribuidas multi-electrodo (MEA) en condiciones controladas con precisión.

Electrodos múltiples grabaciones matriz de avalanchas neuronal en cultivos organotípicos

Aprende a preparar cultivos neuronales estratificados por sexo a partir de tejido hipocampal embrionario. Este método permite estudiar mecanismos de señalización específicos en la muerte neuronal por isquemia en machos y hembras.

Cultivos neuronales estratificados por sexo para estudiar las vías de muerte de las células isquémicas

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