Un protocolo rápido para la integración de matrices extracromosómicas con alta tasa de transmisión en el genoma de C. elegans

El objetivo general de este procedimiento es integrar matrices extracromosómicas transgénicas en el genoma de Serratus elegance mediante irradiación ultravioleta. En primer lugar, seleccione la línea transgénica con la tasa de transmisión más alta posible, idealmente superior al 80%Luego irradie con UV las cuatro larvas transgénicas seleccionadas y seleccione cuatro de los F transgénicos fluorescentes dos animales de cada placa F1 seleccionada. A continuación de la pantalla, la F dos placas para transgénicos 100% fluorescentes.

F tres gusanos. En última instancia, la elección de un animal fluorescente de la generación F tres puede mostrar el 100% de la herencia del transgén. Este enfoque experimental es muy adecuado para líneas transgénicas que transmiten matrices de cromosomas adicionales a una tasa alta.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Stephanie Belman, una técnica de nuestro laboratorio. Comience con 500 placas de Petri grandes que contienen el crecimiento de nematodos. Mediana: Siembra cada plato con 0,3 mililitros de isia coli saturada.

OP 50 cultura. Evaluar la tasa de transmisión de la línea transgénica a integrar para cada línea transgénica. Elija 10 adultos fluorescentes de gravedad en 10 placas de cultivo separadas bajo un cultivo estereoscópico fluorescente.

Los animales en una incubadora de lombrices se colocan a una temperatura permisiva para la reproducción del fondo genético. Monitoree la progenie todos los días para evaluar en qué etapa de desarrollo se expresa el marcador de inyección de co y se puede observar mejor mediante oscopia fluorescente. Evaluar la tasa de transmisión de la progenie determinando el porcentaje de progenie fluorescente.

Para la integración del transgén, seleccione la línea transgénica con la tasa de transmisión más alta. Obtener una población de animales transgénicos sincronizados en la etapa larvaria L cuatro. Para la integración, elija 30 adultos GRA fluorescentes en cinco placas de cultivo.

Después de que los gusanos hayan puesto huevos durante tres o cuatro horas a 15 grados centígrados, verifique la presencia de al menos 30 huevos en placa y luego elimine a los adultos de las placas y cultive a los animales en una incubadora de lombrices hasta que la progenie alcance la etapa larvaria L cuatro. Coloque cada placa que contenga de 15 a 20 animales transgénicos fluorescentes L cuatro animales en un reticulante UV con las tapas quitadas, irradie los gusanos para su recuperación. Incubar los gusanos irradiados durante la noche a 15 grados centígrados.

Comprobar el número de animales que están vivos en nuestras manos. Una tasa de supervivencia de alrededor del 80 al 90% se adapta para una irradiación eficiente. Cultive los animales irradiados a 15 a 25 grados centígrados hasta que la progenie haya alcanzado la etapa de desarrollo, lo que permite la observación de la expresión del marcador de inyección de co.

Transfiera animales F1 fluorescentes individuales a placas de cultivo separadas. Mantenga estas placas F1 a una temperatura de 15 a 25 grados centígrados hasta que la progenie alcance una etapa apropiada para la observación de dos animales fluorescentes F, dependiendo del comarcador utilizado. En este caso particular, observamos que los gusanos cuando son adultos descartan todas las placas F1 que exhiben una, ninguna progenie, lo que indica que el animal F1 era estéril o murió, o dos no, o solo unos pocos animales F fluorescentes, lo que indica que el animal F1 no transmitió el transgén a la velocidad esperada.

Identifique cuatro F transgénicos fluorescentes de cada placa F1 seleccionada. Cuando se utilizan transgenes fluorescentes, se deben elegir dos gusanos F con un alto nivel de fluorescencia, ya que esto podría indicar que estos animales son homocigotos para la matriz integrada. Tenga en cuenta que al elegir F dos animales, es fundamental no llevar huevos o larvas para evitar falsos negativos en el siguiente paso.

Después de cultivar el F, dos animales tamizan las dos placas F para detectar tres gusanos transgénicos 100% fluorescentes. El cribado es bastante rápido, ya que la presencia de un solo gusano no fluorescente indica que la placa debe desecharse, seleccione ocho animales fluorescentes F tres de las placas seleccionadas para confirmar la herencia del 100% del transgén. Si es posible, mantenga varias cepas transgénicas integradas independientes.

Se realizaron integraciones de transgenes en dos líneas diferentes, transmitiendo matrices cromosómicas adicionales aproximadamente a la misma frecuencia. Utilizando el estándar y los protocolos mejorados, el tiempo y el número de placas necesarias por línea integrada se optimizan en el protocolo mejorado. A continuación, probamos la hipótesis de que una mayor tasa de transmisión del transgén en una línea no integrada facilita la integración del transgén en el genoma.

Un transgén en particular se integró en líneas que transmitían a diferentes velocidades utilizando el protocolo mejorado para la línea transmisora más alta. Se recuperaron tres líneas integradas de sólo 90 animales F1 seleccionados, mientras que para la línea transgénica que transmitía entre el 50 y el 60%, se recuperó una línea integrada de 110 animales F1 seleccionados. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar diferentes métodos para responder a preguntas adicionales como la determinación de la expresión génica, el patrón y la regulación, la localización y la sobreexpresión de proteínas, o el desarrollo de marcadores subcelulares.