Name: Multiplex PCR Ensayo para la tipificaci (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprende a realizar un ensayo de PCR multiplex para tipificar SCCmec en cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA). Este método simplifica la caracterización bacteriana en laboratorios clínicos.

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Agradecemos a T. Ito, K. Hiramatsu, R. Daum, H. de Lencastre y D. Coleman por el amable regalo de algunas cepas de referencia utilizadas en este estudio. Este trabajo fue financiado en parte por el Centro para la Resistencia a los Antimicrobianos (CAR), los Servicios de Salud de Alberta-Calgary/Servicios de Laboratorio de Calgary/Universidad de Calgary.

Estos procedimientos deben llevarse a cabo en un laboratorio de nivel de bioseguridad certificada 2. Equipo de protecci

<ol><li>IWG-SCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+%28SCCmec%29%3A+guidelines+for+reporting+novel+SCCmec+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).</li>
<li>Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Reporting+Novel+mecA+Gene+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).</li>
<li>Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+new+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+clones+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).</li>
<li>Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+multiplex+PCRs+for+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+assignment%3A+rapid+identification+system+for+mec%2C+ccr%2C+and+major+differences+in+junkyard+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).</li>
<li>Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+rapid+identification+of+structural+types+and+variants+of+the+mec+element+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (7), 2155-2161 (2002).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+to+the+multiplex+PCR+strategy+for+assignment+of+mec+element+types+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+subtyping+the+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+IV+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%3A+%27SCCmec+IV+multiplex%27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+multiplex+PCR+assay+for+characterization+and+concomitant+subtyping+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+multiplex+PCR+assay+for+typing+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Enhanced multiplex PCR assay for typing of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Molecular and Cellular Probes. 26 (5), 218-221 (2012).</li>
<li>de Lamballerie, X., Zandotti, C., Vignoli, C., Bollet, C., de Micco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+microbial+DNA+extraction+method+using+%22Chelex+100%22+suitable+for+gene+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A one-step microbial DNA extraction method using "Chelex 100" suitable for gene amplification.</a> Research in Microbiology. 143 (8), 785-790 (1992).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+assay+to+facilitate+identification+of+the+recently+described+Staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII.</a> Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type%2C+tentatively+designated+type+VIII%2C+harboring+class+A+mec+and+type+4+ccr+gene+complexes+in+a+Canadian+epidemic+strain+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).</li>
</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

El ensayo de PCR multiplex descrito aquí proporciona un método simple y confiable para clasificar los tipos y subtipos principales de SCCmec I-V en estafilococos, con discriminación simultánea de MRSA de MSSA. El ensayo es robusto, se realiza convenientemente en una sola reacción de PCR y los resultados son fáciles de interpretar. El ensayo tiene limitaciones en el sentido de que se dirige a loci individuales dentro de cada tipo deSCC mec , pero no ofrece una tipificación completa de ccr y ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.

Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) ha adquirido e integrado en su genoma un elemento gen

<table><tbody><tr><td>Agar tríptico de soja</td><td>Fisher (BD)</td><td>CA90002-700 (236920)</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada estéril</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq: incluye tampón de PCR 10x y 50 mM de MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>10966-034</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP</td><td>Life Technologies</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Life Technologies</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>1Kb+ Escalera de ADN Vida</td><td> Tecnologías</td><td>10787-026</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubos de microcentrífuga </td><td>VWR (Axygen Scientific)</td><td>10011-700</td><td></td></tr><tr><td>Varillas de cultivo</td><td>VWR</td><td>CA10805-018</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR</td><td>Diamed</td><td>AD0210-FCN (nuevo #: DIATEC420-1250)</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5417c</td><td></td></tr><tr><td>Bloque calefactor</td><td>VWR</td><td>13259-030 / 13259-286</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Applied Biosystems (2720)</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de electroforesis de gel sumergible horizontal con molde de gel</td><td>BioRad</td><td>170-4469</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación</td><td>BioRad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>Agitador basculante</td><td>VWR</td><td>40000-300</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Generador de imágenes Gel Doc System</td><td>BioRad</td><td>1708170</td><td></td></tr></tbody></table>

multiplex pcr ensayo para la tipificaci

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Este M-PCR actualizado es capaz de determinar (clasificar) los tipos I-V de SCCmec, así como los principales subtipos de SCCmec IV. El ensayo tiene como dianas loci únicos y específicos de SCCmec I, II, III, IVa, IVb, IVc, IVd, IVE y V, con detección simultánea del gen mecA. También es posible una identificación tentativa de SCCmec VI y VIII, aunque se requeriría una prueba adicional para confirmarla. Figura 3 ilustra representaciones típicas de SCCmec</em...

Demostramos un ensayo de PCR multiplex simple para el cribado y tipaje rápidos de los tipos I-V del cromosoma de casete estafilocócico (SCCmec) para el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, y proporcionamos algunos de los pasos vitales y matices de procedimiento que lo hacen exitoso para adaptar este ensayo a laboratorios individuales.

Multiplex PCR Ensayo para la tipificaci

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar el tipo de MEC SCC de aislamientos de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina o MRSA, utilizando un ensayo de PCR múltiple. Esto se logra primero aislado el ADN de las cepas, mediante una técnica de extracción rápida y sencilla que implica el calentamiento de las células bacterianas en agua. El segundo paso consiste en realizar un ensayo de PCR múltiple con el fin de amplificar dianas específicas para cada uno de los tipos de MEC SE.A continuación, los productos de PCR se separan mediante electroforesis en gel AROS. El último paso consiste en teñir el gel para la visualización del ADN y el análisis de datos. En última instancia, la combinación única de productos de PCR específicos obtenidos con este ensayo de PCR múltiple se utiliza para determinar los tipos de cmec-SE de los aislamientos de MRS A. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los esquemas tradicionales de tipificación S CEC, que dirigen complejos genéticos individuales de CCR y MEC y requieren múltiples tubos de PCR individuales, es que este proceso simplifica enormemente la carga de trabajo y puede realizarse en un solo tubo de PCR.Estos procedimientos deben realizarse en un laboratorio certificado de nivel dos de bioseguridad. Debe utilizarse equipo de protección personal adecuado en todo momento el día anterior a la realización de la PCR. Seleccione una colonia individual de MRSA a partir de una placa fresca de cultivo nocturno utilizando un asa de cultivo estéril y prepare una siembra abundante de las bacterias en una placa de agar de soya tripticasa.Se pueden estriar múltiples muestras en una sola placa e incubarla durante la noche a 37 grados Celsius. Añada 75 microlitros de agua destilada estéril a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Utilizando un hisopo de cultivo estéril.Tome una pequeña cantidad de bacterias de la siembra densa de la noche anterior. Agite las bacterias en el agua estéril para preparar una solución turbia. Repita este proceso para todas las muestras.Incube los tubos en un bloque de calor seco ajustado a 95 grados Celsius durante 10 minutos para lisar las bacterias y liberar el ADN. Retire las muestras del bloque de calor y déjelas reposar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Centrifugue las muestras a 13.000 RPM durante un minuto.La muestra resultante tiene un sedimento de restos celulares y un sobrenadante claro que contiene el ADN. Para preparar la PCR, retire los reactivos de PCR, incluyendo tampón 10 XPCR, cloruro de magnesio 50 milimolar, DTPs y cebadores, del congelador a menos 20 grados Celsius y déjelos descongelar a temperatura ambiente sobre la bancada limpia de PCR, donde no se permite la presencia de bacterias ni ADN. En este momento se pueden preparar y etiquetar tubos de PCR de 0,2 mililitros.Una vez descongelado, agite brevemente por vórtex para mezclar todos los reactivos y luego combínelos según se indica en el protocolo escrito en forma tabular. Es importante utilizar la ADN polimerasa Platinum Taq, ya que se ha encontrado que influye en el éxito de la reacción. Después de agitar la mezcla maestra por vórtex, distribúyala en los tubos individuales de PCR, cierre todos los tubos de PCR y llévelos al banco de trabajo general.Agregue la plantilla a los tubos de PCR pipeteando dos microlitros del sobrenadante claro de las muestras bacterianas previamente preparadas. Trasládese al lugar designado para la amplificación antes de colocar los tubos en el termociclador y ejecutar la reacción según se indica en el protocolo escrito. Trabaje en un área dedicada para electroforesis en gel con 2,5 gramos de agarosa por 100 mililitros de tampón 0,5 XTBE en un matraz Erlenmeyer de vidrio.Cubra el matraz con papel de plástico y hierva la solución en un microondas hasta que se disuelva completamente. Un gel al 2,5 % puede desbordarse rápidamente. Por lo tanto, detenga el microondas y agite la solución regularmente.Enfríe los geles hasta que estén lo suficientemente fríos para tocarlos girándolos bajo agua fría o dejándolos reposar sobre la bancada durante cinco minutos. Vierta los geles en la bandeja de vertido después de retirar los tubos del ciclador térmico PCR. Prepare las muestras añadiendo dos microlitros de colorante de carga de seis XDNA a cada muestra.Cargue de cinco a 10 microlitros de muestra por pocillo en el gel. Una escala de ADN de un KB plus o de 100 pares de bases es adecuada para los tamaños de banda esperados. El bromuro de etidio puede añadirse al gel antes de verterlo o, alternativamente, el gel puede teñirse en un baño de bromuro de etidio antes de visualizarse.Coloque el gel terminado en una solución de 0,5 microgramos por mililitro de bromuro de etidio y agua destilada, y mezcle suavemente en un agitador durante 10 minutos. Transfiera el gel a un recipiente limpio y sumérjalo en agua destilada durante 10 minutos adicionales. Aquí se muestra un gel representativo que demuestra los productos de PCR esperados para todas las cepas representativas de los tipos SEC MEC uno a seis y ocho, así como los subtipos A a F del SEC MEK cuatro. Para una cepa típica de SEC MEK uno se esperan dos bandas.La banda específica de tipo uno a 613 pares de bases, así como la banda de control mec a 147 pares de bases. Se muestran tres cepas representativas de SEC MEK dos, incluyendo la cepa prototípica de tipo dos N tres 15 y los tipos dos A y dos B menos prevalentes. Para clasificar una cepa como SEC MEK dos, deben estar presentes dos bandas, incluyendo el blanco del locus de tipo dos a 128 pares de bases y el control Meca. Se muestran en el gel dos cepas representativas de SEC MEK tres, incluyendo la cepa prototípica SEC MEK tres 85 2 0 8 2 y la variante menos frecuente tipo tres A de la cepa JCSC dos 90. SEC MEC tres se identifica en función de la presencia de dos productos de PCR, incluyendo el blanco específico de tipo tres a 257 pares de bases y el blanco de control Mecca.El SEC MEC tres dominante también será positivo para el blanco de mercurio a 280 pares de bases, que se encuentra en un elemento SEC adyacente y sirve para distinguirlo del SEC MEC tres A cinco menos común. Se muestran elementos representativos del SEC MEC cuatro, incluyendo los tipos cuatro A, cuatro B, cuatro C, cuatro D, cuatro E y cuatro F. A diferencia del SC MEK uno al tres, no existe un único blanco presente en todos los subtipos de SCC MEK cuatro aparte de meck A. La cepa representativa de SCC MEK cuatro E se identifica en función de la presencia de la banda del tipo cuatro E, así como del producto CCR AB cuatro, que se encuentra en un elemento accesorio adyacente, y del producto del tipo cuatro C, que está presente porque el SEC MEK cuatro E comparte la misma región J uno que el SE Cmk cuatro. El SCC MEK cuatro F es similar al SEC MEK cuatro E en que comparte la misma región J tres y, por consiguiente, es positivo para el blanco cuatro E, así como positivo para el blanco CCR AB cuatro debido a un elemento accesorio adyacente. Sin embargo, el S Cmk cuatro F puede distinguirse del S CMK cuatro E en que carece del blanco del tipo cuatro C.Un CMK-SE típico tipo cinco habría mostrado dos productos de PCR en el gel: la banda específica del tipo cinco a 325 pares de bases y el control ME a 147 pares de bases. Finalmente, aunque el objetivo de este ensayo no era proporcionar una identificación definitiva de SEC MEK seis u ocho, se incluyeron cepas representativas de ambos tipos, ya que un patrón de PCR específico ofrece evidencia sugestiva de la presencia de estos tipos.Además del blanco Meck A, se esperaría que el representante SEC MEK seis produjera un producto positivo de CR AB cuatro de 106 pares de bases, ya que este es su tipo principal de complejo CCR. El representante SEC MEC ocho también sería positivo para MEC A a 147 pares de bases y para C-C-R-A-B cuatro a 106 pares de bases, y se distinguiría del SEC MEK seis en función de un producto específico del tipo dos positivo, que resulta de poseer la misma región J dos SEC MEK dos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que, debido a la naturaleza sofisticada del ensayo y al gran número de cebadores presentes en la reacción, existe la posibilidad de dificultades.Al adaptar esto a laboratorios individuales, prestar mucha atención a ciertos aspectos clave, como la preparación de la plantilla de ADN y la marca de los reactivos para PCR, facilitará en gran medida este objetivo.

multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec

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