Heat-inducida por antígenos de recuperación: un método eficaz para detectar e identificar tipos de células progenitoras durante la neurogénesis del hipocampo adulto

El objetivo general de este procedimiento es realizar la recuperación de antígenos en el tejido cerebral del hipocampo para visualizar mejor los tipos de células progenitoras que dan lugar a las neuronas recién nacidas. Esto se logra primero recolectando el cerebro perfundido de un ratón cortando secciones coronales delgadas y montando estas secciones en un portaobjetos de vidrio, diseñado específicamente para adherirse fuertemente al tejido. El segundo paso es hervir los portaobjetos con tejido y tratamiento atópico Kay y dejar tiempo suficiente para que se enfríen.

A continuación, tiñe el tejido durante la noche con anticuerpos primarios. El paso final es realizar la tinción secundaria de anticuerpos en el tejido al día siguiente durante al menos dos horas. En última instancia, visualice los diversos tipos de células pro género en las diversas etapas de desarrollo durante la neurogénesis adulta del tejido del hipocampo con microscopía de lapso de tiempo o confocal.

Hola, mi nombre es Hun Jo, posdoctorado, miembro del laboratorio del Dr. Ian John y de la Clínica Mayo. Nuestro enfoque principal en John Lab es investigar el proceso de otras neurogénesis en trastornos neurológicos y psiquiátricos. Nuestro objetivo final es traducir con éxito dicho conocimiento en aplicación terapéutica demostrando que nuestro procedimiento de retriever de antígenos será Quam Hui, y hola John de nuestro laboratorio.

La principal ventaja de nuestra técnica sobre los métodos existentes de inmunohistoquímica es que permite una visualización efectiva de distintos tipos de células durante la neurogénesis del hipocampo adulto. Estos tipos de células, incluidas las células madre neurales precursoras que de otro modo serían difíciles de detectar, se pueden etiquetar y visualizar de manera eficiente utilizando nuestro método de recuperación de antígenos. Este método proporcionará información sobre el desarrollo y la regulación de las neuronas recién nacidas durante la neurogénesis del hipocampo adulto.

Para aquellos interesados en el estudio de los trastornos mentales y el tratamiento farmacológico, nuestra recuperación de antígenos resultará útil para investigar el papel del desarrollo neuronal durante esta enfermedad. Patogénesis. Comience el procedimiento colocando el cerebro de un ratón perfundido en formaldehído al 4% en un tubo cónico de 10 mililitros durante la noche a cuatro grados Celsius, o durante al menos 12 a 24 horas, pero no más de 36 horas para una fijación completa. Después de la fijación durante la noche, retire el PFA y deje el cerebro en el tubo cónico.

A continuación, enjuague el cerebro con sacarosa al 30% para eliminar cualquier PFA residual y deseche la sacarosa. A continuación, vuelva a llenar el tubo con un 30% de sacarosa y manténgalo a cuatro grados centígrados hasta que el cerebro se hunda hasta el fondo del tubo. A continuación, corta el hipocampo en secciones cerebrales de 40 micrómetros en un micrótomo.

Conserve las secciones en la solución anticongelante hasta que estén listas para la inmunohistoquímica. A continuación, monte las rodajas en los portaobjetos del microscopio que están diseñados específicamente para adherirse firmemente al tejido. Después de montar el pañuelo, deje que los portaobjetos se sequen durante unos 10 minutos.

El secado se puede acelerar si los portaobjetos se apoyan contra una superficie vertical sobre una toalla de papel para garantizar la eliminación completa de los productos químicos anteriores. Una vez que los portaobjetos estén secos, lávelos con PB S3 varias veces durante cinco minutos cada vez. A continuación, déjalo secar de nuevo.

En este procedimiento, prepare la solución para la ebullición del tejido de acuerdo con la descripción del manuscrito adjunto. A continuación, hierva la solución durante cinco minutos en un microondas estándar a temperatura estándar. Una vez que termine de hervir, retire con cuidado el recipiente del microondas.

Después de eso, transfiera los portaobjetos secos a la solución. Asegúrese de que el lado con las secciones del hipocampo esté completamente expuesto a la solución. Si es posible, coloque los portaobjetos en ángulo contra las paredes del contenedor y apile otros portaobjetos a su alrededor.

A continuación, hierva la mezcla con los portaobjetos durante siete minutos en el microondas a temperatura estándar. Mientras tanto, llene dos cubos de hielo hasta la mitad con hielo. Una vez que se complete la ebullición, retire el recipiente del microondas y colóquelo dentro de una de las cubiteras.

Vierta el resto del hielo del otro balde alrededor del recipiente y cúbralo por completo. Después de eso, déjelo reposar durante una hora después de una hora. Retire los portaobjetos del recipiente.

Lávelos con tampón TBST tres veces durante cinco minutos cada vez. A continuación, seque los portaobjetos en la oscuridad durante cinco a 10 minutos o hasta que el portaobjetos esté completamente seco. Mientras tanto, prepare una cámara con DDH dos O para la tinción de anticuerpos primarios durante la noche.

Una vez que los portaobjetos se hayan secado, dibuje un contorno alrededor de las secciones de tejido con un bolígrafo apelante de agua. Este contorno actúa como una barrera para evitar que la mezcla de anticuerpos se desborde. A continuación, prepare la mezcla primaria de anticuerpos en T-B-S-T-T.

Coloque los portaobjetos secos en la platina de la cámara de tinción. Agregue 500 microlitros del anticuerpo primario lentamente para cubrir toda la superficie. Posteriormente, cubra la cámara de tinción para bloquear la luz externa y manténgala toda la noche a temperatura ambiente al día siguiente, lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos cada vez con tampón TBST.

Después de eso, sécalos en la oscuridad. Ahora prepare la mezcla de anticuerpos secundarios en T-B-S-T-T. A continuación, coloque los portaobjetos secos en la cámara de tinción.

Añadir 500 microlitros del anticuerpo secundario. Cubra lentamente la cámara de tinción y manténgala alejada de la luz externa durante al menos dos horas a temperatura ambiente después de completar la tinción secundaria, lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos cada vez con tampón TBST, seque los portaobjetos en la oscuridad después del secado. Agregue una solución de montaje a las guías.

Cúbralos con cubreobjetos con cuidado para evitar la introducción de burbujas. A continuación, mantenga los portaobjetos en la oscuridad durante al menos dos horas antes de realizar el análisis posterior y realizar un análisis de lapso de tiempo o convo en el tejido teñido. La neurogénesis del hipocampo adulto se representa a través de la zona subgranular del giro dentado.

Una glía radial activada como la célula madre tipo uno pasa por distintas fases a medida que se diferencia, madura y se integra funcionalmente con una morfología elaborada en el circuito neuronal. Cada una de las fases y los respectivos tipos de células se pueden identificar en función de su expresión de una combinación de marcadores. MCM dos es un marcador de proliferación que se expresa en todos los tipos de células progenitoras mitóticas, mientras que la neína se expresa entre células madre radiales y no radiales gliales.

A medida que los progenitores de tipo dos A se diferencian, primero se desactiva la expresión anidada. La expresión de dos anti TBR aumenta en el progenitor postmitótico MCM, se pierde la expresión de dos, mientras que la expresión de DCX y NEWAN dicta la migración y la maduración en una neurona funcional. Esta es una imagen confocal representativa de MCM púrpura, dos neston verdes y tinción roja moteada.

Las imágenes ampliadas en los cuadros muestran un progenitor radial similar a GL que expresa neston MCM dos y dpi. Aquí hay una imagen confocal representativa de MCM azul, dos rojos, TBR dos DCX verdes y ppp grises. La tinción de la característica de un tipo de célula progenitora de tipo dos B se muestra en las imágenes ampliadas de los cuadros que expresan MCM dos, TBR 2D, c, X y ppp.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar tres cosas. Uno, utilizar tejido bien perfundido y fijado del grosor coronal correcto. Dos, montar el tejido plano en los portaobjetos y evitar cualquier daño al hacerlo.

Y, por último, tres, permitiendo el tiempo suficiente para la ebullición y el posterior enfriamiento durante la extracción del antígeno. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la reconstrucción de tejido confocal y los experimentos de comportamiento, para responder preguntas adicionales sobre cómo las neuronas recién nacidas pueden integrarse en los circuitos del hipocampo y contribuir a la función cognitiva. Después de ver este video, debes tener una buena comprensión de cómo realizar un recuperador de antígenos en tu tejido del hipocampo para visualizar con mayor efectividad, los tipos de células presentativas que dan lugar a nuevas neuronas durante otras neurosis del hipocampo.