Un protocolo rápido para la integración de matrices extracromosómicas con alta tasa de transmisión en el genoma de C. elegans

El objetivo general de este procedimiento es integrar arrays transgénicos extracromosómicos en el genoma de Caenorhabditis elegans mediante irradiación con luz ultravioleta. En primer lugar, seleccione la línea transgénica con la tasa de transmisión más alta posible, idealmente mayor al 80 %. A continuación, irradie con luz ultravioleta las larvas transgénicas L4 seleccionadas y aísle cuatro animales transgénicos fluorescentes F2 de cada placa F1 seleccionada. Luego, examine las placas F2 en busca de descendencia transgénica fluorescente al 100 %.

F tres gusanos. Finalmente, seleccionar animales fluorescentes de la generación F tres puede mostrar la herencia del transgén al 100 %. Este enfoque experimental es especialmente adecuado para líneas transgénicas que transmiten arrays cromosómicos extra a una alta tasa.

La procedura será demostrada por Stephanie Belman, una técnica de nuestro laboratorio. Comience con 500 placas de Petri grandes que contengan medio de crecimiento para nematodos. Siembre cada placa con 0,3 mililitros de una cultivo saturado de Escherichia coli.

Cultivo OP 50. Evalúe la tasa de transmisión de la línea transgénica que se integrará para cada línea transgénica. Seleccione 10 adultos fluorescentes por gravedad y colóquelos en 10 placas de cultivo separadas bajo un estereoscopio fluorescente para cultivo.

Los animales en un incubador de nematodos ajustado a una temperatura permisiva para la reproducción del fondo genético. Monitoree la descendencia cada día para evaluar en qué estadio de desarrollo se expresa el marcador de coinyección y puede observarse mejor mediante microscopía fluorescente. Evalúe la tasa de transmisión en la descendencia determinando el porcentaje de descendientes fluorescentes.

Para la integración del transgén, seleccione la línea transgénica con la tasa de transmisión más alta. Obtenga una población de animales transgénicos sincronizados en el estadio larval L4. Para la integración, seleccione 30 adultos GRA fluorescentes y colóquelos en cinco placas de cultivo.

Después de que los gusanos hayan puesto huevos durante tres a cuatro horas a 15 grados Celsius, verifique la presencia de al menos 30 huevos por placa y luego elimine los adultos de las placas. Cultive los animales en un incubador de gusanos hasta que la descendencia alcance la etapa larval L4. Coloque cada placa que contenga de 15 a 20 animales transgénicos fluorescentes en etapa L4 en un cruzador de UV con las tapas retiradas e irradie los gusanos para recuperación. Incube los gusanos irradiados durante la noche a 15 grados Celsius.

Verifique el número de animales que están vivos en nuestras manos. Una tasa de supervivencia de aproximadamente 80 a 90 % se adapta para una irradiación eficiente. Cultive los animales irradiados a 15-25 grados Celsius hasta que la descendencia haya alcanzado la etapa de desarrollo, lo que permitirá observar la expresión del marcador de coinyección.

Transferir un solo animal F1 fluorescente a placas de cultivo separadas. Mantener estas placas F1 a 15-25 grados Celsius hasta que la descendencia alcance una etapa adecuada para la observación de animales F2 fluorescentes, dependiendo del marcador de co-utilizado. En este caso particular, observamos los gusanos en estado adulto y descartamos todas las placas F1 que exhibieran, bien un número nulo de descendientes, lo que indica que el animal F1 era estéril o murió, bien dos o solo unos pocos animales F2 fluorescentes, lo que indica que el animal F1 no transmitió el transgén a la tasa esperada.

Seleccione cuatro animales transgénicos fluorescentes F2 de cada placa F1 seleccionada. Al utilizar transgenes fluorescentes, elija gusanos F2 con un alto nivel de fluorescencia, ya que esto podría indicar que estos animales son homocigotos para el arreglo integrado. Tenga en cuenta que al seleccionar animales F2, es fundamental no transportar huevos ni larvas para evitar falsos negativos en el siguiente paso.

Después de cultivar los animales F2, examine las placas F2 en busca de gusanos transgénicos F3 con fluorescencia al 100 %. La selección es bastante rápida, ya que la presencia de un solo gusano no fluorescente indica que la placa debe descartarse. Seleccione ocho animales F3 fluorescentes de las placas elegidas para confirmar la herencia del transgén al 100 %. Si es posible, conserve varias cepas transgénicas integradas independientes.

Se realizaron integraciones de transgenes en dos líneas diferentes, transmitiendo matrices extracromosómicas aproximadamente con la misma frecuencia. Mediante los protocolos estándar y mejorado, se optimizó en el protocolo mejorado el tiempo y el número de placas necesarios por línea integrada. A continuación, probamos la hipótesis de que una mayor tasa de transmisión del transgen en una línea no integrada facilita la integración del transgen en el genoma.

Se integró un transgén particular en líneas que se transmitían a diferentes tasas utilizando el protocolo mejorado para la línea con mayor transmisión. Se recuperaron tres líneas integradas a partir de solo 90 animales F1 seleccionados, mientras que para la línea transgénica que se transmitía entre un 50 y un 60 %, se recuperó una línea integrada a partir de 110 animales F1 seleccionados. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar diferentes métodos para responder preguntas adicionales, como determinar la expresión génica, el patrón y la regulación, la localización proteica y la sobreexpresión proteica, o el desarrollo de marcadores subcelulares.