Identificación de poblaciones específicas de neuronas sensoriales para el estudio de los canales iónicos expresados

El objetivo general de este procedimiento es identificar las neuronas aferentes mediante el marcaje de colorante retrógrado y estudiar los canales iónicos en estas neuronas mediante electrofisiología e inmunoquímica de patch clamp. Esto se logra inyectando primero DAI en el tejido objetivo para etiquetar las neuronas aferentes inervantes. El segundo paso es aislar las neuronas aferentes de los ganglios de la raíz dorsal.

A continuación, las neuronas marcadas se fijan para registrar los canales iónicos activados, el paso final es identificar los canales iónicos expresados en las neuronas marcadas mediante inmunoquímica. En última instancia, utilizando una combinación de parche, pinza e inmunoquímica, podemos identificar el patrón de expresión, así como las propiedades funcionales de los canales iónicos en las neuronas aferentes. La principal ventaja de este método frente a otros métodos existentes es que es un método no invasivo y el DAI que utilizamos, el DAI I es conocido por su rápida absorción por las terminales neuronales.

Falta de transferencia entre neuronas y retenciones a largo plazo dentro de las neuronas que inyectamos. Stephanie, técnica de investigación de nuestro laboratorio para la inyección de tinte, demostraremos el procedimiento. Primero, afeita el pelo sobre el área de la pantorrilla en ambas patas de la rata anestesiada con una navaja de afeitar eléctrica.

A continuación, llene una jeringa estéril de un CC con 200 microlitros de solución de Dai al 1,5%. Inserte lentamente la aguja paralela al eje largo de cada músculo gastrointestinal e inyecte 100 microlitros de dai en el músculo antes de retirar la aguja del músculo. Tire hacia atrás del émbolo de la jeringa para asegurarse de que el tinte ya no fluya por la punta.

Espere 10 segundos y luego retire la aguja del músculo. Se necesitan de cuatro a cinco días para que la distribución del tinte se prepare para la disección. Coloque un vaso de precipitados con 10 mililitros de HBSS, una placa de Petri de 35 milímetros y una placa de Petri de 100 milímetros en hielo.

A continuación, pesa siete miligramos de colagenasa, un miligramo de ADN y 10 miligramos de tripsina precalienta, agita un baño de agua a 37 grados centígrados y calienta un tubo de centrífuga de 15 mililitros que contiene 10 mililitros de EBSS en el baño. Después de sacrificar a la rata antes de la disección, corta rápidamente la piel del lomo del animal. Luego, retire el tejido conectivo y muscular a lo largo de la columna vertebral para una mejor exposición.

Posteriormente, extirpar la sección lumbar de la columna vertebral. A continuación, coloque la columna vertebral aislada en la placa de Petri de 100 milímetros. Aplique una solución fría de HBSS con una pipeta estéril para pastos para mantener la preparación húmeda y fría.

Corta los músculos de los lados de la columna vertebral. Realice una laminectomía dorsal mediante el uso de rongeurs o tijeras para extraer suavemente el hueso y cerrar los huecos que contienen los ganglios de la raíz dorsal. Repetidamente. Aplique HBSS helado durante este procedimiento.

Bajo el microscopio, aísle el DRG cortando los nervios periféricos y centrales, dejando uno o dos milímetros de nervio para facilitar el manejo de los ganglios. A continuación, coloque el DRG aislado en la placa de Petri de 35 milímetros que contiene un tampón HBSS helado. Repita los procedimientos hasta que se hayan aislado todos los DRG L cuatro y L cinco.

Retire el exceso de nervios y vasos sanguíneos con microtijeras y fórceps. Corte el DRG para una mejor exposición a las enzimas, pero no devangue el DRG para la disociación de las neuronas DRG. Agregue las enzimas al medio EBSS tibio, luego vórtice para disolver y filtrar la esterilización.

A continuación, coloque todo el DRG en la solución enzimática con una cabeza de tubería de pasto estéril. Después de eso, burbujee el matraz con un 95% de oxígeno y un 5% de CO2 durante 60 segundos antes de tapar herméticamente el matraz. A continuación, incubar el matraz en el baño de agua agitado a 37 grados centígrados durante 60 minutos a 240 RPM.

Al final de la incubación vigorosamente. Agite el matraz 50 veces para disociar el DRG en condiciones estériles. Agregue cinco mililitros de MEM plus al matraz para detener las actividades enzimáticas.

Transfiera el contenido del matraz a un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros y centrifugue a 16 veces G durante seis minutos. Después, retira y desecha el sobrenadante. Añada cinco mililitros de MEM plus al tritrato de la muestra suavemente con una pipeta.

Para romper el pellet, repita el paso de centrifugación, retire y deseche el sobrenadante y agregue 500 microlitros de MEM más tritrato suavemente con la punta de pipeta de un mililitro en una pipeta para hacer una suspensión celular. Después de eso, coloque un cubreobjetos de vidrio recubierto de polilisina en un plato vacío y estéril de 35 milímetros. A continuación, añade una gota de la suspensión de celdas en el centro del cubreobjetos.

Repita este procedimiento hasta que se agote la solución celular. Coloque las placas de 35 milímetros en una incubadora de 37 grados Celsius y 5% de CO2 durante una hora para permitir que las neuronas se adhieran a los cubreobjetos después de una hora. Agregue dos mililitros adicionales de medio en cada plato y devuélvalos a la incubadora para realizar el registro de la pinza de parche.

En primer lugar, identifique las neuronas DRG marcadas con colorante utilizando un microscopio con epifluorescencia. A continuación, llene el electrodo de vidrio con solución interna. Golpee suavemente para eliminar las burbujas atrapadas.

A continuación, coloque el electrodo en el portaelectrodos. Baje el electrodo a la celda usando un micro manipulador. Una vez que el electrodo toque la celda, aplique una succión suave a través del tubo de succión hasta que se forme un sello hermético.

A continuación, fije la tensión de la membrana al potencial de retención deseado. Obtenga la configuración de abrazadera de parche de celda completa aplicando una succión más fuerte. Para quitar el parche de membrana en la punta del electrodo, una vez que se haya establecido la configuración de la pinza del parche de celda completa, inicie el registro.

En este procedimiento, fije las neuronas en los cubreobjetos con 4% de formaldehído durante una hora. A continuación, perme las neuronas con 2%tween 20 en PBS durante 10 minutos. A continuación, incube las células en solución de bloqueo durante una hora.

Las células de prueba se incuban en la solución bloqueante más el anticuerpo primario durante la noche. El conjunto de neuronas de control se deja incubar durante la noche en una solución de bloqueo sin ningún anticuerpo primario. Al día siguiente, lavar los cubreobjetos con tampón PBS tres veces durante cinco minutos cada uno, seguidos de dos lavados de cinco minutos cada uno con 1%tween 20 para eliminar el anticuerpo primario no unido.

A continuación, incube los cubreobjetos de prueba y control con el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia adecuado durante 30 minutos, que se une al anticuerpo primario para permitir la visualización. Después de eso, lave los cubreobjetos con PB S3 varias veces durante cinco minutos cada uno para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios. A continuación, monte los deslizadores de la cubierta en una corredera de vidrio limpio utilizando medios de montaje.

A continuación, aplica un esmalte de uñas transparente en el borde del cubreobjetos para fijarlo en su lugar. Una vez secas, visualice las neuronas y capture imágenes utilizando el software que acompaña al microscopio de fluorescencia. Esta es una representación de la inyección de Dai en el músculo gastrointestinal y el transporte retrógrado del músculo al DRG.

Los DRG L four y L five están etiquetados aquí. Las neuronas aferentes se muestran en la imagen de campo claro y esta imagen fluorescente muestra una neurona aferente muscular marcada con tinte. Este histograma muestra la intensidad fluorescente DII de las neuronas sensoriales.

El pico grande proviene de neuronas no marcadas y está equipado con una ecuación gaussiana para determinar la intensidad media y la desviación estándar. La línea vertical discontinua representa el umbral para el etiquetado DAI. El histograma comprende datos de 1047 neuronas, de las cuales 167 están marcadas con dai.

Aquí hay una neurona aferente muscular representativa con un buen control del voltaje de la membrana. Las corrientes de sodio a menos 20, menos 10 y cero milivoltios se muestran a la izquierda y la relación de voltaje de corriente se muestra a la derecha. Al intentar este procedimiento, es importante recordar diseccionar rápida pero suavemente los DRG y mantener la preparación húmeda repetidamente en el código de hielo hbss.

Siguiendo este procedimiento, se pueden etiquetar e identificar otras neuronas eferentes para comprender su papel en la fisiología.