Name: El cultivo y mantenimiento Clostridium difficile En un ambiente anaeróbico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-14T21:25:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprende a aislar y cultivar Clostridium difficile en condiciones anaeróbicas para investigación microbiológica. Este método permite preparar reservas de glicerol y esporas para estudios de resistencia antibiótica.

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Nos gustaría dar las gracias a Coy Laboratorios amablemente para proporcionar imágenes de la cámara anaeróbica. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención DK087763 (SMM) y un plan de estudios STEP / HHMI Desarrollo de la Confraternidad (ANE).

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<li>Marler, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+cultural+procedures+for+isolation+of+Clostridium+difficile+from+stools%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools.</a> J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).</li>
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<li>Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of Clostridium difficile.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2(2011).</li>
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<li>Ethapa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+modulate+biofilm+formation+by+the+anaerobic+pathogen+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile.</a> J. Bacteriol. , (2012).</li>
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No hay conflictos de interés declarado.

Los métodos descritos aquí permiten una recuperación rápida y sencilla de C. difficile a partir de una variedad de muestras fecales, incluyendo seres humanos, ratones y hámsteres, así como el almacenamiento a largo plazo de C. difficile como stocks de glicerol o de esporas. C. difficile puede ser un organismo difícil de cultivar, pero cuidado mantenimiento de un ambiente anaerobio y la aplicación de técnicas asépticas puede proporcionar para un crecimiento vigoroso y una reducción en la contam...

Clostridium difficile es una bacteria formadora de esporas Gram-positivo que es un anaerobio obligado y un patógeno gastrointestinal potencialmente fatal de los seres humanos y animales. Inicialmente descrito en 1935 como un organismo comensal encuentra en las muestras de heces de los recién nacidos 1, C. difficile más tarde se demostró que era el agente causante de la colitis pseudomembranosa asociada con el tratamiento antibiótico 2. C. infecciones difficile (CDI) son típicamente precedidas de un tratamiento con antibióticos que resulta en la alteración de la flora normal del colon, creando un nicho para C. difficile prospere 2. C. difficile se transmite como una espora latente a través de la vía fecal-oral y posteriormente germina dentro del tracto gastrointestinal, produciendo células vegetativas capaz de generar varias toxinas y causando la enfermedad grave y la colitis 3. CDI suelen ser refractarios a los tratamientos convencionales y estos eninfecciones son frecuentemente recurrente 4. Como resultado, los CDI son responsables de hasta $ 4.8 mil millones en costos de atención de la salud en los Estados Unidos 5-7. C. difficile es muy sensible a incluso niveles bajos de oxígeno en el medio ambiente. Para C. difficile de persistir en el medio ambiente y se transmite de manera eficiente de un huésped a otro, la formación de una espora metabólicamente inactiva es crítica 8. Debido a que el mantenimiento de laboratorio y la manipulación de C. difficile requiere un ambiente anaeróbico controlado, estas técnicas requieren el uso de una cámara anaeróbica. El uso de cámaras anaeróbicas se ha traducido en un aumento de la recuperación y el aislamiento de anaerobios obligados 9-11, y ha permitido una serie de técnicas moleculares que se deben realizar en un ambiente anaeróbico. Además de C. difficile, el uso cámara anaeróbica y mantenimiento descritos aquí son aplicablesa otros anaerobios obligados, como otras especies clostridiales (por ejemplo, C. perfringens), otras especies gastrointestinales (por ejemplo, especies de Bacteroides 12) y patógenos periodontales (por ejemplo, especies de Peptostreptococcus 13).

<table><tbody><tr><td>Proteose Peptona n.º 2</td><td>BD</td><td>212120</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>BP362</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S27</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (anhidro)</td><td>Fisher</td><td>M65</td><td></td></tr><tr><td>a'...-Fructosa</td><td>Fisher</td><td>L96</td><td></td></tr><tr><td>Taurocolato de sodio</td><td>Sigma</td><td>T4009</td><td></td></tr><tr><td>á'...-cicloserina</td><td>Sigma</td><td>C6880</td><td></td></tr><tr><td>Cefoxitin</td><td>Fluka</td><td>C4786</td><td></td></tr><tr><td>Medio de infusión cerebro-corazón</td><td>BD</td><td>237300</td><td></td></tr><tr><td>Proteose Peptona</td><td>BD 211684</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptone</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>Agar sangre de oveja colombiana</td><td>Fisher</td><td>L21928</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S27</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>BP2291</td><td></td></tr><tr><td>Asas de inoculación estériles</td><td>Fisher</td><td>22363596</td><td></td></tr><tr><td>Hisopos estériles</td><td>Cámara</td><td></td> anaeróbica de vinilo Coy 1495990 <td></td></tr><tr><td>Coy y accesorios</td><td>Coy Laboratory Products, Inc</td><td>Especificado por el cliente</td><td>Estos artículos se ordenan a medida según las necesidades</td></tr><tr> del laboratorio<td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td colspan="4">TCCFA agar Proteose peptona n.º 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhidro) 0,1 g Fructosa 6 g Agar 20 g Llevar a 1 L con agua desionizada y autoclave a 121 & grados; C durante 20 min para esterilizar. Después del autoclave, agregar: 10 ml de taurocolato de sodio al 10% (p/v), esterilizado por filtro (disolver en agua; concentración final, 0,1%) 25 ml de 10 mg/ml á'...-cicloserina, esterilizada por filtro (disolver en agua; concentración final, 250 &mu; g/ml) 1,6 ml de 10 mg/ml de cefoxitina, esterilizada con filtro (disolver en agua; concentración final, 16 &mu; g/ml) BHIS Medium Infusión cerebro-corazón 37 g Extracto de levadura 5 g Para los platos, agregue 15 g de agar. Llevar a 1 L con agua desionizada y autoclave a 121 &deg; C durante 20 minutos para esterilizar. Opcional (agregar después del autoclave): 3 ml de L-cisteína al 10% (p/v) (disolver en agua; concentración final, 0.03%) 10 ml de taurocolato de sodio al 10% (p/v) (disolver en agua; concentración final, 0.1%) SMC Medio de esporulación <br/br/> BactoPeptone 90 g Proteasa peptona 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1,5 g Agar 15 g Llevar a 1 L con agua desionizada y autoclave a 121 & grados; C durante 20 min para esterilizar. Opcional (agregar después del autoclave): 3 ml de L-cisteína al 10% (p/v) (disolver en agua; concentración final, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Peptona proteasa 3,5 g Infusión cerebro-corazón 11,1 g Extracto de levadura 1,5 g (NH4)2SO4 0,7 g Tris base 1,06 g Para los platos, agregue 15 g de agar. Llevar a 1 L con agua desionizada y autoclave a 121 &deg; C durante 20 min para esterilizar. Después de esterilizar en autoclave, agregue 3 ml de L-cisteína al 10% (p/v) (concentración final, 0.03%). Blood agar Se recomienda el uso de placas de agar de sangre de oveja anaeróbica Columbia prefabricadas (Fisher Scientific, L21928)35. 1X Solución salina tamponada con fosfato (PBS) NaCl 8,01 g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,44 g KH2PO4 0,27 g Lleve a 1 L con agua desionizada y ajuste el pH a 7.4 con HCl. Filtro Esterilizar antes de usar.</td></tr></tbody></table>

el cultivo y mantenimiento<em&gt; clostridium difficile</em&gt; en un ambiente anaeróbico

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile es un anaerobio, bacteria Gram-positiva, esporogénica que es el principal responsable de la diarrea asociada a antibióticos (DAA) y es un patógeno nosocomial significativo. C. difficile es notoriamente difícil de aislar y cultivar y es extremadamente sensible a incluso niveles bajos de oxígeno en el medio ambiente. Aquí, métodos para aislar C. difficile a partir de muestras fecales y, posteriormente, el cultivo de C. difficile para la preparación de los stocks de glicerol para el almacenamiento a largo plazo se presentan. También se describen técnicas para la preparación y la enumeración de las existencias de esporas en el laboratorio para una variedad de aplicaciones posteriores, incluyendo estudios de microscopía y animales. Estas técnicas requieren una cámara anaeróbica, que mantiene un ambiente anaeróbico coherente para garantizar condiciones adecuadas para óptima C. crecimiento difficile. Proporcionamos protocolos para la transferencia de materiales dentro y fuera de la cámara sin Cautilizando una contaminación significativa de oxígeno, junto con sugerencias para el mantenimiento regular necesario para mantener el medio ambiente anaeróbico apropiado para una eficiente y consistente C. cultivo difficile.

Un ejemplo de C. difficile crecido en BHIS y Columbia anaeróbica ovejas medios de agar sangre puede ser visto en la Figura 2. C. difficile forma colonias irregulares que son planas y poseen una apariencia de vidrio esmerilado que es evidente en ambos medios. Aquí, un aislado clínico-eritromicina sensible de C. difficile, 630E 30, se cultiva en BHIS de agar, un medio enriquecido, no selectivo, durante 24 horas a 37 ° C (Figura 2A). Las colonias sobre...

Clostridium difficile es una bacteria patógena que es un anaerobio estricto y causa diarrea asociada a antibióticos (DAA). Aquí, métodos para aislar, cultivar y mantener C. se describen las células vegetativas y esporas difficile. Estas técnicas requieren una cámara anaeróbica, que requiere un mantenimiento regular para garantizar las condiciones adecuadas para una óptima C. cultivo difficile.

El cultivo y mantenimiento<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; En un ambiente anaeróbico

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar C. difficile a partir de muestras fecales para cultivar C. difficile, preparar stocks de glicerol para almacenamiento a largo plazo y preparar y enumerar stocks de esporas para diversas aplicaciones posteriores. Esto se logra primero aislado C. difficile a partir de muestras de heces mediante siembra en un medio selectivo. El segundo paso consiste en cultivar C. difficile en medio líquido y mantener stocks a largo plazo de C. difficile en glicerol.A continuación, C difficile se recupera de stocks congelados en glicerol y se siembra por estría en placas de agar. En el último paso, se preparan stocks de esporas de C difficile y se enumeran finalmente siguiendo estos protocolos. C difficile puede cultivarse en diversos medios para verificar y confirmar su identidad, y puede ser cultivado y mantenido con éxito.Estos tallos de glicerol y cultivos pueden utilizarse posteriormente en numerosas aplicaciones experimentales, incluyendo estudios con animales e investigaciones adicionales de biología molecular. La principal ventaja de utilizar una cámara anaeróbica de vinilo para cultivar C difficile frente a otros métodos, como los frascos c

culturing-maintaining-clostridium-difficile-an-anaerobic

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Li, J., et. al., Desarrollo de un modelo de infección de larvas de pez cebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra el aislamiento y cultivo de la bacteria Clostridioides difficile del intestino de las larvas de pez cebra. El intestino infectado se disecciona, homogeneiza e incuba en medios anaeróbicos selectivos que contienen antibióticos. Estas condiciones suprimen los microbios competidores y promueven el crecimiento de células viables.

Aislamiento y cultivo de bacterias Clostridioides difficile a partir de larvas de intestino de pez cebra

Fuente: Anwar, Z., et al. Enriquecimiento y detección de toxinotipos de Clostridium perfringens en muestras de alimentos al por menor. J. Vis. Exp. (2019).En este video, las bacterias reductoras de sulfito se cultivan en un medio de agar que contiene sulfito, donde crecen anaeróbicamente y reducen el sulfito a sulfuro de hidrógeno, formando precipitados negros con iones de hierro. Las colonias negras se aíslan de la profundidad del agar utilizando técnicas asépticas y se transfieren a un medio...

Subcultivo de bacterias anaeróbicas reductoras de sulfito de un cultivo en agar

Este protocolo se describe el modelo de ratón cefoperazona de la infección por Clostridium difficile (CDI), utilizando una cepa clínicamente relevante y genéticamente manejable, R20291. Énfasis en el seguimiento clínico de la enfermedad, C. difficile enumeración bacteriana, la citotoxicidad de la toxina, y los cambios histopatológicos en todo CDI en un modelo de ratón se detalla en el protocolo.

Cefoperazona tratados modelo de ratón clínicamente relevante<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 Strain

La eficacia antibiótica se determina más comúnmente mediante la realización de estudios cinéticos de eliminación y la medición de unidades formadoras de colonias (UFC). Al integrar la microscopía electrónica de barrido (SEM) con estos métodos estándar, podemos distinguir los efectos farmacológicos del tratamiento entre diferentes antibióticos.

Protocolo para Caracterizar los Cambios Morfológicos de<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; En respuesta al tratamiento antibiótico

Como los organismos anaeróbicos obligatorios son incapaces de crecer al exponerse al oxígeno, el uso de técnicas de cultivo anaeróbico es indispensable. Aquí, demostramos un método simple y eficaz para cultivar un cultivo mixto derivado de una planta de biogás desde la preparación de medios hasta la cuantificación de gases y ácidos grasos volátiles.

Preparación media para el cultivo de microorganismos bajo condiciones estrictamente anaeróbicas/anóxicos

El objetivo de este artículo es detallar las mejores prácticas para la fabricación de medios para microorganismos anaeróbicos exigentes adquiridos de un medio ambiente. Estos métodos ayudan a manejar los cultivos anaeróbicos y se pueden aplicar para apoyar el crecimiento de microorganismos no cultivados elusivos, la "materia oscura microbiana".

Un conjunto de formatos de medios simulados informados in situ para el cultivo de microorganismos anaeróbicos adquiridos en el medio ambiente

El protocolo presenta dos metodologías para mejorar el aislamiento de bacterias intestinales anaerobias. El primero se centra en el aislamiento de una amplia gama de bacterias utilizando diferentes medios de cultivo. El segundo se centra en los pasos de cultivo de un grupo microbiano específico, posiblemente asimilando mioinositol, para comprender completamente su significado ecológico.

Estrategias para mejorar el cultivo de bacterias anaeróbicas del tracto gastrointestinal de pollo

Nosotros describimos métodos para el aislamiento / cultura eficiente y rápida de la microglia viable desde la corteza cerebral neonatal y adulto de la médula espinal. La disección y placas de microglia cortical se puede lograr dentro de los 90 minutos, con la cosecha microglial posterior que tiene lugar ~ 10 días después de la disección inicial.

Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos

Se describe aquí un fluorescencia simple en la hibridación in situ (FISH) método para la localización de virus y bacterias en los tejidos de insectos y plantas. Este protocolo se puede ampliar para la visualización de mRNA en todo el montaje y secciones microscópicas.

Fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; Las hibridaciones (FISH) para la localización de los virus y las bacterias endosimbióticas en plantas e insectos tejidos

En este protocolo, describimos métodos para transfectar eficientemente líneas celulares de macrófagos murinos con siRNAs utilizando el sistema de lanzadera Amaxa Nucleofector de 96 pocillos, estimular los macrófagos con lipopolisacáridos y monitorear los efectos sobre la producción de citoquinas inflamatorias.

El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

Aprende a aislar y cultivar Clostridium difficile en condiciones anaeróbicas para investigación microbiológica. Este método permite preparar reservas de glicerol y esporas para estudios de resistencia antibiótica.

El cultivo y mantenimiento

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