Name: MicroRNA In situ La hibridación de los tejidos del riñón y fijados con formalina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-30T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Aprende hibridación in situ colorimétrica para detectar microRNAs en secciones renales fijadas con formalina. Este método permite localizar y cuantificar la expresión de microRNAs en tejido renal con alta sensibilidad.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos otorga HL082798 y HL111580.

1. Secciones de tejido de riñón <ol><li> Fijado en formol (10%) secciones de riñón incluidas en parafina se cortan en portaobjetos de microscopio con un espesor de 5 mm usando una Microm HM 355 S. Los portaobjetos se pueden almacenar durante varios meses antes del análisis. </li></ol> 2. Preparación de la Solución <ol><li> Preparar 1 l de 1x PBS en ddH2O en un frasco con tapa de rosca autoclavable. Llene otra botella con 1 l de ddH 2 O. Añadir 1 ml de DEPC a cada botella, tapar y agitar enérgicamente. Deje que las soluciones de reposar toda la noche a temperatura ambiente para destruir RNAsas y luego en autoclave. Añadir 400 ml de Tween-20 a 1 l de PBS 1x para hacer PBS-T. </li><li> Preparar tampón de proteinasa K (50 mMTris-HCl, pH 8,0 y 1 mM de CaCl2 en agua tratada con DEPC). </li><li> Preparar una solución de 0,2% de glicina en PBS-T. </li></ol> 3. Preparación de Tejido <ol><li> Preparar un gran volumen de tampón de hibridación (50-100 ml) compuesta de 50% de formamida, 5x SSC, 0,1% de Tween, 9,2mM de ácido cítrico para el ajuste a pH 6, 50 mg / ml de heparina, y 500 mg / ml de ARN de levadura en DEPC tratado ddH 2 O. Divida en alícuotas de 1 ml y se almacena a -80 º C. </li><li> Retire la parafina del tejido lavando 3 veces en xileno fresco durante 5 minutos cada uno. </li><li> Rehidratan las secciones de tejido por 5 min incubaciones en concentraciones decrecientes de etanol (100%, 75%, 50%, y 25%) en ddH 2 O. </li><li> Tratar las diapositivas con DEPC suficiente para cubrir completamente las secciones de tejido (aproximadamente 0,4-0,5 ml) durante 1 min. Hacer que los tejidos seguro no se sequen. </li><li> Enjuagar los portaobjetos en DEPC tratados PBS-T dos veces por 5 min, recogiendo el DEPC contiene residuos para su eliminación adecuada. Todos los reactivos deben ser DEPC tratados para eliminar RNAsas partir de este momento. </li><li> Precalentar la proteinasa K tampón y agregar proteinasa K a una concentración final de 10 mg / ml. Cubrir las secciones de tejido con solución de proteinasa K y se incuba a 37 º C durante 5 min. </li><li> Quite rápidamente las proteinassolución de e K y añadir 0,2% de glicina en PBS-T durante 30 segundos. </li><li> Enjuague las diapositivas en DEPC tratados PBS-T dos veces durante 30 segundos cada uno. </li><li> Fijar secciones recién hecho paraformaldehído al 4% durante 10 min. </li></ol> 4. Hibridación <ol><li> Añadir 50 l de tampón de hibridación (50% formamida, 5x SSC, 0,1% de Tween, ácido cítrico 9,2 mM para el ajuste a pH 6, 50 mg / ml de heparina, 500 g / ml de ARN de levadura) por sección de tejido y cubrir con RNasa HybriSlips libres cortar justo más grande que las secciones de tejido. </li><li> Secciones Prehybridize en horno de hibridación de humedad controlada durante 2 horas a temperatura de hibridación determinado para el 3 &#39;de la sonda marcada con digoxigenina (generalmente ADN Tm de la sonda -21 ° C, (es decir, 54 ° C durante miR-382, sonda de ADN Tm = 75 º C ), utilizando toallitas de laboratorio de tejido empapado en 50% formamide/50% SSC 5x para mantener la cámara de humidificado. </li><li> Diluir la sonda miRNA, control positivo (U6, ARN pequeño nuclear) y control negativo (revueltossecuencia) a 40 nM en tampón de hibridación (75 l de tampón se necesita por sección). </li><li> Calentar la sonda en tampón de hibridación a 65 º C durante 5 min. </li><li> Retirar los portaobjetos de horno de hibridación y retirar los cubreobjetos y exceso de tampón de hibridación de prehibridación. </li><li> Añadir 75 l de sonda que contiene tampón por sección de tejido, directamente al tejido. Cubra el tejido con HybriSlips lo suficientemente grandes para cubrir las secciones de tejido. </li><li> Mantener el nivel soporte de diapositivas, vuelva al horno de hibridación para la incubación durante la noche a temperatura desde el paso 4.2 (aproximadamente 16 horas). </li></ol> 5. Rigurosidad de lavado <ol><li> Añadir 200 l 2x SSC, se calienta a la temperatura de hibridación, justo por debajo de uno de los bordes de los cubreobjetos para ayudar a liberar el cubreobjetos del tejido. Quite el cubreobjetos por la inclinación de la diapositiva. </li><li> Lavar los portaobjetos en 200 l de formamida al 50%, 50% SSC 2x a 3x de temperatura de hibridación durante 30 min cada uno. </li><li> Enjuaguelas diapositivas 5x en PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min cada uno en un agitador orbital a baja velocidad. </li></ol> 6. Detección <ol><li> Incubar diapositiva en tampón de bloqueo (2% de suero de caballo o cabra, 2 mg / ml de BSA en PBS-T) durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador orbital a baja velocidad. </li><li> Diluir fragmentos anti-DIG-AP Fab en tampón de bloqueo a 1:100. Añadir 100 l por sección de tejido y cubrir con HybriSlips corte lo suficientemente grande como para cubrir la sección. </li><li> Incubar anticuerpo en una cámara humidificada a 4 ° C durante la noche (aproximadamente 16 horas). </li><li> Se lavan los portas en PBS-T 7x, durante 5 min cada uno en agitación a baja velocidad. </li><li> Lavar los portaobjetos en tampón de AP (100 mM Tris HCl pH 9,5, 50 mM de MgCl 2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween 20) 3x, durante 5 min cada uno. </li><li> Añadir la solución de NBT / BCIP de tampón AP (200 μl/10 ml de tampón) </li><li> Añadir 400-500 ml de solución de NBT / BCIP diluida a cada diapositiva para cubrir completamente todas las secciones de tejido. Desarrollar en un lugar oscuro, nivel, Humidifcámara de IED durante 4-5 horas. </li></ol> 7. Diapositivas de montaje <ol><li> Deshidratar secciones en concentraciones crecientes de etanol (25%, 50%, 75%, 100%) durante 5 min cada uno. </li><li> Incubar en 5x de xileno con el fin de borrar secciones. </li><li> Monte desliza en medio de montaje Permount y secar toda la noche. </li></ol>

<ol><li>Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+regulates+thedevelopment+of+nephrogenic+and+ureteric+compartments+in+the+mammalian+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney.</a> Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).</li>
<li>Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-apoptotic+protein+Bim+is+a+MicroRNA+target+in+kidney+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors.</a> J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).</li>
<li>Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-target+pairs+in+the+rat+kidney+identified+by+microRNA+microarray%2C+proteomic%2C+and+bioinformaticanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis.</a> Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).</li>
<li>Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+contribute+to+the+maintenance+of+cell-type-specific+physiological+characteristics%3A+miR-192+targets+Na%2B%2FK%2B-ATPase+%CE%B21%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).</li>
<li>Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+medullary+microRNAs+in+Dahl+salt-sensitive+rats%3A+miR-29b+regulates+several+collagens+and+related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes.</a> Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).</li>
<li>Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-192+in+diabetic+kidney+glomeruliand+its+function+in+TGF-b-induced+collagen+expression+via+inhibition+of+E-box+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).</li>
<li>Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+microRNA-192+promotes+fibrogenesis+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy.</a> J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).</li>
<li>Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+expression+is+regulated+by+miR-192%2F215+by+a+mechanism+that+is+independent+of+the+profibrotic+effects+of+transforming+growth+factor-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β.</a> Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).</li>
<li>Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+circuit+mediates+transforming+growth+factor-%CE%B21+autoregulation+in+renal+glomerular+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells.</a> Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).</li>
<li>Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNA+profiling+in+kidney+and+bladder+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers.</a> Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).</li>
<li>Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+microRNA+panel+for+clear-cell+kidney+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Urol%22%5BJournal%5D)">Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer.</a> Urol. 75 (4), 835-841 (2010).</li>
<li>Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+ischemic+preconditioning+contributes+to+renal+protection+by+upregulation+of+miR-21%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21.</a> Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).</li>
<li>Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+study+of+microRNAs+and+its+application+in+kidney+disease+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension.</a> 122 (10), 439-447 (2012).</li>
<li>Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+miRNAs+in+animal+embryos+using+LNA-moidified+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes.</a> Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).</li>
<li>Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-382+targeting+of+kallikrein+5+contributes+to+renal+inner+medullary+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis.</a> Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).</li>
</ol>

No hay nada que revelar.

El objetivo de este artículo es describir un protocolo de miRNA de hibridación in situ que funciona bien en los tejidos renales fijas con formalina. Si bien la elaboración de este protocolo se han identificado varias fuentes importantes de artefactos de tinción. Una cuidadosa atención a estos puntos puede ayudar a evitar artefactos de tinción y aumentar la probabilidad de una exitosa carrera ISH. Una de las causas más evitables de artefactos de tinción puede ocurrir cuando las secci...

MicroARN son pequeños (aproximadamente 22 nucleótidos de largo) RNAs no codificantes que se producen de manera endógena. Por lo general, funcionan para suprimir la expresión de la proteína a través de la represión de traducción o degradación de ARNm. miRNAs se unen a los objetivos de mRNA con complementariedad incompleta, por lo que es posible que un solo miARN para suprimir múltiples objetivos. Entender cuáles son los tipos y estructuras celulares expresan miRNAs es una parte importante de la comprensión de los mecanismos por los que las alteraciones en la expresión de miRNA influencia celular y fenotipos de tejidos. Mientras que los métodos como la secuenciación de los genes miARN, qPCR y transferencia de Northern se pueden utilizar para la detección de miRNAs en tejidos enteros, este enfoque no permite determinar qué tipo de célula específica que llegaron desde el interior de un determinado tejido. La disección de los componentes celulares y estructurales antes del análisis utilizando estos métodos puede ser muy difícil y las condiciones necesarias para lograr aislamientos adecuados puede conducir a alterations en la expresión o la degradación de los ARN de genes. microARN hibridación in situ es un método utilizado para visualizar la ubicación de microARN y los niveles de expresión en los tejidos. Esta técnica es especialmente valiosa en los tejidos compuestos de estructuras heterogéneas, tales como el riñón. Los microARNs se ha demostrado que desempeñan un papel regulador en 2,3 el desarrollo del riñón y de la fisiología 4. alteraciones de expresión de microARN también se han demostrado estar involucrados con la patología renal, como la fibrosis 5-10, nefropatía diabética 7, carcinoma renal 11,12, y la lesión renal aguda 13. En nuestra investigación, hemos encontrado que la optimización de micro ARN hibridación in situ para los tejidos del riñón era valiosa para determinar las ubicaciones estructurales exactas de los genes miARN expresión tanto en la salud y la enfermedad 14. Determinación de la expresión tubular y celular de diferentes microRNAs es importante porque su regulación de TArgets pueden depender de las funciones celulares. En estados de enfermedad también es importante para determinar cómo las alteraciones en la expresión de los genes miARN pueden ser función impactando. El objetivo del método descrito aquí era construir en las metodologías existentes ISH desarrollados por Kloosterman et al. 15, otros investigadores 16,17, y los sugeridos por Exiqon 1 y optimizar el método para tejidos renales fijos formalina. Hemos utilizado con éxito este método para identificar las diferencias regionales en distintas renal expresión de microARN miR-382 con obstrucción ureteral unilateral 18. Este enfoque se puede utilizar con otros tejidos, así, con la optimización adicional.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Pirocarbonato de Dietilo</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Ultra Puro</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Life Tecnologías</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>J.T. Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Buffer Life Technologies</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>ARN de levadura</td><td>Life Technologies</td><td>AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3' Sonda DIG-miRNA</td><td>Exiqon</td><td>miR dependiente-05</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- Sonda miR codificada</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3' Sonda DIG- U6 miR</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Ab Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisher Ajuste</td><td>al tamaño</td><td></td>del tejido</tr><tr><td>Microtom HM 355 S</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>Horno de hibridación deslizable</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de bandeja de aluminio</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr><tr><td>Inserto de rejilla de acero inoxidable</td><td>Boekel C2403754</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microrna<em&gt; in situ</em&gt; la hibridación de los tejidos del riñón y fijados con formalina

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

En este artículo se describe un método para la detección colorimétrica de miRNA en el riñón a través de la hibridación in situ con digoxigenina etiquetados sondas de microARN. Este protocolo, desarrollado originalmente por Kloosterman y colegas por un amplio uso con sondas Exiqon miARN 1, se ha modificado para superar los desafíos inherentes en el análisis de miRNA en los tejidos renales. Estos incluyen temas como la identificación de la estructura y la fuerza para eliminar la sonda residual y anticuerpos. El uso de relativamente delgada, de 5 mm de espesor, las secciones de tejido se admiten para la visualización clara de las estructuras del riñón, mientras que una señal de la sonda fuerte fue retenido en las células. Además, se han optimizado las condiciones de concentración de la sonda y de incubación para facilitar la visualización de expresión de microARN con bajo fondo y la señal no específica. Aquí, el protocolo optimizado se describe, que cubre la recogida inicial del tejido y la preparación a través del montaje de diapositivas al final del procedimiento. El Compon básicaNTS de este protocolo pueden ser alterados para su aplicación a otros tejidos y modelos de cultivo celular.

Las zonas de una sección de tejido que se convierten secó a cabo durante las hibridaciones, las incubaciones o etapas de lavado, generalmente, terminan tinción más oscura durante el desarrollo de NBT / BCIP. Figura 1 muestra una parte de una sección del riñón en la que el HybriSlip deslizó fuera del borde de el tejido, permitiendo que se convierta parcialmente deshidratado. A pesar de la rehidratación y la cobertura en los pasos restantes, la señal en la porción deshidratada es artificialmente alta. </p...

En este artículo se describe un protocolo de hibridación in situ optimizado para la detección colorimétrica de expresión de microARN en secciones de riñón fijas con formalina.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de los tejidos del riñón y fijados con formalina

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en localizar y cuantificar la expresión de microARN en tejidos renales. Esto se logra primero mediante la hibridación de una sonda marcada con digoxigenina a un microARN determinado dentro del tejido renal. Como segundo paso, se incuba un anticuerpo contra la digoxigenina, conjugado con fosfatasa alcalina, junto con el tejido. A continuación, se añade un sustrato N-B-T-B-C-I-P al tejido para visualizar la ubicación del microARN mediante el desarrollo de un producto de color azul en los sitios donde se hibridaron las sondas de microARN. Los resultados obtenidos muestran dónde se expresan los microARN en regiones del riñón y segmentos del túbulo nefrónico, basándose en la hibridación de sondas complementarias de microARN. Este procedimiento utiliza secciones de riñón fijadas en formaldehído e incluidas en parafina, montadas sobre portaobjetos a una espesor de cinco micrómetros. Para preparar las secciones de riñón para su análisis, primero elimine la parafina del tejido mediante tres lavados con xilol fresco durante cinco minutos cada uno.Rehidrate cada sección de tejido mediante incubaciones de cinco minutos en concentraciones d

microrna-in-situ-hybridization-for-formalin-fixed-kidney-tissues

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Todo el monte In Situ La hibridación de E8.5 a E11.5 embriones de ratón

Aquí se describe un rendimiento de alta...

Un alto rendimiento In situ Método de hibridación para caracterizar los patrones de expresión de ARNm en el ratón Fetal del tracto urogenital inferior

Aquí describimos un protocolo simplificado para análisis de expresión de microARN (miARN) en tejidos clínicos archivados de cáncer de próstata (PCa) fijados en formol, incluidos en parafina (FFPE) o congelados frescos que emplean PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) e hibridación in situ (ISH).

Los análisis de expresión de miRNA en tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata

Aquí presentamos un protocolo para detectar la expresión de miRNA en muestras de pacientes con cáncer de mama utilizando hibridación in situ de miRNA.

Análisis clínico-patológica de los genes miARN expresión en el cáncer de mama mediante el uso de tejidos miARN<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

micro-RNAs (miRNAs) son cortas y altamente homólogas secuencias de ARN, que sirven como reguladores post-transcripcionales de mensajero RNAs (mRNAs). Los métodos actuales de detección de miRNA varían en sensibilidad y especificidad. Se describe un protocolo que combina en situ el hibridación y el immunostaining para la detección simultánea de moléculas miRNA y la proteína en secciones de tejido de corazón de ratón.

MiRNA de tejidos específicos perfiles de expresión en ratón corazón secciones usando el hibridación In Situ

Describimos un protocolo para la microdisección láser de subsegmentos del riñón humano, incluyendo el glomérulo, tubérculo proximal, extremidad ascendente gruesa, conducto coleccionista e intersticio. A continuación, el ARN se aísla de los compartimentos obtenidos y se lleva a cabo la secuenciación de ARN para determinar los cambios en la firma transcriptómica dentro de cada subsegmento.

Aplicación de microdisección láser para descubrir transcriptómica regional en tejido renal humano

Este artículo presenta un protocolo para detectar la expresión de microARN en los riñones de un modelo de ratón con lesión renal aguda utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real. Este protocolo hace hincapié en un modelo de ratón con lesión renal isquémica y en la extracción cuidadosa de muestras de microARN.

Un método cuantitativo de detección de microARN en el riñón de un modelo de ratón con lesión renal isquémica

Describimos un método para evaluar la expresión del microRNA en los riñones de ratones con obstrucción ureteral unilateral (UUO) mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa de transcripción inversa. Este protocolo es adecuado para el estudio de perfiles de expresión de microARN renal en ratones con UUO y en el contexto de otras condiciones patológicas.

Evaluación cuantitativa de PCR en tiempo real de expresiones de microARN en riñón de ratón con obstrucción ureteral unilateral

Los microARN están implicados en la patogénesis de la nefropatía por IgA. Hemos desarrollado un método fiable para detectar los niveles de expresión de microARN en los riñones de un modelo de ratón con nefropatía IgA (ratones HIGA). Este nuevo método facilitará la comprobación de la participación de los miRNAs en la nefropatía por IgA.

Detección de la expresión de microARN en los riñones de ratones nefropáticos de inmunoglobulina A

Aquí, entregamos imitaciones exógenas de miARN sintetizadas artificialmente al riñón a través de la inyección de venas de cola de un vector no viral y nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal. Esto condujo a una sobreexpresión significativa de miARN objetivo en el riñón, lo que resultó en una progresión inhibida de la enfermedad renal en varios modelos de ratón.

Entrega de miRNA sintetizado artificialmente exógeno imitador al riñón utilizando nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal

El protocolo describe un ensayo de hibridación de inmunofluorescencia en tándem con tejido fijado en formol e incluido en parafina para detectar y cuantificar microARN y proteínas multiplexadas simultáneamente.

Amplificación y reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación

Aprende hibridación in situ colorimétrica para detectar microRNAs en secciones renales fijadas con formalina. Este método permite localizar y cuantificar la expresión de microRNAs en tejido renal con alta sensibilidad.

MicroRNA

Explorar más videos