Name: MicroRNA In situ La hibridación de los tejidos del riñón y fijados con formalina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-30T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Aprende hibridación in situ colorimétrica para detectar microRNAs en secciones renales fijadas con formalina. Este método permite localizar y cuantificar la expresión de microRNAs en tejido renal con alta sensibilidad.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos otorga HL082798 y HL111580.

1. Secciones de tejido de riñón <ol><li> Fijado en formol (10%) secciones de riñón incluidas en parafina se cortan en portaobjetos de microscopio con un espesor de 5 mm usando una Microm HM 355 S. Los portaobjetos se pueden almacenar durante varios meses antes del análisis. </li></ol> 2. Preparación de la Solución <ol><li> Preparar 1 l de 1x PBS en ddH2O en un frasco con tapa de rosca autoclavable. Llene otra botella con 1 l de ddH 2 O. Añadir 1 ml de DEPC a cada botella, tapar y agitar enérgicamente. Deje que las soluciones de reposar toda la noche a temperatura ambiente para destruir RNAsas y luego en autoclave. Añadir 400 ml de Tween-20 a 1 l de PBS 1x para hacer PBS-T. </li><li> Preparar tampón de proteinasa K (50 mMTris-HCl, pH 8,0 y 1 mM de CaCl2 en agua tratada con DEPC). </li><li> Preparar una solución de 0,2% de glicina en PBS-T. </li></ol> 3. Preparación de Tejido <ol><li> Preparar un gran volumen de tampón de hibridación (50-100 ml) compuesta de 50% de formamida, 5x SSC, 0,1% de Tween, 9,2mM de ácido cítrico para el ajuste a pH 6, 50 mg / ml de heparina, y 500 mg / ml de ARN de levadura en DEPC tratado ddH 2 O. Divida en alícuotas de 1 ml y se almacena a -80 º C. </li><li> Retire la parafina del tejido lavando 3 veces en xileno fresco durante 5 minutos cada uno. </li><li> Rehidratan las secciones de tejido por 5 min incubaciones en concentraciones decrecientes de etanol (100%, 75%, 50%, y 25%) en ddH 2 O. </li><li> Tratar las diapositivas con DEPC suficiente para cubrir completamente las secciones de tejido (aproximadamente 0,4-0,5 ml) durante 1 min. Hacer que los tejidos seguro no se sequen. </li><li> Enjuagar los portaobjetos en DEPC tratados PBS-T dos veces por 5 min, recogiendo el DEPC contiene residuos para su eliminación adecuada. Todos los reactivos deben ser DEPC tratados para eliminar RNAsas partir de este momento. </li><li> Precalentar la proteinasa K tampón y agregar proteinasa K a una concentración final de 10 mg / ml. Cubrir las secciones de tejido con solución de proteinasa K y se incuba a 37 º C durante 5 min. </li><li> Quite rápidamente las proteinassolución de e K y añadir 0,2% de glicina en PBS-T durante 30 segundos. </li><li> Enjuague las diapositivas en DEPC tratados PBS-T dos veces durante 30 segundos cada uno. </li><li> Fijar secciones recién hecho paraformaldehído al 4% durante 10 min. </li></ol> 4. Hibridación <ol><li> Añadir 50 l de tampón de hibridación (50% formamida, 5x SSC, 0,1% de Tween, ácido cítrico 9,2 mM para el ajuste a pH 6, 50 mg / ml de heparina, 500 g / ml de ARN de levadura) por sección de tejido y cubrir con RNasa HybriSlips libres cortar justo más grande que las secciones de tejido. </li><li> Secciones Prehybridize en horno de hibridación de humedad controlada durante 2 horas a temperatura de hibridación determinado para el 3 &#39;de la sonda marcada con digoxigenina (generalmente ADN Tm de la sonda -21 ° C, (es decir, 54 ° C durante miR-382, sonda de ADN Tm = 75 º C ), utilizando toallitas de laboratorio de tejido empapado en 50% formamide/50% SSC 5x para mantener la cámara de humidificado. </li><li> Diluir la sonda miRNA, control positivo (U6, ARN pequeño nuclear) y control negativo (revueltossecuencia) a 40 nM en tampón de hibridación (75 l de tampón se necesita por sección). </li><li> Calentar la sonda en tampón de hibridación a 65 º C durante 5 min. </li><li> Retirar los portaobjetos de horno de hibridación y retirar los cubreobjetos y exceso de tampón de hibridación de prehibridación. </li><li> Añadir 75 l de sonda que contiene tampón por sección de tejido, directamente al tejido. Cubra el tejido con HybriSlips lo suficientemente grandes para cubrir las secciones de tejido. </li><li> Mantener el nivel soporte de diapositivas, vuelva al horno de hibridación para la incubación durante la noche a temperatura desde el paso 4.2 (aproximadamente 16 horas). </li></ol> 5. Rigurosidad de lavado <ol><li> Añadir 200 l 2x SSC, se calienta a la temperatura de hibridación, justo por debajo de uno de los bordes de los cubreobjetos para ayudar a liberar el cubreobjetos del tejido. Quite el cubreobjetos por la inclinación de la diapositiva. </li><li> Lavar los portaobjetos en 200 l de formamida al 50%, 50% SSC 2x a 3x de temperatura de hibridación durante 30 min cada uno. </li><li> Enjuaguelas diapositivas 5x en PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min cada uno en un agitador orbital a baja velocidad. </li></ol> 6. Detección <ol><li> Incubar diapositiva en tampón de bloqueo (2% de suero de caballo o cabra, 2 mg / ml de BSA en PBS-T) durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador orbital a baja velocidad. </li><li> Diluir fragmentos anti-DIG-AP Fab en tampón de bloqueo a 1:100. Añadir 100 l por sección de tejido y cubrir con HybriSlips corte lo suficientemente grande como para cubrir la sección. </li><li> Incubar anticuerpo en una cámara humidificada a 4 ° C durante la noche (aproximadamente 16 horas). </li><li> Se lavan los portas en PBS-T 7x, durante 5 min cada uno en agitación a baja velocidad. </li><li> Lavar los portaobjetos en tampón de AP (100 mM Tris HCl pH 9,5, 50 mM de MgCl 2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween 20) 3x, durante 5 min cada uno. </li><li> Añadir la solución de NBT / BCIP de tampón AP (200 μl/10 ml de tampón) </li><li> Añadir 400-500 ml de solución de NBT / BCIP diluida a cada diapositiva para cubrir completamente todas las secciones de tejido. Desarrollar en un lugar oscuro, nivel, Humidifcámara de IED durante 4-5 horas. </li></ol> 7. Diapositivas de montaje <ol><li> Deshidratar secciones en concentraciones crecientes de etanol (25%, 50%, 75%, 100%) durante 5 min cada uno. </li><li> Incubar en 5x de xileno con el fin de borrar secciones. </li><li> Monte desliza en medio de montaje Permount y secar toda la noche. </li></ol>

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</ol>

No hay nada que revelar.

El objetivo de este artículo es describir un protocolo de miRNA de hibridación in situ que funciona bien en los tejidos renales fijas con formalina. Si bien la elaboración de este protocolo se han identificado varias fuentes importantes de artefactos de tinción. Una cuidadosa atención a estos puntos puede ayudar a evitar artefactos de tinción y aumentar la probabilidad de una exitosa carrera ISH. Una de las causas más evitables de artefactos de tinción puede ocurrir cuando las secci...

MicroARN son pequeños (aproximadamente 22 nucleótidos de largo) RNAs no codificantes que se producen de manera endógena. Por lo general, funcionan para suprimir la expresión de la proteína a través de la represión de traducción o degradación de ARNm. miRNAs se unen a los objetivos de mRNA con complementariedad incompleta, por lo que es posible que un solo miARN para suprimir múltiples objetivos. Entender cuáles son los tipos y estructuras celulares expresan miRNAs es una parte importante de la comprensión de los mecanismos por los que las alteraciones en la expresión de miRNA influencia celular y fenotipos de tejidos. Mientras que los métodos como la secuenciación de los genes miARN, qPCR y transferencia de Northern se pueden utilizar para la detección de miRNAs en tejidos enteros, este enfoque no permite determinar qué tipo de célula específica que llegaron desde el interior de un determinado tejido. La disección de los componentes celulares y estructurales antes del análisis utilizando estos métodos puede ser muy difícil y las condiciones necesarias para lograr aislamientos adecuados puede conducir a alterations en la expresión o la degradación de los ARN de genes. microARN hibridación in situ es un método utilizado para visualizar la ubicación de microARN y los niveles de expresión en los tejidos. Esta técnica es especialmente valiosa en los tejidos compuestos de estructuras heterogéneas, tales como el riñón. Los microARNs se ha demostrado que desempeñan un papel regulador en 2,3 el desarrollo del riñón y de la fisiología 4. alteraciones de expresión de microARN también se han demostrado estar involucrados con la patología renal, como la fibrosis 5-10, nefropatía diabética 7, carcinoma renal 11,12, y la lesión renal aguda 13. En nuestra investigación, hemos encontrado que la optimización de micro ARN hibridación in situ para los tejidos del riñón era valiosa para determinar las ubicaciones estructurales exactas de los genes miARN expresión tanto en la salud y la enfermedad 14. Determinación de la expresión tubular y celular de diferentes microRNAs es importante porque su regulación de TArgets pueden depender de las funciones celulares. En estados de enfermedad también es importante para determinar cómo las alteraciones en la expresión de los genes miARN pueden ser función impactando. El objetivo del método descrito aquí era construir en las metodologías existentes ISH desarrollados por Kloosterman et al. 15, otros investigadores 16,17, y los sugeridos por Exiqon 1 y optimizar el método para tejidos renales fijos formalina. Hemos utilizado con éxito este método para identificar las diferencias regionales en distintas renal expresión de microARN miR-382 con obstrucción ureteral unilateral 18. Este enfoque se puede utilizar con otros tejidos, así, con la optimización adicional.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Pirocarbonato de Dietilo</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Ultra Puro</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Life Tecnologías</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>J.T. Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Buffer Life Technologies</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>ARN de levadura</td><td>Life Technologies</td><td>AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3' Sonda DIG-miRNA</td><td>Exiqon</td><td>miR dependiente-05</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- Sonda miR codificada</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3' Sonda DIG- U6 miR</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Ab Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisher Ajuste</td><td>al tamaño</td><td></td>del tejido</tr><tr><td>Microtom HM 355 S</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>Horno de hibridación deslizable</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de bandeja de aluminio</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr><tr><td>Inserto de rejilla de acero inoxidable</td><td>Boekel C2403754</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microrna<em&gt; in situ</em&gt; la hibridación de los tejidos del riñón y fijados con formalina

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

En este artículo se describe un método para la detección colorimétrica de miRNA en el riñón a través de la hibridación in situ con digoxigenina etiquetados sondas de microARN. Este protocolo, desarrollado originalmente por Kloosterman y colegas por un amplio uso con sondas Exiqon miARN 1, se ha modificado para superar los desafíos inherentes en el análisis de miRNA en los tejidos renales. Estos incluyen temas como la identificación de la estructura y la fuerza para eliminar la sonda residual y anticuerpos. El uso de relativamente delgada, de 5 mm de espesor, las secciones de tejido se admiten para la visualización clara de las estructuras del riñón, mientras que una señal de la sonda fuerte fue retenido en las células. Además, se han optimizado las condiciones de concentración de la sonda y de incubación para facilitar la visualización de expresión de microARN con bajo fondo y la señal no específica. Aquí, el protocolo optimizado se describe, que cubre la recogida inicial del tejido y la preparación a través del montaje de diapositivas al final del procedimiento. El Compon básicaNTS de este protocolo pueden ser alterados para su aplicación a otros tejidos y modelos de cultivo celular.

Las zonas de una sección de tejido que se convierten secó a cabo durante las hibridaciones, las incubaciones o etapas de lavado, generalmente, terminan tinción más oscura durante el desarrollo de NBT / BCIP. Figura 1 muestra una parte de una sección del riñón en la que el HybriSlip deslizó fuera del borde de el tejido, permitiendo que se convierta parcialmente deshidratado. A pesar de la rehidratación y la cobertura en los pasos restantes, la señal en la porción deshidratada es artificialmente alta. </p...

En este artículo se describe un protocolo de hibridación in situ optimizado para la detección colorimétrica de expresión de microARN en secciones de riñón fijas con formalina.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de los tejidos del riñón y fijados con formalina

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en localizar y cuantificar la expresión de microARN en tejidos renales. Esto se logra primero mediante la hibridación de una sonda marcada con digoxigenina a un microARN determinado dentro del tejido renal. Como segundo paso, se incuba un anticuerpo contra la digoxigenina, conjugado con fosfatasa alcalina, junto con el tejido. A continuación, se añade un sustrato N-B-T-B-C-I-P al tejido para visualizar la ubicación del microARN mediante el desarrollo de un producto de color azul en los sitios donde se hibridaron las sondas de microARN. Los resultados obtenidos muestran dónde se expresan los microARN en regiones del riñón y segmentos del túbulo nefrónico, basándose en la hibridación de sondas complementarias de microARN. Este procedimiento utiliza secciones de riñón fijadas en formaldehído e incluidas en parafina, montadas sobre portaobjetos a una espesor de cinco micrómetros. Para preparar las secciones de riñón para su análisis, primero elimine la parafina del tejido mediante tres lavados con xilol fresco durante cinco minutos cada uno.Rehidrate cada sección de tejido mediante incubaciones de cinco minutos en concentraciones decrecientes de etanol en agua doblemente destilada. A continuación, trate los portaobjetos con suficiente dathyl, percarbonato o desy para cubrir completamente las secciones de tejido durante un minuto. Asegúrese de que los tejidos no se sequen.Retire el desy y enjuague las portaobjetos. Sumerja las portaobjetos en PBST tratado con Dessy dos veces durante cinco minutos. Asegúrese de que el dessy que contiene desechos se recoja para su eliminación adecuada.A partir de este momento, todos los reactivos deben ser tratados para eliminar ARN. Para ello, añada proteinasa K al tampón de proteinasa K precalentado hasta una concentración final de 10 microgramos por mililitro. Cubra las secciones de tejido con la solución de proteinasa K y incube a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Elimine rápidamente la solución de proteinasa K y añada glicina al 0,2 % en PBST durante 30 segundos.Lave las laminillas en PBST dos veces durante 30 segundos cada vez. Por último, fije las secciones de tejido en paraformaldehído al 4% recién preparado durante 10 minutos.Para comenzar este procedimiento, agregue 50 microlitros de tampón de hibridación por sección de tejido y cúbralo con cubreobjetos libres de RNAsas ligeramente más grandes que las secciones de tejido. Coloque las laminillas dentro de una cámara humidificada con toallitas de laboratorio empapadas en una mezcla de 50% de formamida y 50% de SSC 5X. Prehibridice las secciones de tejido colocando la cámara humidificada durante dos horas en una estufa a la temperatura de hibridación determinada para la sonda marcada con digoxigenina en el extremo tres prime. La temperatura de hibridación para la sonda suele ser la temperatura de fusión del ADN o TM de la sonda menos 21 grados Celsius.Por ejemplo, la temperatura de hibridación para la sonda 3 82 es de 54 grados Celsius porque su temperatura de fusión (TM) es de 75 grados Celsius. Prepare la sonda de microARN y los controles positivo y negativo diluyendo cada uno a 40 nanomolares en tampón de hibridación. El control positivo es el ARN nuclear pequeño U seis y el control negativo es una secuencia aleatorizada.Caliente la sonda y los controles a 65 grados Celsius durante cinco minutos. Retire las laminillas del horno de hibridación. Retire las cubreobjetos y el exceso de tampón de hibridación del montaje de pre-hibridación.Añada 75 microlitros de sonda que contenga tampón directamente sobre cada sección de tejido. Cubra con cubreobjetos que, nuevamente, sean lo suficientemente grandes como para cubrir las secciones de tejido. Mantenga el portaobjetos nivelado.Devuelva las laminillas al horno de hibridación a la temperatura adecuada. Incube durante la noche durante aproximadamente 16 horas. Una vez completada la hibridación, retire las laminillas del horno de hibridación.Añada 200 microlitros de 2XSSC calentado a la temperatura de hibridación justo debajo de un borde del cubreobjetos para ayudar a liberar el cubreobjetos del tejido. Retire el cubreobjetos inclinando la preparación. Una vez que se hayan retirado los cubreobjetos, lave las preparaciones con 200 microlitros de 50 % formamida en 2XSSC a la temperatura de hibridación determinada, tres veces durante 30 minutos cada una.Lave las laminillas cinco veces en PBST a temperatura ambiente durante cinco minutos cada vez en un agitador orbital a baja velocidad. Comience este procedimiento incubando las laminillas en tampón bloqueante durante una hora a temperatura ambiente en un agitador orbital a baja velocidad. Después de una hora, añada 100 microlitros de fragmentos de anti dig AP FAB a cada sección de tejido y cúbrala con cubreobjetos.Corte lo suficientemente grande como para cubrir la sección. Incube los portaobjetos en una cámara humidificada a cuatro grados Celsius durante la noche o aproximadamente 16 horas al día siguiente. Lave los portaobjetos siete veces en PBST a temperatura ambiente durante cinco minutos cada vez en un agitador orbital ajustado a baja velocidad.A continuación, lave las laminillas en el tampón AP tres veces durante cinco minutos cada vez. Prepare la solución reveladora de N-B-T-B-C-I-P añadiendo 200 microlitros de la solución de N-B-T-B-C-I-P a 10 mililitros de tampón AP. Añada de 400 a 500 microlitros de la solución diluida de N-B-T-B-C-I-P a cada laminilla para cubrir completamente todas las secciones de tejido.Desarrolle en una cámara oscura y nivelada con humedad controlada durante cuatro a cinco horas a temperatura ambiente cuando finalice la detección colorimétrica. Deshidrate las secciones en concentraciones crecientes de etanol durante cinco minutos cada una; aclare las secciones mediante cinco incubaciones en xileno durante cinco minutos cada vez. Por último, monte los portaobjetos en medio de montaje tipo Permount y déjelos secar durante la noche.Es fundamental asegurarse de que la sección de tejido no se seque para el éxito de este protocolo de hibridación in situ. La parte izquierda de esta figura muestra una porción de una sección de riñón en la que la cubierta se deslizó desde el borde del tejido, lo que permitió que se deshidratara parcialmente. A pesar de la rehidratación y la cobertura en los pasos restantes, la señal en la porción deshidratada es artificialmente alta en comparación con la porción que permaneció cubierta por la cubierta.La barra de calibración representa 100 micrones en esta imagen. La importancia de optimizar la duración del desarrollo de N-B-T-B-C-I-P se demuestra en las siguientes figuras. El panel A muestra que periodos de desarrollo mayores de cuatro a cinco horas provocan un desarrollo de color no específico pronunciado y tejidos con control de micro ARN alterado en todo el riñón.El panel B muestra que incubaciones más largas de cuatro a cinco horas no resultan en una mejora adicional de la señal cuando los riñones se analizan para dianas de alta abundancia, como el control de ARN nuclear pequeño U6. Estas figuras adaptadas de un estudio previo confirman la aplicabilidad de este método de hibridación in situ para la detección de microARN en tejido renal. El panel A muestra imágenes representativas de la expresión de miR-382 obtenidas mediante hibridación in situ en secciones de riñón de ratones con o sin obstrucción ureteral unilateral (UUO) y tratados con antisentido anti-miR-382 o antisentido aleatorizado. La UUO indujo un aumento en la expresión de miR-382, como se observa por la tinción más oscura en el tejido UUO más antisentido aleatorizado en comparación con el tejido sham más antisentido aleatorizado.Este aumento fue bloqueado por el tratamiento con anti-ME 3 82. Los gráficos del panel B muestran la expresión de mere 3 82 en ratones tratados con sham más antis scrambled como porcentaje de densidad óptica integrada promedio. Como medida de la intensidad de píxeles observada, la UUO induce un aumento significativo en la expresión de mere 3 82 en la médula externa e interna, y anti-ME 3 82 lo bloquea.Este aumento, todo lo cual puede visualizarse y medirse mediante hibridación in situ de microARN. Estos resultados también son consistentes con los resultados de Q-PCR-R que no se muestran aquí, lo que indica que el uso de la hibridación INI dos para detectar la expresión de mere 3 82 en riñón fijado en formalina es lo suficientemente sensible como para proporcionar resultados cuantificables que reflejan el análisis de expresión basado en Q-PCR-R. Además, la hibridación C dos permite la medición de diferencias regionales específicas en la expresión de microARN dentro del riñón.

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