El cultivo y mantenimiento

El objetivo general de este procedimiento es aislar C. difficile a partir de muestras fecales para cultivar C. difficile, preparar stocks de glicerol para almacenamiento a largo plazo y preparar y enumerar stocks de esporas para diversas aplicaciones posteriores. Esto se logra primero aislado C. difficile a partir de muestras de heces mediante siembra en un medio selectivo. El segundo paso consiste en cultivar C. difficile en medio líquido y mantener stocks a largo plazo de C. difficile en glicerol.

A continuación, C difficile se recupera de stocks congelados en glicerol y se siembra por estría en placas de agar. En el último paso, se preparan stocks de esporas de C difficile y se enumeran finalmente siguiendo estos protocolos. C difficile puede cultivarse en diversos medios para verificar y confirmar su identidad, y puede ser cultivado y mantenido con éxito.

Estos tallos de glicerol y cultivos pueden utilizarse posteriormente en numerosas aplicaciones experimentales, incluyendo estudios con animales e investigaciones adicionales de biología molecular. La principal ventaja de utilizar una cámara anaeróbica de vinilo para cultivar C difficile frente a otros métodos, como los frascos con vela, es que puede mantenerse un ambiente anaeróbico estricto, lo que permite un crecimiento constante y confiable de C difficile. Por lo general, las personas nuevas en estas técnicas pueden encontrar dificultades debido a la falta de destreza dentro de la cámara provocada por los guantes, y también por la necesidad crítica de planificar sus experimentos con anticipación.

El encargado de demostrar estos procedimientos será un técnico de mi laboratorio, Jose Suarez al principio. Este procedimiento puede realizarse en condiciones aeróbicas. Primero, pese la muestra de heces.

Esto es necesario para enumerar C. difficile a partir de la muestra de heces. A continuación, resuspenda la muestra de heces en un XPBS y vortexee para asegurar que la muestra de heces se resuspenda completamente. Luego, realice diluciones seriadas de la muestra de heces resuspendida en un XPBS para el aislamiento o enumeración adecuados de unidades formadoras de colonias o UFC por gramo de heces a partir de este momento.

Realice el procedimiento en condiciones anaeróbicas para asegurar que las células vegetativas de C difficile no se expongan a oxígeno alguno. La cámara anaeróbica utilizada en este experimento se mantiene a 37 grados Celsius. Utilizando técnica aséptica.

Aplique 100 microlitros de cada dilución seriada en placas de Toro collate oxetano, ciclo Seine, agar fructosa o T-C-C-F-A. Estas placas se han pre-reducido durante al menos una o dos horas en la cámara anaeróbica para asegurar la eliminación del oxígeno residual. Para aislar colonias y obtener una enumeración precisa o para otras aplicaciones posteriores.

Utilice un asa de inoculación estéril para extender uniformemente el cultivo aplicado sobre la superficie de la placa T-C-C-F-A. Incube las placas anaeróbicamente durante 48 horas a 37 grados Celsius. Identifique las colonias de c difficile basándose en su aspecto plano e irregular tipo vidrio esmerilado para asegurar que las formas vegetativas de c difficile no sean destruidas por la exposición al oxígeno.

Las placas para el aislamiento de colonias para aplicaciones posteriores deben mantenerse dentro de la cámara anaeróbica en todo momento. Para la enumeración de colonias, las placas pueden sacarse de la cámara anaeróbica. Tenga en cuenta que, una vez que una placa se saca de la cámara, las formas vegetativas de C. difficile quedarán expuestas al oxígeno y morirán.

Estas colonias de C difficile no pueden recuperarse incluso si la placa se devuelve a la cámara. Cuente las colonias de C difficile de cada dilución y calcule el número de UFC por gramo de muestra de heces para cultivar y preparar palillos de glicerol de C difficile. Utilice un asa de inoculación estéril para seleccionar una colonia individual y estríela sobre un caldo de infusión cerebral cardíaca previamente reducido.

Suplementado con extracto de levadura o placa de agar BHIS, suplementada con 0,03 % de cisteína, rayar colonias individuales y cuadrantes utilizando un asa de inoculación estéril nueva para cada cuadrante. Incubar las placas anaeróbicamente a 37 grados Celsius durante 16 a 24 horas. Una vez que aparezcan colonias aisladas en las placas de agar BHIS, seleccionar una colonia aislada individual y resuspender la colonia en 10 mililitros de medio líquido BHIS previamente reducido, suplementado con 0,03 % de L-cisteína, e incubar durante la noche.

De forma anaeróbica a 37 grados Celsius o hasta que el cultivo se vuelva turbio. Al día siguiente, añadir 333 microlitros de glicerol al 50 % y 666 microlitros del cultivo de C. difficile a un tubo criogénico de 1,8 mililitros. Para crear un stock de glicerol al 15 % de la cepa aislada, tapar firmemente el tubo criogénico y mezclar.

Retire inmediatamente el stock de la cámara anaeróbica y colóquelo en un congelador a menos 80 grados Celsius para su almacenamiento a largo plazo. Para comenzar este procedimiento, retire el stock de glicerol congelado de C. difficile del congelador a menos 80 grados Celsius. Para evitar el deshielo.

Coloque inmediatamente el stock congelado de glicerol en una rejilla de enfriamiento que se haya almacenado a menos 80 grados Celsius antes de su uso. Introduzca el stock congelado de glicerol en la cámara anaeróbica utilizando técnica aséptica y un asa de inoculación estéril. Coloque una pequeña cantidad del stock sobre la placa y realice estrías a través de un cuadrante de la placa.

Gire la placa 90 grados y, utilizando un asa de inoculación estéril nueva, trace una raya a través del segundo cuadrante. Repita el procedimiento para el tercer y cuarto cuadrantes para asegurar el aislamiento de colonias individuales. Retire inmediatamente el stock glicerolado congelado de la cámara anaeróbica y devuélvalo al congelador a menos 80 grados Celsius.

Incubar la placa anaeróbicamente durante la noche a 37 grados Celsius para purificar esporas a partir del cultivo de C. difficile. Inocular cepas desde un stock congelado en glicerol en placas de BHIS previamente reducidas. Siguiendo el procedimiento demostrado en el segmento anterior.

Incubar anaeróbicamente durante la noche a 37 grados Celsius al día siguiente. Resiembra colonias individuales en varias placas 70 30 previamente reducidas. Incubar anaeróbicamente a 37 grados Celsius durante 24 a 48 horas.

Una vez que se hayan formado las esporas, retire las placas de la cámara anaeróbica. Raspe las placas utilizando un asa de inoculación estéril y resuspenda las células en 10 mililitros de PBS 1X estéril. Deseche las placas y peletee las células a 3000 G durante 15 minutos.

Elimine el sobrenadante, agregue un mililitro de PBS 1X para resuspender, suspenda y vuelva a centrifugar de esta manera. Lave las células dos veces con PBS e incube a cuatro grados Celsius durante la noche para facilitar la lisis de las células vegetativas y las células madre al día siguiente; luego incube a 70 grados Celsius durante 20 minutos para eliminar cualquier célula vegetativa residual. Para determinar la cantidad de UFC por mililitro, realice diluciones seriadas de cada preparación de esporas en PBS 1X y siembre en agar BHIS previamente reducido más 0,1 % de colina sódica; incube las placas a 37 grados Celsius durante un mínimo de 24 horas antes de contar las colonias.

Las esporas pueden almacenarse en un XPBS a temperatura ambiente para almacenamiento a corto plazo o a cuatro grados Celsius para almacenamiento a largo plazo. A. Un ejemplo de C difficile cultivado en BHIS y Columbia anaeróbico con sangre de oveja. Aquí se puede ver el medio de agar sangre.

C. difficile forma colonias irregulares que son planas y presentan un aspecto de vidrio esmerilado, evidente en ambos medios. El panel A muestra un aislado clínico sensible a eritromicina, C. difficile 630 E, cultivado en agar BHIS, un medio enriquecido no selectivo, durante 24 horas. A 37 grados Celsius, las colonias en agar sangre ovina anaeróbico de Columbia mostradas en el panel B tienen un aspecto similar a las cultivadas en BHIS bajo luz blanca.

Sin embargo, el uso de este medio también permite la detección de la fluorescencia verdosa o cítrica exhibida por C difficile bajo luz ultravioleta de onda larga, mostrada en el panel C tras seguir este procedimiento. Otros métodos, como curvas de crecimiento en medio líquido, aislamiento de colonias, extracción de ADN y ARN, PCR y otras técnicas de biología molecular, así como manipulaciones adecuadas para C difficile, además del uso de esporas de C difficile en estudios con animales, pueden realizarse para responder preguntas adicionales de biología molecular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar, cultivar y mantener células vegetativas y esporas de C difficile dentro de un ambiente anaeróbico.

No olvide que C difficile es un patógeno humano y animal que puede causar enfermedades gastrointestinales. Los experimentos con C difficile deben realizarse bajo condiciones apropiadas de nivel de bioseguridad dos.