Heat-inducida por antígenos de recuperación: un método eficaz para detectar e identificar tipos de células progenitoras durante la neurogénesis del hipocampo adulto

El objetivo general de este procedimiento es realizar la recuperación de antígenos en tejido cerebral del hipocampo para visualizar mejor los tipos de células progenitoras que dan origen a neuronas recién formadas. Esto se logra primero extrayendo el cerebro perfundido de un ratón, cortando secciones coronales delgadas y montando estas secciones sobre un portaobjetos de vidrio, diseñado específicamente para adherirse firmemente al tejido. El segundo paso consiste en hervir los portaobjetos con el tejido y un tratamiento catiónico, y permitir un tiempo suficiente para el enfriamiento.

A continuación, tiña el tejido con anticuerpos primarios durante toda la noche. El paso final consiste en realizar la tinción con anticuerpos secundarios en el tejido al día siguiente durante al menos dos horas. Finalmente, visualice los diversos tipos celulares pro género en las distintas etapas de desarrollo durante la neurogénesis adulta del tejido hipocampal mediante microscopía de lapso de tiempo o microscopía confocal.

Hola, mi nombre es Hun Jo, becario posdoctoral, miembro del laboratorio del Dr. Ian John en la Clínica Mayo. Nuestro enfoque principal en el Laboratorio John es investigar el proceso de la neurogénesis en trastornos neurológicos y psiquiátricos. Nuestro objetivo final consiste en traducir con éxito estos conocimientos en aplicaciones terapéuticas. Nuestro procedimiento de recuperación de antígenos lo presentará Quam Hui, y hola John, de nuestro laboratorio.

La principal ventaja de nuestra técnica frente a los métodos existentes de inmunohistoquímica es que permite la visualización eficaz de tipos celulares distintos durante la neurogénesis hipocampal adulta. Estos tipos celulares, incluidas las células madre neurales precursoras que de otro modo serían difíciles de detectar, pueden etiquetarse y visualizarse eficientemente mediante nuestro método de recuperación de antígenos. Este método proporcionará información sobre el desarrollo y la regulación de las neuronas recién formadas durante la neurogénesis hipocampal adulta.

Para quienes estén interesados en el estudio de los trastornos mentales y su tratamiento farmacológico, nuestra recuperación de antígenos será útil para investigar el papel del desarrollo neuronal durante esta patogénesis. Comience el procedimiento colocando el cerebro de un ratón perfundido en formaldehído al 4 % en un tubo cónico de 10 mililitros durante la noche a cuatro grados Celsius, o durante al menos 12 a 24 horas, pero no más de 36 horas para lograr una fijación completa. Tras la fijación nocturna, retire el PFA y deje el cerebro en el tubo cónico.

A continuación, enjuague el cerebro con sacarosa al 30 % para eliminar cualquier resto de PFA y deseche la sacarosa. Luego, llene nuevamente el tubo con sacarosa al 30 % y déjelo a cuatro grados Celsius hasta que el cerebro se hunda hasta el fondo del tubo. Posteriormente, corte el hipocampo en secciones cerebrales de 40 micrómetros utilizando un microtomo.

Conservar las secciones en la solución anticongelante hasta que estén listas para la inmunohistoquímica. A continuación, montar los cortes en portaobjetos microscópicos diseñados específicamente para adherir fuertemente al tejido. Tras montar el tejido, dejar secar los portaobjetos durante aproximadamente 10 minutos.

Se puede acelerar el secado si se colocan los portaobjetos apoyados sobre una superficie vertical encima de una toalla de papel para asegurar la eliminación completa de los productos químicos anteriores. Una vez que los portaobjetos estén secos, lávelos con PBS tres veces durante cinco minutos cada vez. Luego, déjelos secar nuevamente.

En este procedimiento, prepare la solución para hervir el tejido según la descripción en el manuscrito adjunto. A continuación, hierva la solución durante cinco minutos en un microondas estándar con la configuración habitual. Una vez finalizada la ebullición, retire cuidadosamente el recipiente del microondas.

Después de eso, transfiera los portaobjetos secos a la solución. Asegúrese de que el lado con las secciones del hipocampo esté completamente expuesto a la solución. Si es posible, coloque los portaobjetos en un ángulo contra las paredes del recipiente y coloque otros portaobjetos alrededor de ellos.

Luego hierva la mezcla con los portaobjetos durante siete minutos en el microondas con la configuración estándar. Mientras tanto, llene dos cubetas de hielo hasta la mitad con hielo. Una vez finalizada la ebullición, retire el recipiente del microondas y colóquelo dentro de una de las cubetas de hielo.

Vierta el resto del hielo del otro cubo alrededor del recipiente y cúbralo completamente. Después, déjelo reposar durante una hora. Retire las laminillas del recipiente.

Lávelos tres veces con tampón TBST durante cinco minutos cada vez. A continuación, seque las laminillas en la oscuridad durante cinco a 10 minutos o hasta que estén completamente secas. Mientras tanto, prepare una cámara con DDH₂O para la tinción con el anticuerpo primario durante la noche.

Una vez que las láminas estén secas, dibuje un contorno alrededor de las secciones de tejido utilizando un rotulador hidrófobo. Este contorno actúa como una barrera para evitar que la mezcla de anticuerpos se extienda. Luego, prepare la mezcla del anticuerpo primario en T-B-S-T-T.

Coloque los portaobjetos secos sobre la platina en la cámara de tinción. Añada lentamente 500 microlitros del anticuerpo primario para cubrir toda la superficie. Posteriormente, cubra la cámara de tinción para bloquear la luz externa y déjela toda la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos cada vez con tampón TBST.

Después de eso, séquelos en la oscuridad. Ahora prepare la mezcla del anticuerpo secundario en T-B-S-T-T. Luego coloque las laminillas secas en la cámara de tinción.

Añada 500 microlitros del anticuerpo secundario. Cubra lentamente la cámara de tinción y manténgala alejada de la luz externa durante al menos dos horas a temperatura ambiente. Tras finalizar la tinción secundaria, lave los portaobjetos tres veces, cinco minutos cada vez, con tampón TBST. Seque los portaobjetos en la oscuridad tras el secado. Añada solución de montaje a los portaobjetos.

Cúbralos cuidadosamente con cubreobjetos para evitar la introducción de burbujas. Luego, mantenga las preparaciones en la oscuridad durante al menos dos horas antes del análisis subsiguiente y de realizar análisis de lapso de tiempo o análisis de convo en el tejido teñido. La neurogénesis hipocampal adulta se muestra a lo largo de la zona subgranular del giro dentado.

Una célula madre tipo uno, similar a una célula glial radial activada, atraviesa fases distintas mientras se diferencia, madura e integra funcionalmente con una morfología elaborada en el circuito neuronal. Cada una de las fases y los tipos celulares respectivos puede identificarse según su expresión de una combinación de marcadores. MCM dos es un marcador de proliferación que se expresa en todos los tipos de células progenitoras mitóticas, mientras que nein se expresa en células madre similares a gliales radiales y no radiales.

Con la diferenciación de los progenitores tipo II A, primero se desactiva la expresión anidada. La expresión de anti-TBR2 aumenta en el progenitor posmitótico, mientras que se pierde la expresión de MCM2, y las expresiones de DCX y NEUROD1 determinan la migración y maduración hacia una neurona funcional. Esta es una imagen confocal representativa de tinción púrpura para MCM2, verde para nestina y roja para DAPI.

Las imágenes ampliadas en los recuadros muestran un progenitor radial GL similar al tipo que expresa nestina, MCM2 y dpi. Aquí se presenta una imagen confocal representativa con MCM2 en azul, TBR2 en rojo, DCX en verde y dpi en gris. En las imágenes ampliadas en los recuadros se observa la tinción característica de un progenitor tipo B tipo 2, que expresa MCM2, TBR2, DCX y dpi.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar tres aspectos. Primero, utilizar tejido bien perfundido y fijado con el grosor coronal adecuado. Segundo, montar el tejido plano sobre los portaobjetos y evitar cualquier daño durante este proceso.

Y finalmente, tres, permitiendo tiempo suficiente para la ebullición y el posterior enfriamiento durante la recuperación del antígeno. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la reconstrucción confocal de tejidos y experimentos de comportamiento, con el fin de responder preguntas adicionales sobre cómo las neuronas recién formadas podrían integrarse en la circuitería del hipocampo y contribuir a la función cognitiva. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la recuperación de antígenos en su tejido hipocampal para visualizar de manera más efectiva los tipos celulares presentes que dan origen a nuevas neuronas durante la neurogénesis hipocampal.