Name: El cultivo y mantenimiento Clostridium difficile En un ambiente anaeróbico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-14T21:25:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprende a aislar y cultivar Clostridium difficile en condiciones anaeróbicas para investigación microbiológica. Este método permite preparar reservas de glicerol y esporas para estudios de resistencia antibiótica.

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Nos gustaría dar las gracias a Coy Laboratorios amablemente para proporcionar imágenes de la cámara anaeróbica. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención DK087763 (SMM) y un plan de estudios STEP / HHMI Desarrollo de la Confraternidad (ANE).

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<li>Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cycloserine-cefoxitin-fructose+agar+%28CCFA%29+and+taurocholate-CCFA+for+recovery+of+Clostridium+difficile+during+surveillance+of+hospitalized+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).</li>
<li>Marler, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+cultural+procedures+for+isolation+of+Clostridium+difficile+from+stools%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools.</a> J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).</li>
<li>Sorg, J. A., Dineen, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Clostridium difficile.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1(2009).</li>
<li>Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of Clostridium difficile.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2(2011).</li>
<li>Lemee, L., Pons, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilocus+sequence+typing+for+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multilocus sequence typing for Clostridium difficile.</a> Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).</li>
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<li>Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpoIVA+and+SipL+are+Clostridium+difficile+spore+morphogenetic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins.</a> J. Bacteriol. , (2013).</li>
<li>Burns, D. A., Minton, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+studies+in+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sporulation studies in Clostridium difficile.</a> J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).</li>
<li>Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clospore%3A+a+liquid+medium+for+producing+high+titers+of+semi-purified+spores+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile.</a> J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).</li>
<li>Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+the+initiation+of+Clostridium+difficile+spore+germination+using+analogs+of+chenodeoxycholic+acid%2C+a+bile+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid.</a> J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).</li>
<li>O'Connor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+chromosomal+Clostridium+difficile+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants.</a> Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).</li>
<li>Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+recovery+of+Clostridium+difficile+from+an+environmental+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface.</a> J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).</li>
<li>Koch, C. J., Kruuv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+release+of+oxygen+from+polystyrene+Petri+dishes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Radiol%22%5BJournal%5D)">The release of oxygen from polystyrene Petri dishes.</a> Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).</li>
<li>Ethapa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+modulate+biofilm+formation+by+the+anaerobic+pathogen+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile.</a> J. Bacteriol. , (2012).</li>
<li>Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Anaerobic cell culture.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F(2009).</li>
<li>Lyras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin+B+is+essential+for+virulence+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile.</a> Nature. 458, 1176-1179 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Los métodos descritos aquí permiten una recuperación rápida y sencilla de C. difficile a partir de una variedad de muestras fecales, incluyendo seres humanos, ratones y hámsteres, así como el almacenamiento a largo plazo de C. difficile como stocks de glicerol o de esporas. C. difficile puede ser un organismo difícil de cultivar, pero cuidado mantenimiento de un ambiente anaerobio y la aplicación de técnicas asépticas puede proporcionar para un crecimiento vigoroso y una reducción en la contam...

Clostridium difficile es una bacteria formadora de esporas Gram-positivo que es un anaerobio obligado y un patógeno gastrointestinal potencialmente fatal de los seres humanos y animales. Inicialmente descrito en 1935 como un organismo comensal encuentra en las muestras de heces de los recién nacidos 1, C. difficile más tarde se demostró que era el agente causante de la colitis pseudomembranosa asociada con el tratamiento antibiótico 2. C. infecciones difficile (CDI) son típicamente precedidas de un tratamiento con antibióticos que resulta en la alteración de la flora normal del colon, creando un nicho para C. difficile prospere 2. C. difficile se transmite como una espora latente a través de la vía fecal-oral y posteriormente germina dentro del tracto gastrointestinal, produciendo células vegetativas capaz de generar varias toxinas y causando la enfermedad grave y la colitis 3. CDI suelen ser refractarios a los tratamientos convencionales y estos eninfecciones son frecuentemente recurrente 4. Como resultado, los CDI son responsables de hasta $ 4.8 mil millones en costos de atención de la salud en los Estados Unidos 5-7. C. difficile es muy sensible a incluso niveles bajos de oxígeno en el medio ambiente. Para C. difficile de persistir en el medio ambiente y se transmite de manera eficiente de un huésped a otro, la formación de una espora metabólicamente inactiva es crítica 8. Debido a que el mantenimiento de laboratorio y la manipulación de C. difficile requiere un ambiente anaeróbico controlado, estas técnicas requieren el uso de una cámara anaeróbica. El uso de cámaras anaeróbicas se ha traducido en un aumento de la recuperación y el aislamiento de anaerobios obligados 9-11, y ha permitido una serie de técnicas moleculares que se deben realizar en un ambiente anaeróbico. Además de C. difficile, el uso cámara anaeróbica y mantenimiento descritos aquí son aplicablesa otros anaerobios obligados, como otras especies clostridiales (por ejemplo, C. perfringens), otras especies gastrointestinales (por ejemplo, especies de Bacteroides 12) y patógenos periodontales (por ejemplo, especies de Peptostreptococcus 13).

<table><tbody><tr><td>Proteose Peptona n.º 2</td><td>BD</td><td>212120</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>BP362</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S27</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (anhidro)</td><td>Fisher</td><td>M65</td><td></td></tr><tr><td>a'...-Fructosa</td><td>Fisher</td><td>L96</td><td></td></tr><tr><td>Taurocolato de sodio</td><td>Sigma</td><td>T4009</td><td></td></tr><tr><td>á'...-cicloserina</td><td>Sigma</td><td>C6880</td><td></td></tr><tr><td>Cefoxitin</td><td>Fluka</td><td>C4786</td><td></td></tr><tr><td>Medio de infusión cerebro-corazón</td><td>BD</td><td>237300</td><td></td></tr><tr><td>Proteose Peptona</td><td>BD 211684</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptone</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>Agar sangre de oveja colombiana</td><td>Fisher</td><td>L21928</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S27</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>BP2291</td><td></td></tr><tr><td>Asas de inoculación estériles</td><td>Fisher</td><td>22363596</td><td></td></tr><tr><td>Hisopos estériles</td><td>Cámara</td><td></td> anaeróbica de vinilo Coy 1495990 <td></td></tr><tr><td>Coy y accesorios</td><td>Coy Laboratory Products, Inc</td><td>Especificado por el cliente</td><td>Estos artículos se ordenan a medida según las necesidades</td></tr><tr> del laboratorio<td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td colspan="4">TCCFA agar Proteose peptona n.º 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhidro) 0,1 g Fructosa 6 g Agar 20 g Llevar a 1 L con agua desionizada y autoclave a 121 & grados; C durante 20 min para esterilizar. Después del autoclave, agregar: 10 ml de taurocolato de sodio al 10% (p/v), esterilizado por filtro (disolver en agua; concentración final, 0,1%) 25 ml de 10 mg/ml á'...-cicloserina, esterilizada por filtro (disolver en agua; concentración final, 250 &mu; g/ml) 1,6 ml de 10 mg/ml de cefoxitina, esterilizada con filtro (disolver en agua; concentración final, 16 &mu; g/ml) BHIS Medium Infusión cerebro-corazón 37 g Extracto de levadura 5 g Para los platos, agregue 15 g de agar. Llevar a 1 L con agua desionizada y autoclave a 121 &deg; C durante 20 minutos para esterilizar. Opcional (agregar después del autoclave): 3 ml de L-cisteína al 10% (p/v) (disolver en agua; concentración final, 0.03%) 10 ml de taurocolato de sodio al 10% (p/v) (disolver en agua; concentración final, 0.1%) SMC Medio de esporulación <br/br/> BactoPeptone 90 g Proteasa peptona 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1,5 g Agar 15 g Llevar a 1 L con agua desionizada y autoclave a 121 & grados; C durante 20 min para esterilizar. Opcional (agregar después del autoclave): 3 ml de L-cisteína al 10% (p/v) (disolver en agua; concentración final, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Peptona proteasa 3,5 g Infusión cerebro-corazón 11,1 g Extracto de levadura 1,5 g (NH4)2SO4 0,7 g Tris base 1,06 g Para los platos, agregue 15 g de agar. Llevar a 1 L con agua desionizada y autoclave a 121 &deg; C durante 20 min para esterilizar. Después de esterilizar en autoclave, agregue 3 ml de L-cisteína al 10% (p/v) (concentración final, 0.03%). Blood agar Se recomienda el uso de placas de agar de sangre de oveja anaeróbica Columbia prefabricadas (Fisher Scientific, L21928)35. 1X Solución salina tamponada con fosfato (PBS) NaCl 8,01 g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,44 g KH2PO4 0,27 g Lleve a 1 L con agua desionizada y ajuste el pH a 7.4 con HCl. Filtro Esterilizar antes de usar.</td></tr></tbody></table>

el cultivo y mantenimiento<em&gt; clostridium difficile</em&gt; en un ambiente anaeróbico

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile es un anaerobio, bacteria Gram-positiva, esporogénica que es el principal responsable de la diarrea asociada a antibióticos (DAA) y es un patógeno nosocomial significativo. C. difficile es notoriamente difícil de aislar y cultivar y es extremadamente sensible a incluso niveles bajos de oxígeno en el medio ambiente. Aquí, métodos para aislar C. difficile a partir de muestras fecales y, posteriormente, el cultivo de C. difficile para la preparación de los stocks de glicerol para el almacenamiento a largo plazo se presentan. También se describen técnicas para la preparación y la enumeración de las existencias de esporas en el laboratorio para una variedad de aplicaciones posteriores, incluyendo estudios de microscopía y animales. Estas técnicas requieren una cámara anaeróbica, que mantiene un ambiente anaeróbico coherente para garantizar condiciones adecuadas para óptima C. crecimiento difficile. Proporcionamos protocolos para la transferencia de materiales dentro y fuera de la cámara sin Cautilizando una contaminación significativa de oxígeno, junto con sugerencias para el mantenimiento regular necesario para mantener el medio ambiente anaeróbico apropiado para una eficiente y consistente C. cultivo difficile.

Un ejemplo de C. difficile crecido en BHIS y Columbia anaeróbica ovejas medios de agar sangre puede ser visto en la Figura 2. C. difficile forma colonias irregulares que son planas y poseen una apariencia de vidrio esmerilado que es evidente en ambos medios. Aquí, un aislado clínico-eritromicina sensible de C. difficile, 630E 30, se cultiva en BHIS de agar, un medio enriquecido, no selectivo, durante 24 horas a 37 ° C (Figura 2A). Las colonias sobre...

Clostridium difficile es una bacteria patógena que es un anaerobio estricto y causa diarrea asociada a antibióticos (DAA). Aquí, métodos para aislar, cultivar y mantener C. se describen las células vegetativas y esporas difficile. Estas técnicas requieren una cámara anaeróbica, que requiere un mantenimiento regular para garantizar las condiciones adecuadas para una óptima C. cultivo difficile.

El cultivo y mantenimiento<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; En un ambiente anaeróbico

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar C. difficile a partir de muestras fecales para cultivar C. difficile, preparar stocks de glicerol para almacenamiento a largo plazo y preparar y enumerar stocks de esporas para diversas aplicaciones posteriores. Esto se logra primero aislado C. difficile a partir de muestras de heces mediante siembra en un medio selectivo. El segundo paso consiste en cultivar C. difficile en medio líquido y mantener stocks a largo plazo de C. difficile en glicerol.A continuación, C difficile se recupera de stocks congelados en glicerol y se siembra por estría en placas de agar. En el último paso, se preparan stocks de esporas de C difficile y se enumeran finalmente siguiendo estos protocolos. C difficile puede cultivarse en diversos medios para verificar y confirmar su identidad, y puede ser cultivado y mantenido con éxito.Estos tallos de glicerol y cultivos pueden utilizarse posteriormente en numerosas aplicaciones experimentales, incluyendo estudios con animales e investigaciones adicionales de biología molecular. La principal ventaja de utilizar una cámara anaeróbica de vinilo para cultivar C difficile frente a otros métodos, como los frascos con vela, es que puede mantenerse un ambiente anaeróbico estricto, lo que permite un crecimiento constante y confiable de C difficile. Por lo general, las personas nuevas en estas técnicas pueden encontrar dificultades debido a la falta de destreza dentro de la cámara provocada por los guantes, y también por la necesidad crítica de planificar sus experimentos con anticipación.El encargado de demostrar estos procedimientos será un técnico de mi laboratorio, Jose Suarez al principio. Este procedimiento puede realizarse en condiciones aeróbicas. Primero, pese la muestra de heces.Esto es necesario para enumerar C. difficile a partir de la muestra de heces. A continuación, resuspenda la muestra de heces en un XPBS y vortexee para asegurar que la muestra de heces se resuspenda completamente. Luego, realice diluciones seriadas de la muestra de heces resuspendida en un XPBS para el aislamiento o enumeración adecuados de unidades formadoras de colonias o UFC por gramo de heces a partir de este momento.Realice el procedimiento en condiciones anaeróbicas para asegurar que las células vegetativas de C difficile no se expongan a oxígeno alguno. La cámara anaeróbica utilizada en este experimento se mantiene a 37 grados Celsius. Utilizando técnica aséptica.Aplique 100 microlitros de cada dilución seriada en placas de Toro collate oxetano, ciclo Seine, agar fructosa o T-C-C-F-A. Estas placas se han pre-reducido durante al menos una o dos horas en la cámara anaeróbica para asegurar la eliminación del oxígeno residual. Para aislar colonias y obtener una enumeración precisa o para otras aplicaciones posteriores.Utilice un asa de inoculación estéril para extender uniformemente el cultivo aplicado sobre la superficie de la placa T-C-C-F-A. Incube las placas anaeróbicamente durante 48 horas a 37 grados Celsius. Identifique las colonias de c difficile basándose en su aspecto plano e irregular tipo vidrio esmerilado para asegurar que las formas vegetativas de c difficile no sean destruidas por la exposición al oxígeno.Las placas para el aislamiento de colonias para aplicaciones posteriores deben mantenerse dentro de la cámara anaeróbica en todo momento. Para la enumeración de colonias, las placas pueden sacarse de la cámara anaeróbica. Tenga en cuenta que, una vez que una placa se saca de la cámara, las formas vegetativas de C. difficile quedarán expuestas al oxígeno y morirán.Estas colonias de C difficile no pueden recuperarse incluso si la placa se devuelve a la cámara. Cuente las colonias de C difficile de cada dilución y calcule el número de UFC por gramo de muestra de heces para cultivar y preparar palillos de glicerol de C difficile. Utilice un asa de inoculación estéril para seleccionar una colonia individual y estríela sobre un caldo de infusión cerebral cardíaca previamente reducido.Suplementado con extracto de levadura o placa de agar BHIS, suplementada con 0,03 % de cisteína, rayar colonias individuales y cuadrantes utilizando un asa de inoculación estéril nueva para cada cuadrante. Incubar las placas anaeróbicamente a 37 grados Celsius durante 16 a 24 horas. Una vez que aparezcan colonias aisladas en las placas de agar BHIS, seleccionar una colonia aislada individual y resuspender la colonia en 10 mililitros de medio líquido BHIS previamente reducido, suplementado con 0,03 % de L-cisteína, e incubar durante la noche.De forma anaeróbica a 37 grados Celsius o hasta que el cultivo se vuelva turbio. Al día siguiente, añadir 333 microlitros de glicerol al 50 % y 666 microlitros del cultivo de C. difficile a un tubo criogénico de 1,8 mililitros. Para crear un stock de glicerol al 15 % de la cepa aislada, tapar firmemente el tubo criogénico y mezclar.Retire inmediatamente el stock de la cámara anaeróbica y colóquelo en un congelador a menos 80 grados Celsius para su almacenamiento a largo plazo. Para comenzar este procedimiento, retire el stock de glicerol congelado de C. difficile del congelador a menos 80 grados Celsius. Para evitar el deshielo.Coloque inmediatamente el stock congelado de glicerol en una rejilla de enfriamiento que se haya almacenado a menos 80 grados Celsius antes de su uso. Introduzca el stock congelado de glicerol en la cámara anaeróbica utilizando técnica aséptica y un asa de inoculación estéril. Coloque una pequeña cantidad del stock sobre la placa y realice estrías a través de un cuadrante de la placa.Gire la placa 90 grados y, utilizando un asa de inoculación estéril nueva, trace una raya a través del segundo cuadrante. Repita el procedimiento para el tercer y cuarto cuadrantes para asegurar el aislamiento de colonias individuales. Retire inmediatamente el stock glicerolado congelado de la cámara anaeróbica y devuélvalo al congelador a menos 80 grados Celsius.Incubar la placa anaeróbicamente durante la noche a 37 grados Celsius para purificar esporas a partir del cultivo de C. difficile. Inocular cepas desde un stock congelado en glicerol en placas de BHIS previamente reducidas. Siguiendo el procedimiento demostrado en el segmento anterior.Incubar anaeróbicamente durante la noche a 37 grados Celsius al día siguiente. Resiembra colonias individuales en varias placas 70 30 previamente reducidas. Incubar anaeróbicamente a 37 grados Celsius durante 24 a 48 horas.Una vez que se hayan formado las esporas, retire las placas de la cámara anaeróbica. Raspe las placas utilizando un asa de inoculación estéril y resuspenda las células en 10 mililitros de PBS 1X estéril. Deseche las placas y peletee las células a 3000 G durante 15 minutos.Elimine el sobrenadante, agregue un mililitro de PBS 1X para resuspender, suspenda y vuelva a centrifugar de esta manera. Lave las células dos veces con PBS e incube a cuatro grados Celsius durante la noche para facilitar la lisis de las células vegetativas y las células madre al día siguiente; luego incube a 70 grados Celsius durante 20 minutos para eliminar cualquier célula vegetativa residual. Para determinar la cantidad de UFC por mililitro, realice diluciones seriadas de cada preparación de esporas en PBS 1X y siembre en agar BHIS previamente reducido más 0,1 % de colina sódica; incube las placas a 37 grados Celsius durante un mínimo de 24 horas antes de contar las colonias.Las esporas pueden almacenarse en un XPBS a temperatura ambiente para almacenamiento a corto plazo o a cuatro grados Celsius para almacenamiento a largo plazo. A. Un ejemplo de C difficile cultivado en BHIS y Columbia anaeróbico con sangre de oveja. Aquí se puede ver el medio de agar sangre.C. difficile forma colonias irregulares que son planas y presentan un aspecto de vidrio esmerilado, evidente en ambos medios. El panel A muestra un aislado clínico sensible a eritromicina, C. difficile 630 E, cultivado en agar BHIS, un medio enriquecido no selectivo, durante 24 horas. A 37 grados Celsius, las colonias en agar sangre ovina anaeróbico de Columbia mostradas en el panel B tienen un aspecto similar a las cultivadas en BHIS bajo luz blanca.Sin embargo, el uso de este medio también permite la detección de la fluorescencia verdosa o cítrica exhibida por C difficile bajo luz ultravioleta de onda larga, mostrada en el panel C tras seguir este procedimiento. Otros métodos, como curvas de crecimiento en medio líquido, aislamiento de colonias, extracción de ADN y ARN, PCR y otras técnicas de biología molecular, así como manipulaciones adecuadas para C difficile, además del uso de esporas de C difficile en estudios con animales, pueden realizarse para responder preguntas adicionales de biología molecular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar, cultivar y mantener células vegetativas y esporas de C difficile dentro de un ambiente anaeróbico.No olvide que C difficile es un patógeno humano y animal que puede causar enfermedades gastrointestinales. Los experimentos con C difficile deben realizarse bajo condiciones apropiadas de nivel de bioseguridad dos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Li, J., et. al., Desarrollo de un modelo de infección de larvas de pez cebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra el aislamiento y cultivo de la bacteria Clostridioides difficile del intestino de las larvas de pez cebra. El intestino infectado se disecciona, homogeneiza e incuba en medios anaeróbicos selectivos que contienen antibióticos. Estas condiciones suprimen los microbios competidores y promueven el crecimiento de células viables.

Aislamiento y cultivo de bacterias Clostridioides difficile a partir de larvas de intestino de pez cebra

Fuente: Anwar, Z., et al. Enriquecimiento y detección de toxinotipos de Clostridium perfringens en muestras de alimentos al por menor. J. Vis. Exp. (2019).En este video, las bacterias reductoras de sulfito se cultivan en un medio de agar que contiene sulfito, donde crecen anaeróbicamente y reducen el sulfito a sulfuro de hidrógeno, formando precipitados negros con iones de hierro. Las colonias negras se aíslan de la profundidad del agar utilizando técnicas asépticas y se transfieren a un medio...

Subcultivo de bacterias anaeróbicas reductoras de sulfito de un cultivo en agar

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